人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的外泌體通過(guò)circHIPK3促進(jìn)心梗修復(fù)

張雨晴，王燕麗，嚴(yán) 兵，張 瑜，謝文萍，劉 馮，李楊欣

(1. 蘇州大學(xué) 心血管病研究所，江蘇 蘇州 215000; 2. 蘇州大學(xué) 附屬第一醫(yī)院心臟大血管外科，江蘇 蘇州 215006)

急性心肌梗死是由于人為或非人為因素，導(dǎo)致冠狀動(dòng)脈處發(fā)生快速、且持續(xù)性的缺氧缺血現(xiàn)象，最終引發(fā)心肌壞死，是臨床上常見(jiàn)的急癥之一.因其死亡率高且預(yù)后較差，對(duì)人們的健康已經(jīng)造成了嚴(yán)重的威脅.目前治療心肌梗死的手段多樣化，主要包括藥物治療、冠狀動(dòng)脈旁路及介入治療、干細(xì)胞移植治療等.藥物治療、冠狀動(dòng)脈介入等常規(guī)治療，雖然在一定程度上緩解了患者的痛苦，但是都不能從根本上恢復(fù)受損的心肌.最新研究表明，干細(xì)胞移植治療作為一項(xiàng)新興的臨床前沿技術(shù)，將干細(xì)胞注射到梗死后的心肌組織，可以增加有活性的心肌細(xì)胞數(shù)量，促進(jìn)血管新生來(lái)改善心臟血流供應(yīng)，從而改善受損的心功能.作為一種多能干細(xì)胞，間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal Stem Cell, MSC)具有高度的自我更新、多向分化潛能，且來(lái)源廣泛，可在體外培養(yǎng)快速擴(kuò)增，是干細(xì)胞治療來(lái)源的首選種子細(xì)胞.目前基礎(chǔ)研究表明，MSC細(xì)胞主要通過(guò)旁分泌作用來(lái)修復(fù)梗死的心臟[1-2]，且臨床試驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)MSC細(xì)胞具有良好的安全性與有效性[3-4].但是MSC細(xì)胞本身因其滯留率低、細(xì)胞存活率低的問(wèn)題仍然是干細(xì)胞在臨床應(yīng)用過(guò)程中所面臨的主要障礙[5]，因此，基于無(wú)細(xì)胞的“干細(xì)胞”替代性治療才是首選策略[6-8].

外泌體(exosome)是由細(xì)胞分泌，直徑在30～100nm之間的脂質(zhì)膜性囊泡，作為一種傳遞生物信息的載體，在免疫應(yīng)答、細(xì)胞凋亡、血管生成、炎性反應(yīng)等生理病理過(guò)程中均發(fā)揮一定作用.研究發(fā)現(xiàn)干細(xì)胞分泌的exosome可減少缺血環(huán)境下心肌細(xì)胞凋亡，同時(shí)促進(jìn)心肌細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、分化等[9-10].exosome的心肌保護(hù)效果逐漸嶄露頭角，同時(shí)其在心肌修復(fù)、血管新生中的機(jī)制也成為研究的重點(diǎn)環(huán)節(jié),在熱休克蛋白家族相關(guān)通路、凋亡蛋白家族調(diào)控機(jī)制及非編碼RNA(ncRNA)傳輸和調(diào)控等方面扮演的角色也越來(lái)越重要,為心肌梗死提供了一種全新的生物分子治療方式[11-12].

環(huán)狀RNA(circRNA)是繼微小RNA(miRNA)和長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lncRNA)之后新興的一種內(nèi)源性ncRNA，在最近幾年逐漸受到廣泛關(guān)注,是目前RNA研究的熱點(diǎn).與線(xiàn)性RNA顯著不同，circRNA主要以環(huán)狀結(jié)構(gòu)存在，且不容易被核酸外切酶降解，表達(dá)更加穩(wěn)定，半衰期也較長(zhǎng).且越來(lái)越多的研究者發(fā)現(xiàn)，circRNA在心血管疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著一定的作用,它在調(diào)控心血管疾病中具備的巨大潛能,提示其在臨床診斷和治療方面將具有更廣闊的應(yīng)用前景[13-14].已有研究證明：exosome相比于其來(lái)源細(xì)胞，含有更豐富的circRNA[15]，但是外泌體中circRNA的功能研究甚少，幾乎沒(méi)有文獻(xiàn)涉及，因此探究exosome中circRNA的調(diào)控作用也將會(huì)具有更大的臨床研究?jī)r(jià)值.

近來(lái)發(fā)現(xiàn)circHIPK3在肝細(xì)胞癌、非小細(xì)胞肺癌等疾病模型中表達(dá)水平較高，能夠促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)[16].但其在受損心肌修復(fù)、心臟保護(hù)及再生等方面中的作用及其調(diào)控機(jī)制卻鮮有文獻(xiàn)報(bào)道.因此本研究擬探討exosome中的環(huán)狀RNA circHIPK3對(duì)心梗后心肌修復(fù)與再生方面的影響,并進(jìn)一步研究其調(diào)控的分子機(jī)制.

1 材料與方法

1.1 材料

C57BL/6小鼠，雄性，8～12周齡，18～22g，用于心梗模型的制作，購(gòu)買(mǎi)于昭衍(蘇州)新藥研究中心有限公司，目前在蘇州大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心飼養(yǎng).人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(Umbilical cord MSC, UMSC)購(gòu)于江蘇和澤生物有限公司.實(shí)驗(yàn)所用的H9C2細(xì)胞購(gòu)買(mǎi)自美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)(ATCC)；實(shí)驗(yàn)中涉及的siRNA試劑及引物均由廣州市銳博生物科技有限公司合成.

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及細(xì)胞處理

UMSC細(xì)胞生長(zhǎng)需要的完全培養(yǎng)基由4種成分組成：α-MEM basic基礎(chǔ)培養(yǎng)基，20%的胎牛血清FBS，雙抗(100U/mL青霉素和0.1mg/mL鏈霉素)，L-谷氨酰胺.H9C2細(xì)胞生長(zhǎng)需要的完全培養(yǎng)基由4種成分組成：DMEM basic基礎(chǔ)培養(yǎng)基，10%的胎牛血清FBS，雙抗(100U/mL青霉素和0.1mg/mL鏈霉素)，L-谷氨酰胺.細(xì)胞均培養(yǎng)在37℃，含有5%CO2的細(xì)胞恒溫培養(yǎng)箱中.每2天更換1次細(xì)胞培養(yǎng)液.低氧處理組細(xì)胞培養(yǎng)在37℃，含有5%CO2與1% O2的細(xì)胞恒溫培養(yǎng)箱中.

H9C2細(xì)胞凋亡模型的構(gòu)建：實(shí)驗(yàn)共分為3組，PBS處理組、exosome處理組、si-circHIPK3 exosome處理組.待細(xì)胞密度達(dá)到60%～70%左右時(shí)，將DMEM完全培養(yǎng)基更換為DMEM無(wú)血清培養(yǎng)基，同時(shí)在培養(yǎng)基中分別加入等量的exosome，放入低氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，之后收集細(xì)胞，進(jìn)行TUNEL染色，檢測(cè)細(xì)胞凋亡.

1.2.2 exosome的收集與鑒定

1.2.2.1 exosome的收集 取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的P3代UMSC細(xì)胞，用含10%Exo-free FBS的α-MEM完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)細(xì)胞48h后，收集培養(yǎng)上清.2000g離心20min，棄細(xì)胞碎片.之后向細(xì)胞上清中加入1/2倍體積的exosome分離試劑進(jìn)行濃縮，上下顛倒，充分混勻，置于4℃冰箱濃縮過(guò)夜.第2天，對(duì)濃縮混合液進(jìn)行10000g，4℃離心1h，棄凈上清，用適量1×PBS重懸exosome沉淀，置于-80℃保存.

1.2.2.2 流式細(xì)胞術(shù)鑒定exosome表面CD63的表達(dá) 通過(guò)BCA蛋白濃度定量試劑盒對(duì)exosome濃度進(jìn)行測(cè)定，取10μg exosome用于流式鑒定.具體操作如下：

① 在10μg的exosome懸液(EP管)中加入10μL乳膠微球顆粒，移液槍緩慢吹打混勻，室溫孵育15min；

② 向EP管中加入1×PBS至1mL，室溫繼續(xù)孵育2h.孵育期間使用移液槍不間斷進(jìn)行緩慢吹打混勻，使乳膠微球顆粒能夠與exosome充分混合；

③ 2h之后，向EP管中加入一定量體積的甘氨酸(1mol/L)，使其工作濃度達(dá)到0.1mol/L，移液槍緩慢吹打混勻，室溫孵育30min；

④ 4000r/min離心3min，棄上清.通過(guò)0.5%BSA溶液清洗2次exosome沉淀；

⑤ 100μL 0.5%BSA溶液重懸exosome，隨后加入10μL CD63抗體(FITC標(biāo)記，Abcam，美國(guó))，4℃避光孵育30min；

⑥ 通過(guò)0.5%BSA溶液繼續(xù)清洗exosome沉淀2次；

⑦ 向exosome沉淀中加入200μL 0.5%BSA溶液，移液槍緩慢吹打重懸exosome，使用流式細(xì)胞儀(Guava)進(jìn)行檢測(cè).

1.2.3 EdU染色檢測(cè)細(xì)胞增殖

使用EdU增殖檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞增殖.以每孔5×104的密度將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H9C2細(xì)胞鋪板于24孔板中，待細(xì)胞密度達(dá)到60%左右時(shí)，將circHIPK3 siRNA與lip2000以1∶1的比例混勻在DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)染H9C2細(xì)胞，6h后更換成DMEM完全培養(yǎng)基，48h后，EdU染色檢測(cè)細(xì)胞的增殖情況.具體染色步驟如下：

① 吸除舊培養(yǎng)基，每孔中加入50μmol/L EdU的培養(yǎng)基(200μL)，孵育2h，棄除培養(yǎng)基；PBS清洗2～3次，5min/次；

② 每孔中加入4%多聚甲醛細(xì)胞溶液(200μL)，固定細(xì)胞，室溫孵育30min，棄除固定液；

③ 每孔中加入2mg/mL甘氨酸溶液(200μL)，孵育5min(搖床)，棄除甘氨酸溶液，之后PBS搖床清洗5min，棄除PBS；

④ 每孔中加入0.5%TritonX-100溶液(200μL)，孵育10min(搖床)，之后PBS清洗5min；

⑤ 每孔中加入1×Apollo?染色液(200μL)，室溫避光孵育30min(搖床)，棄除染色液；加入0.5%TritonX-100溶液(100μL)，搖床清洗2～3次，10min/次，棄滲透劑；

⑥ 每孔中加入甲醇(200μL)清洗1～2次，5min/次；PBS清洗5min；

⑦ 每孔中加入1×Hoechst 33342染色反應(yīng)液(200μL)，室溫避光孵育30min(搖床)，棄除染色液；之后每孔中加入100μL PBS清洗1～3次；最后熒光顯微鏡(IX51)下觀察.

1.2.4 Annexin V檢測(cè)細(xì)胞凋亡

使用Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡流式檢測(cè)試劑盒(BD Pharmingen)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況.取100μL的1×Binding Buffer重懸細(xì)胞制備細(xì)胞懸液(105/mL)，向細(xì)胞懸液中分別加入5μL Annexin V-FITC抗體和5μL PI，室溫避光染色15min.然后補(bǔ)加400μL的1×Binding Buffer緩沖液，輕輕混勻，之后上機(jī)檢測(cè).

1.2.5 TUNEL染色

使用TUNEL染色試劑盒(Vazyme)檢測(cè)細(xì)胞凋亡.以5×104/孔的密度將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H9C2細(xì)胞鋪板于24孔板中，待細(xì)胞密度達(dá)到60%左右時(shí)，用400μg/mL的exosome培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，48h后，

表1 引物列表Tab.1 List of primers

細(xì)胞進(jìn)行固定、通透后，每孔中加入50μL左右的TdT孵育緩沖液，37℃避光孵育60min，之后用PBS搖床清洗5min后，進(jìn)行DAPI染色，室溫染色5min，即可通過(guò)熒光顯微鏡對(duì)細(xì)胞的凋亡情況進(jìn)行觀察.

1.2.6 Real-time PCR

取貼壁或懸浮細(xì)胞，直接通過(guò)TRIzol試劑(TaKaRa)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行裂解，提取細(xì)胞中總RNA，之后使用PrimeScript RT reagent Kit(TaKaRa)試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)，最后通過(guò)SYBR Premix Ex Taq Kit(TaKaRa)試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)目的基因的表達(dá).引物序列如表1所示.

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 circHIPK3在外泌體及心肌梗死中表達(dá)

為了探究circHIPK3在UMSC細(xì)胞來(lái)源exosome中的作用，我們首先通過(guò)原子力顯微鏡對(duì)UMSC細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，并對(duì)其來(lái)源的exosome進(jìn)行提取鑒定.如圖1(a)所示，UMSC細(xì)胞形態(tài)比較均一，呈典型梭形.原子力顯微鏡結(jié)果發(fā)現(xiàn)，UMSC細(xì)胞核顯著凸起，表明細(xì)胞增殖能力較強(qiáng)(圖1(b)).隨后，我們通過(guò)超速離心法，對(duì)UMSC來(lái)源的exosome進(jìn)行了分離，并利用流式細(xì)胞術(shù)鑒定exosome中的標(biāo)記物CD63蛋白分子的表達(dá)(圖1(c)).通過(guò)qPCR對(duì)不同培養(yǎng)時(shí)間下UMSC細(xì)胞及其來(lái)源exosome中circHIPK3的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示UMSC細(xì)胞與exosome中circHIPK3的表達(dá)存在一定的正相關(guān)性.即UMSC細(xì)胞中circHIPK3表達(dá)水平較高時(shí)，其對(duì)應(yīng)的exosome中也相對(duì)較高，且每個(gè)時(shí)間點(diǎn)下外泌體中的circHIPK3均高于細(xì)胞中的circHIPK3.其中在12h時(shí)，UMSC及exosome中circHIPK3的表達(dá)水平最高(圖1(d)).但是由于12h時(shí)UMSC細(xì)胞所分泌的exosome量相對(duì)較少，因此本論文中我們采用了48h作為UMSC細(xì)胞的培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)，用于收集exosome.同時(shí)，我們也分別對(duì)心肌梗死1，3，7d后小鼠的缺血心肌進(jìn)行RNA提取，檢測(cè)circHIPK3的表達(dá)變化，發(fā)現(xiàn)circHIPK3在心肌梗死發(fā)生第1天下調(diào)最為明顯，具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖1(e)).

2.2 exosome通過(guò)circHIPK3促進(jìn)心肌梗死修復(fù)

為了探究exosome中高表達(dá)的circHIPK3是否對(duì)心肌梗死具有治療作用，我們針對(duì)circHIPK3接頭處序列設(shè)計(jì)了3對(duì)siRNA,并通過(guò)qPCR對(duì)siRNA轉(zhuǎn)染后的UMSC細(xì)胞,分別進(jìn)行circHIPK3、線(xiàn)性HIPK3的表達(dá)水平檢測(cè).結(jié)果如圖2(b)所示：siRNA處理后，UMSC細(xì)胞中circHIPK3的表達(dá)顯著下調(diào)，而線(xiàn)性HIPK3的表達(dá)并未發(fā)生顯著變化(P>0.05).同時(shí)收集si-circHIPK3轉(zhuǎn)染UMSC細(xì)胞后所分泌的exosome，進(jìn)行circHIPK3表達(dá)水平的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)exosome中circHIPK3的表達(dá)也是顯著降低(圖2(c)).緊接著我們通過(guò)構(gòu)建小鼠心肌梗死模型，心肌注射20μL PBS、100μg exosome、si-circHIPK3 exosome(5μg/μL，共計(jì)20μL，分5點(diǎn)依次注射)，并于心梗后1，3，7，14，28d，通過(guò)超聲系統(tǒng)檢測(cè)了不同處理組小鼠的心臟功能恢復(fù)情況.結(jié)果顯示術(shù)前和心肌梗死術(shù)后1d LVEF在3組間無(wú)明顯差異.但是在心梗手術(shù)后第7天，和si-circHIPK3處理組與PBS對(duì)照組相比，exosome處理組的LVEF明顯增加(圖2(d、e、f)).Massson染色結(jié)果也顯示：si-circHIPK3處理組心臟纖維化面積顯著高于exosome處理組(圖2(g))中，表明exosome通過(guò)傳遞circHIPK3，促進(jìn)心梗修復(fù).

2.3 circHIPK3通過(guò)抑制心肌細(xì)胞凋亡修復(fù)心肌梗死

為探究circHIPK3如何發(fā)揮修復(fù)心肌梗死的作用，我們首先對(duì)轉(zhuǎn)染si-circHIPK3的H9C2細(xì)胞進(jìn)行了EdU染色，(圖3(a))染色結(jié)果顯示下調(diào)circHIPK3明顯抑制心肌細(xì)胞的增殖.緊接著，將PBS、exosome、si-circHIPK3 exosome分別在低氧環(huán)境中與H9C2細(xì)胞共培養(yǎng)48h，繼而通過(guò)TUNEL染色與流式檢測(cè)H9C2細(xì)胞的凋亡情況.結(jié)果顯示：與正常exosome組相比，si-circHIPK3 exosome組的保護(hù)作用明顯減弱(圖3(b、c、d)).由此可見(jiàn)，exosome中的circHIPK3通過(guò)抑制心肌細(xì)胞凋亡的發(fā)生，從而促進(jìn)心肌梗死后的修復(fù).

3 討 論

我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明circHIPK3在UMSC及其來(lái)源的exosome中表達(dá)較為豐富，且在小鼠心肌梗死后的心臟中顯著下調(diào).所以我們通過(guò)設(shè)計(jì)3對(duì)si-circHIPK3來(lái)下調(diào)UMSC來(lái)源的exosome中的circRNA，結(jié)果證明了exosome可以通過(guò)遞送circHIPK3，抑制心肌細(xì)胞凋亡，促進(jìn)心肌梗死后受損心肌的修復(fù)與再生.

旁分泌作用是間充質(zhì)干細(xì)胞發(fā)揮治療作用的主要途徑，而exosome作為旁分泌的主要成分之一，包含mRNA、miRNA、circRNA、蛋白質(zhì)等多種功能性的分子，不僅參與調(diào)控細(xì)胞的增殖與存活，在信號(hào)傳遞、細(xì)胞交流中也同樣發(fā)揮著重要的作用[17].目前已經(jīng)有很多研究報(bào)道表明間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的exosome能夠促進(jìn)心肌梗死后的心臟修復(fù)[18-20]，但是目前還不清楚exosome究竟能否完全代替間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)進(jìn)行心臟修復(fù).且間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的exosome介導(dǎo)心臟修復(fù)的分子機(jī)制目前還有待深入探究與完善,尤其是在circRNA調(diào)控方面，更是一片空白.我們的研究方向正好填補(bǔ)了這方面的機(jī)制空缺，為臨床治療提供了新的探究視野.

circHIPK3是由HIPK3基因第二外顯子編碼而來(lái)，主要定位于細(xì)胞質(zhì)中.文獻(xiàn)[16,21]的研究發(fā)現(xiàn)，在肝癌細(xì)胞中，circHIPK3通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合多種miRNAs，繼而促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖與遷移.文獻(xiàn)[22]系統(tǒng)性地分析了circHIPK3在糖尿病視網(wǎng)膜血管功能中的作用，發(fā)現(xiàn)circHIPK3通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miR-30a-3p繼而促進(jìn)其下游基因VEGF/WNT2/FZD4的表達(dá)，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖.由此表明circHIPK3具有促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移與調(diào)控血管功能的作用.但是circHIPK3在心臟功能方面的調(diào)控作用，還未有文獻(xiàn)報(bào)道.本研究中通過(guò)體內(nèi)體外模擬心臟缺血環(huán)境，設(shè)計(jì)針對(duì)circHIPK3序列的siRNA分子，探究發(fā)現(xiàn)circHIPK3不僅具有促進(jìn)心肌細(xì)胞增殖的功能，還能夠顯著降低細(xì)胞的凋亡率，同時(shí)改善受損心臟，促進(jìn)心臟組織再生.

總之，我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，UMSC細(xì)胞來(lái)源的exosome，通過(guò)輸送circHIPK3,抑制心肌細(xì)胞凋亡，促進(jìn)心肌梗死修復(fù)，對(duì)心臟組織再生修復(fù)及臨床應(yīng)用提供了很好的借鑒思路.但是本研究并未涉及到circHIPK3抑制心肌細(xì)胞凋亡、促進(jìn)心臟修復(fù)與再生的具體機(jī)制，這點(diǎn)需要后續(xù)更進(jìn)一步的探究.