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      乳腺癌中SLC5A8基因的甲基化及轉(zhuǎn)錄水平

      2020-03-23 10:55:06劉雅涵謝天皓孟慶旭靳小石2
      醫(yī)學(xué)研究與教育 2020年1期
      關(guān)鍵詞:凝膠電泳癌基因甲基化

      劉雅涵 謝天皓 孟慶旭 靳小石2

      (1.河北大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院,河北 保定 071000;2.河北省普通外科數(shù)字醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河北 保定 071000;3.河北大學(xué)附屬醫(yī)院,河北 保定 071000)

      根據(jù)2019年1月份國(guó)家癌癥中心發(fā)布的最新全國(guó)癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù),目前惡性腫瘤發(fā)病率最高的為肺癌,其次為乳腺癌,而女性發(fā)病率最高的為乳腺癌,死亡率在女性占到第5位[1]。在這樣的背景下,乳腺癌的關(guān)注和研究顯得極為重要。基因的改變?cè)谌橄侔┲杏兄匾淖饔?。SLC5A8基因自2002年被Rodriguez等[2]發(fā)現(xiàn)以來(lái),有越來(lái)越多的學(xué)者研究該基因在惡性腫瘤中的作用。發(fā)現(xiàn)基因表達(dá)沉默這一現(xiàn)象在腦膠質(zhì)瘤、結(jié)腸癌、甲狀腺癌、胰腺癌、肺癌、宮頸癌中普遍存在[3-6]。隨著對(duì)SLC5A8基因研究的深入,發(fā)現(xiàn)在結(jié)直腸癌、甲狀腺癌、肺癌、胃癌、食管癌等惡性腫瘤的發(fā)生中存在著基因的表觀遺傳學(xué)改變現(xiàn)象,比如抑癌基因的甲基化,從而抑制了抑癌基因的表達(dá)。SLC5A8基因作為目前的候選抑癌基因,是溶質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)體家族第5家族第8成員。目前鮮有對(duì)于抑癌基因SLC5A8在乳腺癌中的作用機(jī)制及與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系方面的研究。本研究通過(guò)對(duì)乳腺癌及其癌旁組織中SLC5A8基因甲基化及SLC5A8轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平的實(shí)驗(yàn)性研究,以明確SLC5A8基因在乳腺癌中的表達(dá)情況,進(jìn)一步探究其作用機(jī)制,為后一步的基因治療和預(yù)后評(píng)估奠定實(shí)驗(yàn)理論基礎(chǔ)。

      1 材料與方法

      1.1 材料

      2017年5月至2019年12月收集河北大學(xué)附屬醫(yī)院基本外科行乳腺癌改良根治術(shù)的32例乳腺癌患者標(biāo)本,將腫瘤標(biāo)本及癌旁正常組織標(biāo)本分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組?;颊咝g(shù)前未行任何治療,術(shù)后病理回示為惡性,所有患者均為女性,年齡42~56歲,平均為(49.00±5.23)歲。

      Omega E.Z.N.A.TM總RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)試劑盒、組織DNA提取試劑盒、瓊脂糖、氯仿、無(wú)水乙醇、5×RNA loading buffer、微量高速冷凍離心機(jī)、全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀、全自動(dòng)凝膠成像儀、實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀、實(shí)驗(yàn)所用引物由上海英濰捷貿(mào)易有限公司提供,引物序列見(jiàn)表1。

      表1 基因引物序列及擴(kuò)增片段

      1.2 實(shí)驗(yàn)方法

      1.2.1 SLC5A8基因甲基化檢測(cè)

      采用甲基化特異性PCR法檢測(cè),按照DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟提取樣本組織DNA并修飾,將對(duì)應(yīng)引物進(jìn)行亞硫酸氫鹽修飾DNA樣本的PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件:50 ℃ 2 min;95 ℃中預(yù)變性2 min;95 ℃中15 s;60 ℃中30 s,如此40次循環(huán)。最后對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳照相。

      1.2.2 SLC5A8基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)檢測(cè)

      運(yùn)用RT-PCR法檢測(cè)SLC5A8基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。實(shí)驗(yàn)按照RNA提取試劑盒說(shuō)明提取總RNA,對(duì)RNA總量進(jìn)行定量配平后對(duì)其行反轉(zhuǎn)錄。檢測(cè)引物序列特異性后,分別用以上2對(duì)引物行RT-PCR。PCR反應(yīng)條件:50 ℃ 2 min;95 ℃預(yù)變性2 min;95 ℃ 15 s;60 ℃ 30 s,如此40次循環(huán)后,對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳照相。

      1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

      2 結(jié)果

      2.1 乳腺癌和乳腺癌旁正常組織SLC5A8基因甲基化檢測(cè)

      在乳腺癌組織中SLC5A8基因發(fā)生甲基化20例(62.50%),而在乳腺癌旁正常組織的基因發(fā)生甲基化7例(21.87%)。癌旁正常組織的基因發(fā)生甲基化的概率相較癌組織的基因甲基化的概率降低,2組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)表2。

      表2 乳腺癌及癌旁組織SLC5A8基因甲基化檢測(cè)

      2.2 乳腺癌及癌旁組織SLC5A8基因擴(kuò)增后凝膠電泳結(jié)果

      乳腺癌及乳腺癌旁組織的SLC5A8基因RT-PCR結(jié)果的凝膠電泳如圖1,32例乳腺癌組織中SLC5A8基因明顯過(guò)表達(dá)占43.75%(14/32),而乳腺癌旁正常組織該基因71.25% (26/32)出現(xiàn)過(guò)表達(dá)現(xiàn)象,提示癌組織中SLC5A8基因的過(guò)表達(dá)水平明顯低于乳腺癌癌旁正常組織水平,2組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)表3。

      圖1 SLC5A8基因擴(kuò)增后凝膠電泳

      表3 乳腺癌及癌旁組織SLC5A8基因過(guò)表達(dá)檢測(cè)

      2.3 乳腺癌組織SLC5A8基因甲基化與轉(zhuǎn)錄表達(dá)

      在32例乳腺癌組織中,SLC5A8基因甲基化陽(yáng)性的有20例標(biāo)本,基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)者6例(30.00%);基因未轉(zhuǎn)錄表達(dá)者14例(70.00%)。癌組織中基因甲基化陰性有12例標(biāo)本,基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)者7例(58.33%);基因未轉(zhuǎn)錄表達(dá)者5例(41.66%)。無(wú)序變量相關(guān)性分析顯示,乳腺癌組織中SLC5A8基因甲基化和SLC5A8基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)兩者一致性較差,反而具有一定的反向一致性,這也驗(yàn)證了乳腺癌組織SLC5A8基因甲基化與基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)不是完全一致的,癌組織基因甲基化陽(yáng)性標(biāo)本的基因轉(zhuǎn)錄水平相對(duì)較低,并且要弱于基因甲基化陰性標(biāo)本的基因轉(zhuǎn)錄水平,故2組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)表4。

      表4 乳腺癌SLC5A8基因甲基化與基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)關(guān)系

      3 討論

      自2002年Rodriguez等[2]發(fā)現(xiàn)SLC5A8基因以來(lái),很多學(xué)者發(fā)現(xiàn)基因表達(dá)沉默這一現(xiàn)象在腦膠質(zhì)瘤、結(jié)腸癌、甲狀腺癌等惡性腫瘤中普遍存在[3-6]。進(jìn)一步揭示了SLC5A8基因表達(dá)下降的機(jī)制主要與該基因外顯子1中CPG島廣泛甲基化有關(guān)[7]。進(jìn)一步研究得出,SLC5A8基因與染色體組蛋白脫乙?;钢饕ㄟ^(guò)丁酸相關(guān)聯(lián)[8]。在結(jié)腸腸腔中的細(xì)菌經(jīng)過(guò)一定作用將膳食纖維分解成丁酸,使其濃度升高。結(jié)腸上皮細(xì)胞的SLC5A8基因表達(dá)增高,SLC5A8基因可以將丁酸轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞內(nèi),同時(shí)他作為組蛋白脫乙?;敢种苿?,在上皮細(xì)胞的癌前病變方面可以預(yù)防的同時(shí)還對(duì)腫瘤細(xì)胞的凋亡有促進(jìn)作用[9-12]。SLC5A8基因在其他臟器中預(yù)防細(xì)胞發(fā)生癌變則主要是通過(guò)與抗凋亡蛋白相互作用實(shí)現(xiàn)的[13]。二氯乙酸也是該基因轉(zhuǎn)運(yùn)體的作用底物中的一個(gè),聯(lián)合應(yīng)用5雜氮胞苷,同樣具有明顯促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用[14]。SLC5A8基因廣泛表達(dá)于人體的各個(gè)組織器官,屬于候選抑癌基因,對(duì)細(xì)胞有保護(hù)作用。腫瘤在發(fā)生發(fā)展過(guò)程中選擇性地使SLC5A8基因表達(dá)下降,維持自身增殖狀態(tài),是最終避開(kāi)凋亡的重要機(jī)制。如果SLC5A8基因的表觀遺傳學(xué)變化是乳腺癌組織發(fā)生、發(fā)展的重要機(jī)制,這將在未來(lái)對(duì)乳腺癌的分子生物學(xué)治療具有重要意義。對(duì)乳腺癌中SLC5A8基因的甲基化及轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行研究,以期發(fā)現(xiàn)SLC5A8基因甲基化和基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平降低與乳腺癌關(guān)聯(lián)性,研究發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組的甲基化陽(yáng)性率顯著高于對(duì)照組甲基化陽(yáng)性率(P<0.05)。實(shí)驗(yàn)組中甲基化陽(yáng)性的癌組織基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)率較甲基化陰性的癌組織基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)率顯著降低(P<0.05),癌組織SLC5A8基因甲基化與基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)不是完全一致的,癌組織基因甲基化陽(yáng)性標(biāo)本的基因轉(zhuǎn)錄水平相對(duì)較低,并且要弱于基因甲基化陰性標(biāo)本的基因轉(zhuǎn)錄水平,進(jìn)一步表明在乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展中可能不止存在表觀遺傳學(xué)現(xiàn)象,還存在其他事件。上述結(jié)果和概括得出SLC5A8基因的甲基化是乳腺癌中普遍存在的一種現(xiàn)象,并可能是乳腺癌演變過(guò)程的重要一步,并且是SLC5A8基因轉(zhuǎn)錄水平降低的主要因素。這為進(jìn)一步研究SLC5A8基因的表觀遺傳學(xué)變化在乳腺癌發(fā)生、發(fā)展中的作用機(jī)制提供了重要依據(jù),并且對(duì)乳腺癌的分子生物學(xué)治療提供可靠證據(jù)。

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