成年斑胸草雀HVCX神經(jīng)元電生理特性的側(cè)別和性別差異

李東風, 馮 凱

(華南師范大學 生命科學學院，廣東 廣州 510631)

斑胸草雀是研究語言發(fā)聲的模式動物，其高級發(fā)聲中樞HVC(higher vocal center)與人類大腦中的布洛卡區(qū)同源，是鳴禽腦內(nèi)控制鳴曲學習前端腦通路(anterior forebrain pathway, AFP)和控制鳴曲發(fā)聲運動通路(vocal motor pathway, VMP )的共同起點.HVC核團中的HVCX神經(jīng)元和HVCRA神經(jīng)元通過神經(jīng)投射分別控制AFP通路與VMP通路的X區(qū)與弓狀皮質(zhì)櫟核(robust nucleus of the arcopallium, RA)[1].此外，HVC中還含有一類中間神經(jīng)元HVCINT，在HVC核團內(nèi)部分別對上述兩類神經(jīng)元產(chǎn)生抑制作用[2-4].HVCX神經(jīng)元不僅將聽覺信息傳遞給APF通路，而且APF通路的聽覺應答也受HVCX神經(jīng)元的影響.AFP通路主要參與鳴曲的學習過程，VMP通路主要負責鳴曲的發(fā)聲行為.鳴曲的習得可以幫助斑胸草雀求偶、防御以及維護領(lǐng)地等社會性行為.

成年雄性斑胸草雀擅長鳴唱，而雌性不會鳴唱.在雌性斑胸草雀皮下埋植睪酮后，可顯著增加HVC核團的體積和神經(jīng)元數(shù)量，提示雄激素在鳥類鳴唱系統(tǒng)中發(fā)揮著不可替代的作用[5].此外，本實驗室前期工作表明，損毀左側(cè)HVC核團，對長鳴和鳴曲的頻域和聲強特征都無顯著影響，而損毀右側(cè)HVC后，則會導致鳴曲特征的顯著性改變，包括鳴曲的振幅、平均頻率和峰頻率的顯著性降低等[6].然而雌雄兩性個體的HVCX神經(jīng)元電生理特性差異尚不清晰，且損毀HVC是破壞整個腦區(qū)的功能，并不能反映單個神經(jīng)元電生理特性的側(cè)別差異.因此，基于前期工作的基礎(chǔ)，探究HVC核團神經(jīng)元電生理特性是否具有側(cè)別差異和性別差異為本研究目的.

1 實驗材料與方法

1.1 實驗動物

成年雌雄斑胸草雀(zebra finch,Taeniopygiaguttata)(>90 d).體重9～15 g，購于廣州花地灣花鳥蟲魚市場.

1.2 試劑藥品

人工腦脊液ACSF(mmol/L)：NaCl 125，NaHCO325，NaH2PO4·H2O 1.27，KCl 2.5，MgSO4·7H2O 1.2，CaCl22.0，Glucose 25；切片液(mmol/L)：Sucrose 248，KCl 5，NaHCO328，Glucose 10，MgSO4·7H2O 1.3，NaH2PO4·H2O 1.26；電極內(nèi)液(mmol/L)：KMeSO4120，NaCl 5，HEPES 10，EGTA 2，Mg-ATP 2，Na-GTP 0.3，pH 7.2.

1.3 主要儀器

膜片鉗放大器，MultiClamp 700B(Axon Instrument, USA)；模/數(shù)轉(zhuǎn)換器，DIGIDATA 1440A(Axon Instrument, USA)，正置顯微鏡，BX51WI(Olympus, Japan)，微電極拉制儀，P-97(Sutter Ins, USA)，振動切片機NVSIMI(WPI, USA)，分析天平等.

1.4 腦片制備

10%(質(zhì)量分數(shù))水合氯醛(0.05 mL/g)進行鳥胸大肌注射，待麻醉后快速斷頭取腦,置于切片液的冰水混合物中冷卻30～60 s，用振動切片機在冰水混合的切片液中將大腦進行矢狀切，切取含有HVC核團的250 μm厚的腦片后，將腦片移至溫度為37 ℃且已通混合氣(95%O2+5%CO2)30 min的孵育槽中孵育1 h，之后將溫度調(diào)整為35 ℃，孵育0.5 h后進行膜片鉗實驗.

1.5 膜片鉗全細胞記錄

1.5.1 電極制備及內(nèi)液灌注 用微電極拉制儀將硬質(zhì)玻璃毛坯管(1.5 mm outer diameter, 1.17 mm inner diameter，length 8 cm, Sutter Ins, USA)拉制成微電極.全細胞記錄電極尖端的阻抗為3～6 MΩ.

1.5.2 HVC神經(jīng)元觀察及記錄 在顯微鏡下觀察置于記錄槽內(nèi)的腦片, 尋找合適的HVC神經(jīng)元.在電極接觸神經(jīng)元后對細胞給予負壓進行封接，形成高達GΩ電阻的細胞吸附式，進一步給予負壓進行破膜，形成全細胞記錄模式.在電流鉗模式下記錄HVC投射神經(jīng)元的誘發(fā)電位及閾值和后超極化幅值等各項電生理指標.

1.6 數(shù)據(jù)采集及統(tǒng)計分析

用pClampex 10.3軟件采樣系統(tǒng)獲得信號后，根據(jù)HVC各類神經(jīng)元的發(fā)放特性，將記錄到的神經(jīng)元進行分類.運用Origin 8.0軟件雙尾t-test檢驗方法對記錄到的HVCX神經(jīng)元的電生理特性指標進行統(tǒng)計與分析.統(tǒng)計指標如下：

(1)靜息電位(resting potential，RP)：指細胞膜未受刺激時，存在于細胞膜內(nèi)外兩側(cè)的外正內(nèi)負的電位差.

(2)動作電位潛伏期(evoked action potential latency):誘發(fā)刺激開始至第一個誘發(fā)動作電位起始所經(jīng)歷的時間.

(3)后超極化達峰值時間(AHP time to peak)：動作電位下降相降至閾值時起算，直至AHP達最低點時所經(jīng)歷的時間.

(4)動作電位發(fā)放頻率(spike rate):對500 ms、100 pA刺激下誘發(fā)的動作電位發(fā)放個數(shù)進行比較.

2 實驗結(jié)果

2.1 HVC神經(jīng)元的分類

根據(jù)HVC核團中3類神經(jīng)元不同的發(fā)放特性，將記錄到的神經(jīng)元進行分類[7-8].HVCX神經(jīng)元具有內(nèi)向整流特性，在受到超極化電流刺激時具有明顯的膜電位凹陷(sag)現(xiàn)象.除此之外，在受到持續(xù)地去極化刺激時，發(fā)放頻率較高且存在適應性.中間神經(jīng)元HVCINT具有強烈的自發(fā)放活動，受到超極化刺激時，同樣存在sag現(xiàn)象，且比HVCX神經(jīng)元更明顯.此外，在超極化刺激結(jié)束后有一個反彈放電現(xiàn)象，HVCINT接受持續(xù)去極化刺激時會爆發(fā)一種發(fā)放持續(xù)、規(guī)則的緊張型高頻放電模式.HVCRA神經(jīng)元的靜息電位高于另外兩類神經(jīng)元，受到超極化刺激時不存在sag現(xiàn)象，刺激結(jié)束后也沒有反彈放電現(xiàn)象.受到去極化刺激時，只發(fā)放少數(shù)幾個甚至是單個的動作電位(圖1).研究表明，在鳴禽發(fā)聲或聽到多種鳴聲刺激時，HVCX神經(jīng)元都有相同的發(fā)放模式，顯示出了精確的感覺運動一致性[9].故本實驗以HVCX神經(jīng)元為目標神經(jīng)元，探究HVCX神經(jīng)元的側(cè)別差異和性別差異.本實驗通過觀察在電流鉗下給予神經(jīng)元500 ms、100 pA的去極化刺激和500 ms、-200～0 pA、步階+20 pA的超極化刺激下的發(fā)放特性來鑒定神經(jīng)元類型.

圖1 HVC核團中3類神經(jīng)元發(fā)放特性Fig.1 The firing properties of 3 types of neurons in HVC nucleus

2.2 雌鳥左右腦HVCX神經(jīng)元電生理特性的側(cè)別比較

對雌鳥左右腦HVCX神經(jīng)元施加5 ms、300 pA電流刺激，將記錄到的電生理指標進行統(tǒng)計.結(jié)果顯示，雌鳥右腦的靜息電位值((-61.63±3.77)mV，n=5)顯著低于雌鳥左腦((-66.57±9.51)mV，n=14，P<0.05，圖2B).但是，動作電位潛伏期(圖2C)和后超極化達峰值時間(圖2D)無顯著性差異.

*P<0.05，差異且有顯著性；**P<0.01,差異極顯著圖2 雌鳥左右腦HVCX神經(jīng)元電生理特性比較Fig.2 The lateral comparison of electrophysiological properties in adult female zebra finches

2.3 雄鳥左右腦HVCX神經(jīng)元電生理特性的側(cè)別比較

對雄鳥左右腦HVCX神經(jīng)元施加5 ms、300 pA電流刺激，將記錄到的電生理指標進行統(tǒng)計.結(jié)果顯示，右腦HVCX神經(jīng)元的動作電位潛伏期((2.58±0.37) ms，n=5)低于左腦((3.89±0.48) ms，n=12)，且差異極顯著(P<0.01，圖3C).右腦的后超極化達峰值時間((27.3±7.11) ms，n=5)低于左腦((41.83±6.90) ms，n=6)，且差異極顯著(P<0.01，圖3D).而靜息電位(圖3B)無顯著性差異.說明右腦HVCX神經(jīng)元對傳入信息能夠進行更迅速地整合.HVCX神經(jīng)元發(fā)放頻率通過統(tǒng)計單位時間內(nèi)動作電位發(fā)放個數(shù)來表示.在電流鉗下給予HVCX神經(jīng)元500 ms、100 pA刺激，發(fā)現(xiàn)右腦HVCX神經(jīng)元動作電位發(fā)放頻率較高(圖3F).說明雄鳥右腦HVCX神經(jīng)元的興奮性強于左腦HVCX神經(jīng)元.

*P<0.05，差異且有顯著性；**P<0.01,差異極顯著圖3 雄鳥左右腦HVCX神經(jīng)元電生理特性比較Fig.3 The lateral comparison of electrophysiological properties in adult male zebra finches

2.4 雌雄鳥左腦HVCX神經(jīng)元電生理特性的性別差異

對雌雄鳥左腦HVCX神經(jīng)元施加5 ms、300 pA電流刺激，將記錄到的電生理指標進行統(tǒng)計.結(jié)果顯示，靜息電位(圖4B)、動作電位潛伏期(圖4C)和后超極化達峰值時間(圖4D)均無顯著性差異.

圖4 雌雄鳥左腦HVCX神經(jīng)元電生理特性的性別差異Fig.4 The sexual dimorphism of electrophysiological properties in left brain of adult male and female zebra finches

2.5 雌雄鳥右腦HVCX神經(jīng)元電生理特性的側(cè)別比較

對雌雄鳥右腦HVCX神經(jīng)元施加5 ms、300 pA電流刺激，將記錄到的電生理指標進行統(tǒng)計.雌雄鳥右腦的靜息電位(圖5B)無顯著性差異.雄鳥右腦的動作電位潛伏期((2.58±0.37) ms，n=5)顯著低于雌鳥((3.45±0.56) ms，n=5，P<0.05，圖5C).雄鳥右腦的后超極化達峰值時間((27.3±7.1) ms，n=5)低于雌鳥右腦((50.58±3.53) ms，n=5)，且達到極顯著差異(P<0.01，圖5D).在電流鉗下給予HVCX神經(jīng)元500 ms、100 pA刺激，發(fā)現(xiàn)雄鳥右腦HVCX神經(jīng)元動作電位發(fā)放頻率為((11.1±3.18)個，n=10)顯著高于雌鳥右腦((8.71±1.28)個，n=14，P<0.05，圖5F).

圖5 雌雄鳥右腦HVCX神經(jīng)元電生理特性的性別差異Fig.5 The sexual dimorphism of electrophysiological properties in right brain of adult male and female zebra finches

3 討 論

雄激素對鳴曲的產(chǎn)生和學習有著至關(guān)重要的作用.去勢不僅影響鳴曲的學習，還會影響鳴唱核團的大小.雌鳥埋植雄激素會激發(fā)鳴曲學習，增加神經(jīng)元的數(shù)量和增大鳴唱核團的體積.雖然雌鳥具有鳴唱核團，但因其體內(nèi)缺乏雄激素，故其鳴曲學習受阻，只能鳴叫，而不能鳴唱.雌鳥未進行系統(tǒng)的鳴曲學習，HVC核團并不能發(fā)出指導鳴曲的指令，盡管雌鳥左右腦的靜息電位有顯著性差異，但其他指標并無差異，且動作電位發(fā)放個數(shù)也無差異，說明左右兩側(cè)神經(jīng)元在接受外界刺激或上游信息輸入時做出的反應是一致的.

HVC是鳴禽斑胸草雀發(fā)聲控制通路中的最高級中樞.損毀HVC核團不僅會造成音節(jié)丟失，還會導致鳴曲結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，且均是損毀右側(cè)HVC造成的影響大于損毀左側(cè)HVC造成的影響[10].損毀左側(cè)HVC未對鳴聲造成顯著影響，而損毀右側(cè)HVC不僅對長鳴和鳴曲的頻域特征和聲強特征產(chǎn)生顯著影響，還會造成主題曲中音節(jié)的丟失和主題曲相似度的下降.分別損毀雄鳥左右側(cè)HVC，鳴曲出現(xiàn)去穩(wěn)定化和音節(jié)丟失，主題曲持續(xù)時間丟失和音節(jié)平均間隔時間均顯著增加.但是，損毀左側(cè)HVC對鳴曲的頻域聲強特征無顯著性影響，說明雙側(cè)HVC共同負責鳴曲的時域特征.此外，右側(cè)HVC還負責鳴曲的聲強特征[6].雄鳥右腦爆發(fā)的動作電位延時要低于左腦.動作電位的爆發(fā)與鈉離子通道的開放有關(guān)，當足夠多的鈉離子通道打開后，局部電位就會增加，達到閾值進而爆發(fā)動作電位.而右腦HVCX神經(jīng)元的動作電位延時短，說明在相同時間內(nèi)鈉離子通道開放數(shù)量更多或者相同數(shù)量的鈉離子通道開放更為迅速，使得其在接受刺激后更易爆發(fā)動作電位.雄鳥右腦HVCX神經(jīng)元的后超極化達到峰值時間比左腦低.該指標的一個重要作用就是與動作電位的發(fā)放頻率有關(guān).左腦后超極化達到峰值時間長，限制了其動作電位的發(fā)放.說明雄鳥右側(cè)HVCX神經(jīng)元興奮性高于左側(cè)，提示左右腦HVCX神經(jīng)元在鳴曲學習中發(fā)揮不同的功能，右側(cè)HVCX神經(jīng)元的興奮性可能與聲強特征的右側(cè)優(yōu)勢有關(guān).

雌雄斑胸草雀均會長鳴，但是雌鳥長鳴基頻較低，諧波平坦，而雄鳥長鳴音節(jié)時程比較短且穩(wěn)定，基頻較高，在音節(jié)中段及尾段出現(xiàn)向下的頻率調(diào)制.損毀雄鳥左側(cè)HVC前后的長鳴不存在明顯的改變，而損毀右側(cè)HVC后，長鳴已不具備習得性長鳴的特征，與雌性長鳴和亞鳴期的長鳴類似.雌雄鳥左腦HVCX神經(jīng)元電生理特性并無顯著性差異，雄鳥右腦HVCX神經(jīng)元的興奮性卻高于雄鳥左腦，提示雄鳥右側(cè)HVC可能是習得性長鳴與雌性長鳴和亞鳴期長鳴不同的源頭.

腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)是一種具有神經(jīng)營養(yǎng)作用的蛋白質(zhì).雖然雌雄兩性個體HVC核團中都有腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子受體TrkB表達，但BDNF只存在成年雄性HVC核團，雌性HVC中并未檢測到該因子的存在[11].雌鳥中埋植睪酮可以增加腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子含量，BDNF通過提高神經(jīng)元的存活率增加HVC核團神經(jīng)元數(shù)量和核團體積.雌雄鳥性別差異與體內(nèi)睪酮含量有密不可分的聯(lián)系，雌鳥埋植睪酮不僅可提高神經(jīng)元的存活率，而且還會增加神經(jīng)元胞體之間的間隙連接，提示雄鳥大腦中擁有更復雜的神經(jīng)網(wǎng)絡，雌雄鳥的電生理特性的差異可能與此有關(guān).提示雄鳥右側(cè)HVCX神經(jīng)元比雌鳥具有更高的興奮性，利于信息的接收及其向下游核團的傳遞，有助于鳴曲的學習.

本實驗對雌雄兩性的側(cè)別差異和性別差異進行了研究.雄鳥個體右側(cè)大腦HVCX神經(jīng)元興奮性強于左腦，即存在右側(cè)優(yōu)勢，提示雙側(cè)HVC核團除具備共同的鳴曲學習功能外，右側(cè)HVC在鳴曲學習中還發(fā)揮其他的作用.雌雄右腦存在性別差異且雄鳥HVCX神經(jīng)元興奮性強于雌鳥，雄鳥HVCX神經(jīng)元能更精準地接收聽覺信息以及能將聽覺信息有效地進一步傳輸給下游核團X區(qū)，增強AFP通路信息傳遞能力，從而指導鳴曲的學習.