靈芝菌絲體總?cè)瞥曒o助提取工藝優(yōu)化

劉奇，彭浩，2，*，喬偉，鄧百萬，2，趙航柯，曹丹

（1.陜西理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，陜西漢中723000；2.陜西省食藥用菌工程技術(shù)研究中心，陜西漢中723000）

靈芝屬（Ganoderma）真菌屬于擔(dān)子菌門（Basidiomycota），傘菌綱（Agaricomycetes），多孔菌目（Polyporales），靈芝科（Ganodermataceae）。靈芝是常用中藥材之一，首次記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，并歸其為“上品”[1]。世界上靈芝科的種類主要分布在亞洲、澳洲、非洲及美洲的熱帶及亞熱帶，少數(shù)分布于溫帶[2]。而我國(guó)靈芝主要分布于陜西、河北、山西、廣西、云南、貴州等地區(qū)[3]。靈芝具抗氧化、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、降血糖、降血脂以及保肝護(hù)肝等多種藥理作用[4]。

靈芝三萜類化合物作為靈芝的關(guān)鍵藥效成分之一，現(xiàn)代藥理研究證明，三萜類化合物具有抗氧化、保肝護(hù)肝、增強(qiáng)免疫、抗腫瘤、降血脂血糖、防治心血管疾病、緩解哮喘、抗人類免疫缺陷Ⅰ型病毒及HIV-1 蛋白酶活性、抑制組胺釋放、抑制血小板聚集和防治癲癇等作用[1，5-6]。

現(xiàn)階段獲取靈芝三萜材料的方法大多是從人工栽培的子實(shí)體中，人工栽培子實(shí)體耗時(shí)費(fèi)力，成本高，受環(huán)境因素的制約，產(chǎn)品的質(zhì)量也難以得到保證。為了進(jìn)一步完善靈芝三萜的提取效果，降低其提取過程中不穩(wěn)定性，從靈芝菌絲體中提取靈芝三萜的工藝優(yōu)化和分離技術(shù)研究具有重要意義。目前提取三萜的方法有：傳統(tǒng)熱提取[7]、索氏提取[8-9]、微波輔助提取[10-11]、超臨界萃取[12]、超聲波輔助提取[13-14]和微波-超聲波協(xié)同提取[15]等，超聲波輔助技術(shù)作為新興的提取方法，其操作簡(jiǎn)便，節(jié)省時(shí)間，廣泛受到研究者的青睞。

近年來，優(yōu)化多糖、三萜物質(zhì)提取工藝方面利用正交和響應(yīng)曲面法效果良好，正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)是一種高效率、快速、經(jīng)濟(jì)的試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法[16]，但它不能在給出的整個(gè)區(qū)域上找到因素和響應(yīng)值之間的一個(gè)明確的函數(shù)表達(dá)式即回歸方程，從而無法找到整個(gè)區(qū)域上因素的最佳組合和響應(yīng)值的最優(yōu)值；響應(yīng)曲面法中，Box-Behnken 試驗(yàn)是一種有效、實(shí)用的方法，分析其各因素的最佳提取條件[17]。為了避免在試驗(yàn)中選擇優(yōu)化方法的隨意性和盲目性，高效的尋找出最優(yōu)的提取條件[18]。本試驗(yàn)采用正交試驗(yàn)和Box-Behnken 試驗(yàn)響應(yīng)曲面法對(duì)靈芝菌絲體三萜超聲輔助提取，顯著提高了靈芝三萜的提取率，可為靈芝菌絲體中三萜的開發(fā)及其利用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

靈芝：陜西省食藥用菌工程技術(shù)研究中心；齊墩果酸：上海源葉生物科技有限公司；無水乙醇、乙酸乙酯：天津市富宇精細(xì)化工有限公司；冰醋酸：天津市北聯(lián)精細(xì)化學(xué)品開發(fā)有限公司；香草醛：天津市福晨化學(xué)試劑廠；高氯酸：天津市鑫源化工有限公司。以上試劑均為分析純。

723N 型可見分光光度計(jì)：上海精密科學(xué)儀器有限公司制造；LRH-250-GS 數(shù)顯式恒溫培養(yǎng)箱：廣東省醫(yī)療器械廠；SW-CJ-1F 超凈工作臺(tái)：蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；ZHWY-210 2C：上海志成有限公司；SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵：鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；KQ5200DE 型數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；DZKW-D-2 電熱恒溫水浴鍋：北京市光明醫(yī)療儀器有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 靈芝菌絲體的培養(yǎng)

母種培養(yǎng)基：馬鈴薯（去皮）200 g，葡萄糖20 g，瓊脂 18 g，水 1 L，pH 值自然。

液體培養(yǎng)基：馬鈴薯（去皮）200 g，葡萄糖20 g，蛋白胨 5 g，磷酸二氫鉀 3 g，硫酸鎂 1.5 g，瓊脂 18 g，水1 L，pH 值自然。

500 mL 三角瓶裝液體培養(yǎng)基200 mL，接種1 塊1 cm2菌塊，使菌絲一面向上懸浮。置于恒溫?fù)u床內(nèi)培養(yǎng)9 d，26 ℃、120 r/min 振蕩，取發(fā)酵后的發(fā)酵液經(jīng)真空泵抽濾的菌絲球，經(jīng)蒸餾水洗滌3 次，棄去濾液，60 ℃烘干，研磨，備用。

1.2.2 試驗(yàn)材料預(yù)處理

取菌絲體粉末0.1 g，精密稱定，置三角瓶中，加75 %乙醇5 mL 浸泡1.5 h，超聲處理（功率100 W，頻率 42 kHz，溫度 70 ℃）30 min，濾過，濾液置 100 mL 量瓶中，用適量乙醇，分次洗滌濾器和濾渣，洗液并入同一量瓶中，加乙醇至刻度，搖勻，即得。

1.2.3 靈芝三萜含量的測(cè)定

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：取齊墩果酸1 mg，精密稱定，加5 mL 乙醇，為對(duì)照品溶液。精密量取對(duì)照品溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL，分別置 15 mL 試管中，70 ℃揮干，放冷，精密加入新配置的香草醛冰醋酸溶液（精密稱取香草醛0.5 g，加冰醋酸使溶解成10 mL，即得）0.2 mL，高氯酸0.8 mL，搖勻，在70 ℃水浴中加熱15 min，立即置冰水中冷卻5 min，取出，精密加入乙酸乙酯4 mL，搖勻，以相應(yīng)試劑為空白，照紫外-可見分光光度法，在546 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以吸光度A 為縱坐標(biāo)、齊墩果酸濃度C（mL/μg）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程為：A = 0.008 7C + 0.013 7，R2=0.999 2。

測(cè)定方法：精密量取供試品溶液0.2 mL，置15 mL試管中，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線制作中“揮干”后步驟測(cè)定吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出齊墩果酸的含量，計(jì)算，即得。樣品總?cè)频寐拾聪铝泄接?jì)算：

式中：m 為樣品質(zhì)量，mg；V 為吸取的濾液，mL；Y為靈芝三萜的含量，μg。

1.2.4 單因素試驗(yàn)

1）超聲功率對(duì)靈芝菌絲體三萜提取率的影響：精準(zhǔn)稱取靈芝菌絲體粉末0.1 g，超聲功率分別為60、70、80、90、100 W，超聲時(shí)間 30 min，pH 值自然，超聲溫度70 ℃，料液比 1 ∶50（g/mL），考察超聲功率對(duì)靈芝菌絲體三萜提取率的影響。

2）超聲時(shí)間對(duì)靈芝菌絲體三萜提取率的影響：精準(zhǔn)稱取靈芝菌絲體粉末0.1 g，超聲時(shí)間分別為10、20、30、40、50 min，超聲功率 90 W，超聲溫度 70 ℃，料液比1 ∶50（g/mL），pH 值自然，考察超聲時(shí)間對(duì)靈芝菌絲體三萜提取率的影響。

3）pH 值對(duì)靈芝菌絲體三萜提取率的影響：精準(zhǔn)稱取靈芝菌絲體粉末0.1 g，分別用0.1 mol/L HCl 溶液和0.1 mol/L NaOH 溶液進(jìn)行酸堿調(diào)定，pH 值分別為5、6、7、8、9，超聲時(shí)間 40 min，超聲功率 90 W，超聲溫度70 ℃，料液比 1 ∶50（g/mL），考察 pH 對(duì)靈芝菌絲體三萜提取率的影響。

4）料液比對(duì)靈芝菌絲體三萜提取率的影響：精準(zhǔn)稱取靈芝菌絲體粉末 0.1 g，料液比分別為 1 ∶10、1 ∶20、1 ∶30、1 ∶40、1 ∶50（g/mL），超聲時(shí)間 40 min，pH8，超聲功率90 W，考察料液比對(duì)靈芝菌絲體三萜提取率的影響。

1.2.5 正交優(yōu)化試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，確定超聲功率（A）、超聲時(shí)間（B）、pH 值（C）、料液比（D）4 個(gè)因素作為影響靈芝菌絲體三萜提取率的工藝條件，設(shè)計(jì)四因素三水平的正交試驗(yàn)，采用L9（34）表安排試驗(yàn)，見表1。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 Orthogonal test factor level table

1.2.6 響應(yīng)面法試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)Box-Behnken 試驗(yàn)原理，依據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，超聲時(shí)間（A）、pH 值（B）、超聲功率（C）、料液比（D）作為考察變量，靈芝三萜提取率為響應(yīng)值，以-1，0，1分別代表變量水平，建立數(shù)學(xué)模型。具體各因素水平見表2，采用Design Expert 8.0.6 軟件進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平表Table 2 Response surface test factor level table

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 超聲功率對(duì)靈芝菌絲體三萜提取率的影響

超聲功率對(duì)靈芝菌絲體三萜提取率的影響見圖1。

圖1 超聲功率對(duì)靈芝菌絲體三萜提取率的影響Fig.1 Effect of ultrasound power on extraction rate of triterpenoids from Ganoderma lucidum mycelium

圖1 表明，隨著超聲功率的逐漸增大，靈芝菌絲體三萜提取率呈上升趨向；當(dāng)超聲功率在90 W 時(shí)，靈芝菌絲體三萜提取率此時(shí)為較大，達(dá)0.718%，當(dāng)超聲功率為100 W 時(shí)，增長(zhǎng)率降低，綜合考慮到試驗(yàn)成本，因此，提取靈芝菌絲體三萜的最佳超聲功率為90 W。超聲功率過小，靈芝菌絲體細(xì)胞壁不完全破碎，三萜提取率較低；超聲功率過大，溶液分子運(yùn)動(dòng)加快，破壞三萜結(jié)構(gòu)。

2.1.2 超聲時(shí)間對(duì)靈芝菌絲體三萜提取率的影響

超聲時(shí)間對(duì)靈芝菌絲體三萜提取率的影響見圖2。

由圖2 可知，隨著超聲時(shí)間的逐漸增加，靈芝菌絲體三萜提取率呈上升趨勢(shì)；當(dāng)超聲時(shí)間在40 min 時(shí)，靈芝菌絲體三萜提取率此時(shí)為最大，達(dá)到0.671%；之后隨著超聲時(shí)間的增大靈芝菌絲體三萜提取率無明顯變化，可能細(xì)胞內(nèi)外濃度達(dá)到平衡。因此，提取靈芝菌絲體三萜的最佳超聲時(shí)間為40 min。

圖2 超聲時(shí)間對(duì)靈芝菌絲體三萜提取率的影響Fig.2 Effect of ultrasound time on extraction rate of triterpenoids from Ganoderma lucidum mycelium

2.1.3 pH 值對(duì)靈芝菌絲體三萜提取率的影響

pH 值對(duì)靈芝菌絲體三萜提取率的影響見圖3。

圖3 pH 值對(duì)靈芝菌絲體三萜提取率的影響Fig.3 Effect of pH value on extraction rate of triterpenoids from Ganoderma lucidum mycelium

圖3 表明，隨著pH 值的逐漸增加，靈芝菌絲體三萜提取率呈上升趨向；當(dāng)pH 值在8 時(shí)，靈芝菌絲體三萜提取率此時(shí)為最大，達(dá)0.759%；之后隨著pH 值的增大靈芝菌絲體三萜提取率反而減小。靈芝三萜是一類具有酸性性質(zhì)的四環(huán)三萜或者五環(huán)三萜，在堿性環(huán)境下可能使靈芝三萜結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。因此，提取靈芝菌絲體三萜的最佳pH 值為8。

2.1.4 料液比對(duì)靈芝菌絲體三萜提取率的影響

料液比對(duì)靈芝菌絲體三萜提取率的影響見圖4。

圖4 表明，隨著溶劑體積增加，靈芝菌絲體三萜提取率逐漸增大，當(dāng)料液比在1 ∶30（g/mL）時(shí)，靈芝菌絲體三萜提取率為最大，達(dá)0.736%；之后隨著溶劑體積的增大靈芝菌絲體三萜提取率反而減少。因此，提取靈芝菌絲體三萜的最佳料液比為1 ∶30（g/mL）。溶劑量少，不利于超聲空化作用和在溶劑中傳播速度，因此三萜提取率降低；溶劑體積增加影響了機(jī)械學(xué)和熱力學(xué)作用。

圖4 料液比對(duì)靈芝菌絲體三萜提取率的影響Fig.4 Effect of liquid-liquid ratio on the extraction rate of Ganoderma lucidum mycelium

2.2 超聲輔助提取靈芝菌絲體正交試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以超聲功率（A）、超聲時(shí)間（B）、pH 值（C）、料液比（D）為變量，以靈芝菌絲體三萜為指標(biāo)，進(jìn)行正交試驗(yàn)，結(jié)果見表3。

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Orthogonal test results

表3 結(jié)果表明，從極差分析R 的大小可以看出，以靈芝菌絲體三萜提取率為指標(biāo)時(shí)，C＞A＞D＞B，即對(duì)靈芝菌絲體三萜提取率影響最大的pH 值，其次是超聲功率和料液比，影響最小的超聲時(shí)間，篩選出最佳的工藝處方A2B3C2D3，即靈芝菌絲體三萜提取率最佳的工藝為：超聲功率90 W、超聲時(shí)間50 min、pH 8、料液比 1 ∶40（g/mL）。

2.3 正交試驗(yàn)最佳工藝及驗(yàn)證試驗(yàn)

取上述最佳工藝（超聲功率90 W、超聲時(shí)間50 min、pH 8、料液比 1 ∶40（g/mL）提取靈芝菌絲體三萜，試驗(yàn)重復(fù)5 次，結(jié)果見表4。

表4 最佳試驗(yàn)驗(yàn)證Table 4 Optimum test verification

由表4 結(jié)果表明，利用正交試驗(yàn)得出靈芝菌絲體三萜提取率穩(wěn)定性較好、操作方便、提取率較高、提取工藝合理。

2.4 超聲輔助提取靈芝菌絲體三萜Box-Behnken試驗(yàn)結(jié)果

按照表2 中因素水平，利用Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行4 因素3 水平Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)通過單因素試驗(yàn)，得出試驗(yàn)結(jié)果見表5。

表5 Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果Table 5 Box-Behnken design and result

續(xù)表5 Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果Continue table 5 Box-Behnken design and result

2.5 回歸模型有效性以及顯著性分析

通過表5 中的試驗(yàn)結(jié)果，在借助Design-Expert 8.0.6 軟件分析處理，得到二次模型回歸統(tǒng)計(jì)分析表，見表6。

表6 回歸分析Table 6 Results of regression analysis

經(jīng)Design-Expert 8.0.6 軟件對(duì)29 個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)的靈芝菌絲體三萜提取率進(jìn)行回歸統(tǒng)計(jì)分析，靈芝菌絲體三萜提取率的擬合回歸方程：

Y=1.09+0.070A+0.076B+0.076C+0.082D+5.000×10-3AB+0.050AC+0.015AD+2.500×10-3BC+0.025BD-0.010CD-0.17A2-0.17B2-0.19C2-0.18D2

從表5 結(jié)果分析得出，A、B、C、D、AC、A2、B2、C2、D2、這9 項(xiàng)為差異極顯著；BD 這項(xiàng)為差異顯著；AB、AD、BC、CD 這3 項(xiàng)為差異不顯著。由于模型F=108.27（P＜0.000 1）而且極顯著，其可信度大于99.99%，則試驗(yàn)有價(jià)值、有意義。由顯著性檢驗(yàn)中決定系數(shù)R2=0.990 8 以及校正系=0.981 7 得知，該模型中的實(shí)際值與預(yù)測(cè)值具有較高相關(guān)性，并且能夠很明顯地反映出各個(gè)主要因素對(duì)靈芝菌絲體三萜提取率的影響。在表5 中失擬項(xiàng)P 值為0.543 5＞0.05，失擬項(xiàng)差異不顯著，得出試驗(yàn)操作可信度，C.V=2.88%，說明該模型變異小，擬合較好。

通過以上結(jié)果均顯示，使用該模型、方程代替真實(shí)的試驗(yàn)點(diǎn)，進(jìn)行結(jié)果分析與預(yù)測(cè)是可行的，試驗(yàn)理論可進(jìn)行。

2.6 響應(yīng)曲面分析

根據(jù)回歸方程繪制靈芝菌絲體三萜提取率隨各因素變化的響應(yīng)曲面圖，見圖5。圖中反映所考察的4個(gè)因素（超聲功率、超聲時(shí)間、pH 值、料液比）。其中兩個(gè)因素取0 水平時(shí)，另外兩個(gè)交互作用分析。

圖5 超聲功率、超聲時(shí)間、pH 值和料液比兩兩交互的響應(yīng)曲面圖和等高線圖Fig.5 Response surface and contour plots for ultrasonic power，ultrasonic time，pH value and feed-to-liquid ratio

響應(yīng)面圖可以綜合反映各因素對(duì)響應(yīng)值的影響、因素與因素之間的交互作用。響應(yīng)曲面坡度的平緩與陡峭程度，表明處理?xiàng)l件變化對(duì)響應(yīng)值影響大小[14]。等高線的形狀反映交互效應(yīng)的強(qiáng)弱大小，圓形表示兩因素交互作用不顯著，而橢圓形則表示兩因素交互作用顯著[19]。綜合分析，三維響應(yīng)面圖均為向下凹的曲線，這表明靈芝菌絲體三萜提取率有最大值。

2.7 響應(yīng)面最佳工藝及驗(yàn)證試驗(yàn)

靈芝菌絲體三萜提取率通過回歸模型獲得影響各因素最值分別為：超聲功率92.55 W、超聲時(shí)間42.61 min、pH 8.27、料液比 1 ∶32.62（g/mL），得到了靈芝菌絲體三萜提取率的最大預(yù)測(cè)值為1.13%，考慮實(shí)際條件，確定最佳工藝條件：超聲功率90 W、超聲時(shí)間42 min、pH 8、料液比 1 ∶30（g/mL），利用上述各因素最優(yōu)值進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，試驗(yàn)重復(fù)5 次，結(jié)果見表7。

表7 最佳試驗(yàn)驗(yàn)證Table 7 Optimum test verification

續(xù)表7 最佳試驗(yàn)驗(yàn)證Continue table 7 Optimum test verification

由表7 結(jié)果表明，獲得驗(yàn)證靈芝菌絲體三萜平均提取率為1.09%，實(shí)際驗(yàn)證值與理論預(yù)測(cè)值結(jié)果非常接近，提取率高，工藝合理。因此，用上述最佳提取工藝是可行有效的。

3 結(jié)論

采用超聲輔助提取靈芝菌絲體三萜，試驗(yàn)在單因素基礎(chǔ)之上，通過正交試驗(yàn)得到優(yōu)化最佳工藝：超聲功率 90 W、超聲時(shí)間 50 min、pH 8、料液比 1 ∶40（g/mL），利用最佳工藝條件下，得到平均靈芝菌絲體三萜提取率0.76%；Box-Behnken 響應(yīng)曲面試驗(yàn)得到優(yōu)化最佳工藝為：超聲功率90 W、超聲時(shí)間42 min、pH 8、料液比1 ∶30（g/mL）。利用最佳工藝條件下，得到靈芝菌絲體三萜平均提取率為1.09%。

這兩種方法用于優(yōu)化超聲輔助提取靈芝菌絲體三萜的結(jié)果得出，正交試驗(yàn)法可以綜合全面試驗(yàn)，快速簡(jiǎn)單易操作，試驗(yàn)次數(shù)少，根據(jù)結(jié)果選出重要影響因素，進(jìn)而優(yōu)化試驗(yàn)條件[20]。但無法對(duì)各因素效應(yīng)及交互作用做出分析，并且模型是二維線性模型，因此會(huì)與實(shí)際情況有偏差。而響應(yīng)面法可以在整個(gè)試驗(yàn)中找出影響因素與響應(yīng)值之間的關(guān)系，進(jìn)一步優(yōu)化，雖然試驗(yàn)次數(shù)多，但能準(zhǔn)確找出合適條件，試驗(yàn)準(zhǔn)確度高。

綜合比較兩者，響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化靈芝菌絲體三萜提取率工藝明顯高于正交試驗(yàn)優(yōu)化靈芝菌絲體三萜提取工藝，而且響應(yīng)面分析法是一種包括試驗(yàn)設(shè)計(jì)、建立模型、分析模型合理性和尋求最優(yōu)解等眾多試驗(yàn)的統(tǒng)計(jì)技術(shù)，因此采用Box-Behnken 響應(yīng)曲面試驗(yàn)優(yōu)化靈芝菌絲體三萜提取率工藝，提取工藝參數(shù)準(zhǔn)確可靠，具有推廣價(jià)值。