金花茶花多酚氧化酶提取工藝研究

劉暢，吳雪輝，陳嘉慧

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東廣州510642）

金花茶（Camellia nitidissima Chi）為山茶科，山茶屬，金花茶組植物，是中國的珍貴茶種，擁有“茶族皇后”、“植物界大熊貓”等美譽(yù)[1-2]。金花茶的主產(chǎn)地在我國廣西，目前云南、廣東、貴州等地區(qū)也有分布。許多研究表明，金花茶的花、莖、葉都有充分利用的價(jià)值，金花茶是唯一帶有金黃色花瓣的茶花品種，花瓣呈蠟質(zhì)，富含可溶性糖、多酚、黃酮等多種生物活性成分以及微量元素，擁有降血糖、降血壓、抗腫瘤和提高機(jī)體免疫力等多種功效作用，具有極高的觀賞價(jià)值、經(jīng)濟(jì)價(jià)值和極大的市場開發(fā)潛力，受到了廣泛地關(guān)注[1-8]。

國內(nèi)外對金花茶的研究主要集中于金花茶的遺傳多樣性、功能活性成分的分離純化、結(jié)構(gòu)分析以及新產(chǎn)品的開發(fā)利用。目前已上市的金花茶產(chǎn)品主要分為3 類包括茶飲料、保健品以及化妝品，其中茶飲料以金花茶葉為主，而金花茶花的產(chǎn)品較為稀少[9-14]。金花茶花的產(chǎn)品主要是花朵茶和花蕾茶，需要進(jìn)行一定的加工、干燥而成，在加工過程中如何保持花的顏色和形態(tài)尤為關(guān)鍵[4]。

研究表明，多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）是造成果蔬和植物褐變的主要酶類，PPO 活性與褐變程度一般呈顯著相關(guān)性[15-18]。前期試驗(yàn)結(jié)果表明，以PPO 為主的酶促褐變是金花茶花加工過程中顏色變化的主要原因。為深入探究金花茶花PPO 活性與褐變的相關(guān)性、尋求抑制褐變的方法，對金花茶花PPO 提取工藝條件進(jìn)行優(yōu)化研究，這也為金花茶花PPO 的性質(zhì)進(jìn)一步研究以及金花茶花的開發(fā)利用提供了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

金花茶鮮花：廣東省佛山市林業(yè)科學(xué)研究所金花茶示范林，品種為普通金花茶。

聚乙烯吡咯烷酮（polyvinyl pyrrolidone，PVP）、磷酸氫二鈉、檸檬酸、鄰苯二酚（均為分析純）：天津市福晨化學(xué)試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

722 可見分光光度計(jì)、PHS-3C 型精密 PH 計(jì)：上海佑科儀器儀表有限公司；TGL-16M 高速冷凍離心機(jī)：湖南湘儀試驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；HZK-FA110電子天平：福州華志科學(xué)儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 金花茶花PPO 粗酶液的提取

參照周燕燕方法[19]，稍作修改。挑選金花茶鮮花1 g 左右，加入pH 6.4 磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液6 mL，（內(nèi)含 15%PVP），研磨 10 min，在 4 ℃浸提 30 min，9 000 r/min 冷凍離心15 min，收集上清液即為粗酶液。

1.3.2 單因素試驗(yàn)

采用1.3.1 的方法提取金花茶花PPO，考察不同pH 值、浸提時(shí)間、PVP 添加量對金花茶花PPO 提取量的影響。

1.3.3 Box-Behnken 中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken響應(yīng)面法試驗(yàn)設(shè)計(jì)模型，以緩沖液pH 值、浸提時(shí)間以及PVP 添加量為自變量，以PPO 提取量為響應(yīng)值，進(jìn)行響應(yīng)面分析，因素水平如表1 所示。

表1 試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)Table 1 Experimental factors and horizontal design

1.3.4 建立神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型

本試驗(yàn)運(yùn)用BP 神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行建模，模型包含3層拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，輸入層、隱含層以及輸出層，其中將自變量3 個(gè)因素作為網(wǎng)絡(luò)的輸入，因變量作為網(wǎng)絡(luò)的輸出，構(gòu)建一個(gè)3-6-1 結(jié)構(gòu)的級聯(lián)BP 神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)。模型建立后，采用Matlab（2016b）軟件進(jìn)行編程，選擇雙曲正切傳遞函數(shù)（tansig）作為隱含層傳遞函數(shù)，線性傳遞函數(shù)（purelin）作為輸出層傳遞函數(shù)，設(shè)置隱含層1 個(gè)，內(nèi)含神經(jīng)元6 個(gè)，通過Levenberg-Marquardt 算法對新建BP 網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行訓(xùn)練，設(shè)定網(wǎng)絡(luò)訓(xùn)練參數(shù)值，最大訓(xùn)練次數(shù)為1 000 次，并采用均方誤差（mean-square error，MSE）評估神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型的預(yù)測性能，以所有的試驗(yàn)數(shù)據(jù)作為神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的訓(xùn)練樣本進(jìn)行模擬與仿真。與此同時(shí)比較分析響應(yīng)面模型與人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的優(yōu)化結(jié)果。

1.4 金花茶花PPO提取量的測定

金花茶花PPO 提取量的測定參照李鵬[20]的方法。取pH 6 磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液5 mL，加入0.5 mol/L 鄰苯二酚溶液1 mL，在室溫（20 ℃）條件下，將0.5 mL 粗酶液與上述溶液混合均勻后立即倒入5 cm 比色皿中，420 nm 處測定其吸光度，從酶液加入后開始計(jì)時(shí)，每30 s 記錄一次吸光度，共4 min。以底物溶液為空白組，計(jì)算酶的提取量，以酶活力代表酶的量。一個(gè)酶活力單位（U）定義為：在測定條件下，單位時(shí)間內(nèi)引起吸光度改變0.001 所需的酶量，計(jì)算公式如下：

式中：ΔA420nm為反應(yīng)時(shí)間內(nèi)OD 變化值；VT為提取粗酶液總體積，mL；M 為金花茶花鮮重，g；t 為反應(yīng)時(shí)間，min；VS為測定時(shí)取用酶液體積，mL。

1.5 數(shù)據(jù)處理

利用 Design-Expert 8.0.6 軟件和 Matlab（2016b）軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理、回歸分析及神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的建立、訓(xùn)練。

2 結(jié)果與分析

2.1 緩沖液pH值對金花茶花PPO提取量的影響

稱取1 g 左右金花茶鮮花，分別加入pH 5.8、6.0、6.4、6.8、7.0 的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液 6 mL，（內(nèi)含 15 % PVP），研磨 10 min，在 4 ℃浸提30 min，9 000 r/min 冷凍離心15 min，收集上清液測定吸光值并計(jì)算金花茶花PPO 提取量。結(jié)果如圖1 所示。

由圖1 可知，金花茶花PPO 提取量隨緩沖液pH 值的增加呈先升高后降低的趨勢，緩沖液pH 值在6.0～6.4范圍內(nèi)，PPO 提取效果好，最大值為1 178.90 U/（g·min），當(dāng)緩沖液pH 6.4 時(shí)，PPO 提取量開始明顯下降，所以選擇pH 6.4 作為緩沖液pH 值的最優(yōu)條件。

2.2 浸提時(shí)間對金花茶花PPO提取量的影響

圖1 緩沖液pH 值對金花茶花PPO 提取量的影響Fig.1 Effect of buffer pH on the extraction amount of PPO from Camellia nitidissima flowers

稱取1 g 左右金花茶鮮花，分別加入pH 6.8 的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液6 mL，（內(nèi)含15%PVP），研磨 10 min，在 4 ℃分別浸提 0、15、30、45、60 min，9 000 r/min 冷凍離心15 min，收集上清液，測定吸光值并計(jì)算金花茶花PPO 提取量。結(jié)果如圖2 所示。

圖2 浸提時(shí)間對金花茶花PPO 提取量的影響Fig.2 Effect of extraction time on the extraction amount of PPO from Camellia nitidissima flowers

由圖2 可知，PPO 提取量隨著浸提時(shí)間的延長先緩慢下降又明顯升高，當(dāng)浸提時(shí)間為45 min 時(shí)，PPO提取量達(dá)到最大值為1 333.11 U/（g·min），此后，繼續(xù)延長浸提時(shí)間，PPO 提取量開始下降。這是因?yàn)樵谝欢ǚ秶鷥?nèi)隨著時(shí)間的不斷延長，利于酶蛋白的溶出，當(dāng)溶出量達(dá)到最高至平衡時(shí)，繼續(xù)延長時(shí)間，由于酶蛋白在液態(tài)中構(gòu)象極其不穩(wěn)定水解，導(dǎo)致酶的提取量下降。

2.3 PVP添加量對金花茶花PPO提取量的影響

PVP 是一種酚類吸附劑，它與酚類物質(zhì)形成復(fù)合物，從而抑制酚類化合物與PPO 的聚合。稱取1 g 左右金花茶鮮花，分別加入pH 6.8 的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液6 mL，分別添加10%、15%、20%、25%、30%PVP，研磨 10 min，在 4 ℃浸提 30 min，9 000 r/min 冷凍離心15 min，收集上清液，測定吸光值并計(jì)算金花茶花PPO 提取量。結(jié)果如圖3 所示。

圖3 PVP 添加量對金花茶花PPO 提取量的影響Fig.3 Effect of PVP on the extraction amount of PPO from Camellia nitidissima flowers

如圖3 所示，PPO 提取量隨著PVP 量的增加先上升后下降，當(dāng)PVP 添加量達(dá)到20%時(shí)，PPO 提取量達(dá)到峰值1 115.31 U/（g·min）。因?yàn)檫m當(dāng)?shù)靥砑覲VP，能夠有效地抑制酚類物質(zhì)與PPO 的聚合，利于PPO 的溶出，而PVP 添加量過高將導(dǎo)致溶液體系過于黏稠，對PPO 的提取會(huì)造成不利影響。

2.4 金花茶花PPO提取工藝的響應(yīng)面優(yōu)化

2.4.1 BBD 試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案與結(jié)果

在單因素基礎(chǔ)上進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，結(jié)果如表2 所示。

表2 Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案與結(jié)果Table 2 Box-Behnken experiment design and results

2.4.2 回歸方程擬合及方差分析

采用Design-Expert 8.0.6 統(tǒng)計(jì)分析軟件對表2 試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多元回歸擬合，回歸分析結(jié)果見表3。

金花茶花PPO 提取量對浸提時(shí)間（A）、緩沖液pH值（B）和PVP 添加量（C）的二次多項(xiàng)式回歸模型為：

表3 回歸模型的方差分析及回歸系數(shù)的顯著性檢驗(yàn)Table 3 Analysis of variance for the established regression model

Y=1 793.11-16.54A-159.42B-130.97C+5.29AB-41.77AC-12.4BC-212.79A2-276.28B2-250.37C2?；貧w模型的決定系數(shù)R2=0.992 2，說明該模型與實(shí)際擬合良好，試驗(yàn)方法可靠，失擬項(xiàng)不顯著（P＞0.05），因此可用此模型來優(yōu)化金花茶花PPO 提取工藝。

2.4.3 模型雙因素交互作用效應(yīng)分析

根據(jù)Desig-Expert 得出各因素間的交互作用對金花茶花PPO 活力的影響，三維圖和等高線圖如圖4所示。

圖4 緩沖液pH 值、浸提時(shí)間與PVP 添加量交互作用的響應(yīng)面和等高線圖Fig.4 Response surface and contour plot of buffer pH，extraction time and PVP addition

由圖4b 可知，曲面較陡峭，說明浸提時(shí)間和PVP添加量之間的交互作用顯著，原因是PVP 的性質(zhì)隨著浸提時(shí)間的變化而變化，導(dǎo)致PVP 對粗酶液中一些酚類物質(zhì)的吸附作用發(fā)生改變，進(jìn)而影響PPO 的提取量。

通過對回歸方程求解，得最優(yōu)提取工藝為浸提時(shí)間 45 min、緩沖液 pH 6.29、PVP 添加量為 19 %，此條件下模型的預(yù)測值為1 847.26 U/（g·min）。考慮實(shí)際操作，將試驗(yàn)條件定為浸提時(shí)間45 min、緩沖液pH 6.30、PVP 添加量為19%。

2.5 神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的訓(xùn)練與仿真

將所有的試驗(yàn)數(shù)據(jù)作為網(wǎng)絡(luò)的訓(xùn)練樣本進(jìn)行訓(xùn)練和仿真。在級聯(lián)BP 神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)訓(xùn)練的過程中會(huì)將用來訓(xùn)練的訓(xùn)練樣本按照默認(rèn)比例隨機(jī)劃分為3 組樣本：訓(xùn)練樣本（train set）、驗(yàn)證樣本（validation set）和預(yù)測樣本（test set）。在Matlab 軟件下進(jìn)行編程并實(shí)現(xiàn)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)訓(xùn)練過程，結(jié)果見圖5～圖6。

圖5 BP 人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的訓(xùn)練過程Fig.5 Training process of BP artificial neural network

圖6 回歸坐標(biāo)圖Fig.6 Regression coordinates

由圖5 可知，在迭代次數(shù)為8 時(shí)，最佳驗(yàn)證性能0.003 807。經(jīng)過8 次訓(xùn)練后網(wǎng)絡(luò)的驗(yàn)證誤差小于0.01，已達(dá)到平衡狀態(tài)（圖中圓點(diǎn)處），之后訓(xùn)練誤差以及驗(yàn)證誤差一直保持穩(wěn)定，驗(yàn)證誤差經(jīng)過連續(xù)6 次迭代訓(xùn)練后不再減少，繼續(xù)訓(xùn)練會(huì)造成過度擬合。因此該神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)在訓(xùn)練了14 次迭代后性能已達(dá)到訓(xùn)練要求，說明該神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)具有好的收斂性。

由圖6 可知，3 類樣本數(shù)據(jù)回歸直線的相關(guān)系數(shù)分別為 0.957 07，0.991 7，0.970 71，所有訓(xùn)練樣本回歸直線的R=0.967 6，說明經(jīng)過訓(xùn)練后的級聯(lián)BP 神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的預(yù)測值與實(shí)測值具有良好的相關(guān)性。訓(xùn)練成熟的模型運(yùn)行后得到最終優(yōu)化的結(jié)果：浸提時(shí)間為45.06 min，緩沖液 pH 6.35，PVP 添加量為 22%，此條件下的模型預(yù)測值為1 825.7 U/（g·min），考慮試驗(yàn)操作得可行性，試驗(yàn)條件定為浸提時(shí)間為45 min，緩沖液pH 6.35，PVP 添加量為 22%。

2.6 優(yōu)化結(jié)果的驗(yàn)證與比較

為了驗(yàn)證兩種模型對金花茶花PPO 提取工藝優(yōu)化的有效性，在最佳工藝條件下進(jìn)行3 次重復(fù)試驗(yàn)并取平均值，結(jié)果如表4 所示。

表4 優(yōu)化結(jié)果比較Table 4 Comparision of optimizing results

由表4 可知，通過神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型優(yōu)化的實(shí)際值高、相對誤差小，但R2略小于響應(yīng)面模型，說明響應(yīng)面優(yōu)化法可能出現(xiàn)了過度擬合的現(xiàn)象。因此神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型的準(zhǔn)確性更高，可信度更強(qiáng)。

3 結(jié)論

采用RSM 優(yōu)化金花茶花PPO 提取工藝，優(yōu)化的最佳條件為浸提時(shí)間45 min、緩沖液pH 6.29、PVP 添加量為19%，模型的預(yù)測值為1 847.26 U/（g·min）。驗(yàn)證模型結(jié)果的偏差率為2.49%，滿足預(yù)期結(jié)果。ANN優(yōu)化金花茶花PPO 提取工藝的最佳條件為浸提時(shí)間45 min、緩沖液 pH 6.35、PVP 添加量為 22%，模型的預(yù)測值為1 825.70 U/（g·min），驗(yàn)證模型結(jié)果的偏差為1.14%，ANN 模型的相對誤差小于RSM，所以ANN 模型的精度更高，準(zhǔn)確性更強(qiáng)。