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    光信號途徑組分HEMERA調控擬南芥的花藥發(fā)育

    2020-03-23 10:31:50王靜雅尚雪瑩李夢雨
    復旦學報(自然科學版) 2020年1期
    關鍵詞:花粉粒花藥突變體

    王靜雅,尚雪瑩,李夢雨,馬 紅,常 芳

    (復旦大學 生命科學學院 植物科學研究所,上海 200438)

    被子植物又稱為開花植物,其物種數(shù)目能占全球總數(shù)的67%,重要的原因除了被子植物的雙受精機制以外,還因為其能夠適應復雜的外界環(huán)境.近年的多項研究報道了生長素、油菜素甾醇、甲基茉莉酸等植物激素信號以及高溫、干旱等非生物信號均對花藥發(fā)育產(chǎn)生重要影響.研究植物對環(huán)境信號的響應能夠豐富植物生長與生殖過程的信號網(wǎng)絡,為農(nóng)作物的分子改良提供重要的理論指導,對于植物的繁衍生息、物種多樣性的保護以及農(nóng)作物的增產(chǎn)都具有至關重要的意義.

    花藥是被子植物的雄性生殖器官,其正常發(fā)育與否直接影響植物繁衍和作物產(chǎn)量.目前依賴于細胞生物學和分子遺傳學等手段進行的研究已經(jīng)明確,花藥發(fā)育過程包括早期的形態(tài)建成、減數(shù)分裂和后期的花粉粒發(fā)育幾個階段[1-2].擬南芥的花藥發(fā)育過程能夠分為14個時期,在第5期花藥完成形態(tài)建成,形成具有4個藥室的典型結構,且每個藥室都由4層體細胞(從外到內分別為表皮層、內皮層、中間層以及絨氈層)包圍中央的花粉母細胞構成;花粉母細胞在第6期進行減數(shù)分裂并于第7期形成四分體;此后包圍四分體的胼胝質被降解、小孢子被釋放到藥室中,最終發(fā)育成為成熟花粉粒并于第13期被釋放出來[2-3].這一過程中,絨氈層的正常發(fā)育和降解對花藥發(fā)育至關重要,其能夠分泌胼胝質酶促進胼胝質降解、合成孢粉素前體用于花粉壁合成、同時也為小孢子后期發(fā)育提供必要的營養(yǎng)和脂類物質[4-7].在花藥發(fā)育過程中存在多層次信號途徑協(xié)調互作,以實現(xiàn)對植物生命活動復雜而精確的調控,例如受體激酶BAM1/2、ER/ERL1/ERL2參與調控藥室發(fā)育及生殖細胞與體細胞的分化[8-10];受體樣蛋白激酶EMS1-SERKs-TPD1組成的受體-配基復合物參與調控絨氈層的形成[11-15];DYT1-MYB35/TDF1-AMS-MS1遺傳通路調控絨氈層發(fā)育及功能[16-18];多肽激素CLE19及其冗余家族成員在花粉外壁形成過程中發(fā)揮重要作用[19].同時,高溫、干旱等環(huán)境信號也是影響植物育性的重要因素[20-22].

    光是重要的環(huán)境信號,能夠引發(fā)植物的光形態(tài)建成以及調控植物的多個生長發(fā)育過程[23].光信號的缺乏或對光信號響應的缺陷會導致植物的形態(tài)出現(xiàn)異常.植物破土前在黑暗環(huán)境下處于暗形態(tài)發(fā)生時期,下胚軸會不斷伸長,葉片的生長受到抑制;而當幼苗暴露在陽光下后能夠響應光信號,完成光形態(tài)建成,在此過程中葉片不斷生長發(fā)育,而下胚軸生長則受到抑制.B類基因(class B genes)是一類特殊的、與擬南芥生長相關的基因,在黑暗條件下,轉錄因子PHYTOCHROME INTERACTING FACTORs(PIFs)不斷積累,并能夠通過激活B類基因的表達從而促進下胚軸的伸長;而在光照條件下,光敏色素Phytochromes(phys)則能夠通過促進PIFs的降解以抑制其功能,從而完成光形態(tài)建成過程[24-27].近年的研究表明,光信號能夠影響植物的開花時間,且光溫敏核不育小麥的花藥發(fā)育也會受到光周期的影響[28-29].但目前對于光信號調控雄性育性的分子機制尚不清楚.本實驗室前期利用轉錄組分析發(fā)現(xiàn)有752個光信號途徑相關基因在擬南芥4~7期花藥中表達,暗示這些基因可能在花藥發(fā)育中發(fā)揮功能[30].

    HEMERA(HMR)基因編碼一個光敏色素信號途徑中的關鍵元件,已經(jīng)被報道參與調控擬南芥光信號轉導途徑,在光形態(tài)建成中發(fā)揮關鍵作用[31-33].hmr-5為擬南芥的功能完全缺失突變體,其HMR的N端突變導致翻譯提前終止[34].已有研究證實hmr-5的光信號的響應缺陷會導致其葉片出現(xiàn)白化癥狀且下胚軸持續(xù)伸長,幼苗在光照條件下無法完成光形態(tài)建成過程[35].使用35S啟動子驅動HMR-HA蛋白在hmr-5突變體背景下過表達,能夠恢復hmr-5的功能缺陷.此外,HMR蛋白的C端有一段9個氨基酸的序列(9aa TAD),可能決定了HMR的轉錄激活功能[36],該區(qū)域定點突變植株hmr-22(D516N)幼苗的生長也出現(xiàn)一定程度的損害,其對紅光和遠紅光的響應程度降低,但對藍光具有正常的響應[35].進一步的分子機制研究揭示HMR的功能缺失會導致PIFs蛋白的降解過程受阻,且PIFs下游B類基因的表達激活出現(xiàn)異常[31,35].在光照條件下,HMR是PIF蛋白降解過程所必需的,一方面HMR的N端能夠直接與轉錄因子PIF1、PIF3結合,和phys一起介導PIFs的降解過程,最終抑制下胚軸的伸長;另一方面HMR蛋白的C端則通過招募或穩(wěn)定由基本轉錄因子(General Transcription Factors, GTFs)、中介體復合物(mediator complex)與RNA聚合酶Ⅱ(pol Ⅱ RNA polymerase)組成的轉錄復合體來促進PIFs下游B類基因的轉錄激活,最終促進下胚軸的伸長[35].但HMR是否參與到雄蕊發(fā)育過程,目前尚未見報道.

    基于此,本文以HMR轉錄激活能力下降的點突變體hmr-22和轉基因恢復株系HMR-HA/hmr為材料,分析了HMR在雄蕊發(fā)育過程中可能發(fā)揮的功能,為深入闡明光信號途徑調控植物雄性育性的分子機制奠定基礎.

    1 材料和方法

    1.1 材料

    擬南芥(Arabidopsisthaliana)為哥倫比亞生態(tài)型(Columbia),野生型為Columbia-0(Col-0).突變體包括點突變體hmr-22和轉基因植株HMR-HA/hmr[34-35].

    1.2 方法

    1.2.1 擬南芥突變體DNA的提取與基因型鑒定

    采新鮮的擬南芥葉片,使用CTAB法提取其基因組DNA[37].基因型鑒定使用引物見表1,擴增后選取電泳條帶清晰明亮的樣品使用NanoDrop超微量紫外分光光度計測量其DNA濃度,將達到要求的樣品送至公司測序.測序結果使用擬南芥TAIR網(wǎng)站(www.arabidopsis.org)的BLAST功能進行比對分析.

    表1 實驗用引物信息Tab.1 Primers used in experiment

    1.2.2 亞歷山大紅染色觀察

    取剛剛露白的花朵(約為花藥發(fā)育的11~12期)浸泡于卡諾固定液中于4℃保存.觀察時,在體視顯微鏡(Motic Discovery.V8)下剝掉花瓣及花萼后放置于亞歷山大紅染液(Solarbio G3050)中,65℃染色20min后取出,放置于載玻片上,使用解剖針尖分離花藥,注意不要弄破花藥,制片后放置在顯微鏡(Zeiss Axio Scope A1)下觀察花藥的大小和花藥中花粉粒的活性并拍照.

    1.2.3 花序樹脂包埋

    摘取擬南芥新鮮植株的花序,將開放的花朵去除,放入裝有FAA固定液的青霉素小瓶中,抽兩次真空至花序沉底,后放置于4℃冰箱保存過夜.在小瓶中依次換入濃度為70%、80%、90%、95%的乙醇溶液分別脫水處理1h,后換入100%的乙醇處理2h,再使用加入伊紅染料的100%乙醇處理2h使花序著色;在小瓶中換入預滲透液(無水乙醇與Base liquid Technovit 7100等體積混勻)中進行1h的預滲透處理,換入滲透液(1g硬化劑1溶于100mL Base liquid Technovit 7100)中滲透3h.將1mL硬化劑2添加到15mL滲透液后分裝入包埋板中并將花序放入包埋板中擺正,放置于65℃烘箱中烘烤36h以上直至樣品完全變硬.

    1.2.4 半薄切片及染色

    使用LEICA RM2265型全自動電動輪轉切片機,檢查其工作狀態(tài),將烘烤完成的包埋塊從包埋板中取出并安裝到LEICA RM2245型切片機上,制備玻璃刀,調整刀口與包埋塊之間的位置與角度后開始切片,切片厚度為1.0μm.在載玻片中央滴加蒸餾水,放置于42℃的烘片臺上,使用鑷子和針尖將切好的切片從刀口轉移到載玻片上.等待切片平展開至沒有褶皺,用吸水紙輕輕吸去多余水分,將載玻片放置于65℃烘箱內烘干.將載玻片放入裝有1%甲苯胺藍染色液的玻璃染缸中染色1min左右,用蒸餾水沖洗干凈后蓋上蓋玻片放置于顯微鏡(Zeiss Axio Scope A1)下觀察并拍照.

    1.2.5 花粉體外萌發(fā)實驗

    配置花粉體外萌發(fā)培養(yǎng)基,加入瓊脂后加熱,用移液槍趁熱將培養(yǎng)基滴入凹面載玻片中.摘取露白花苞,除去花瓣和雌蕊,輕輕將雄蕊沾在培養(yǎng)基上.將載玻片放置于濕盒中,濕盒底層加蒸餾水.放置于22℃避光培養(yǎng)4~8h后使用顯微鏡(Zeiss Axio Scope A1)觀察,統(tǒng)計萌發(fā)的花粉比例.

    2 結果與分析

    2.1 轉錄組分析結果

    為了了解HMR是否可能在生殖發(fā)育過程中發(fā)揮功能,我們首先分析了HMR在不同營養(yǎng)和生殖階段的表達情況.The Bio-Analytic Resource for Plant Biology公共數(shù)據(jù)庫(http: ∥bar.utoronto.ca/)中的數(shù)據(jù)結果顯示,在23個營養(yǎng)器官中,HMR主要在莖尖和蓮座葉等器官中具有比較高的表達水平(圖1(a));而在生殖過程中,HMR在莖尖分生組織、花序、第9期的花、第10~11期的花、第12期的花中呈現(xiàn)高水平表達(圖1(b)),表明HMR在這些過程可能發(fā)揮重要作用.

    繼而,我們依據(jù)本課題組及其他課題組已發(fā)表的轉錄組數(shù)據(jù)[22,38-39],著重分析了該基因在雄性生殖發(fā)育相關組織器官中的表達.結果表明HMR在第1~9期的花(Early Flowers)、第10~12期的花(Late Flowers)、第4~7期的花藥(Anther 4~7)、第4~10期的花藥(Anther 4~10)中都有較高水平的表達(圖1(c)),暗示其在花藥發(fā)育過程中可能發(fā)揮功能.此外,為了明確HMR是否在CLE19、AMS、BAM3、BES1、DYT1、bHLH010/089/091這些花藥發(fā)育核心調控元件的下游發(fā)揮功能,我們還基于本課題組轉錄組數(shù)據(jù),分析了HMR在這些相關單突變體、雙突變體和三突變體花藥轉錄組中的表達變化情況[40-41](本課題組部分轉錄組數(shù)據(jù)尚未發(fā)表).結果表明HMR在上述相關突變體中的表達變化幅度都不超過2倍(圖1(d)),暗示其RNA表達水平不受這些基因的調控.

    2.2 hmr-22純合植株的鑒定與序列比對

    為了保證所使用的突變體為純合植株,我們首先對植株進行了基因型鑒定,對突變體和野生型植株提取基因組后,使用表1中的引物進行擴增并送測序,使用TAIR網(wǎng)站的BLAST功能比較突變體與野生型植株HMR基因序列的差別,確認點突變位置(D516N),且測序峰圖中突變位置對應的峰為清晰的單峰,說明突變體為純合hmr-22植株,可以用于后續(xù)研究.

    2.3 植株形態(tài)與育性分析

    我們觀察了WT、hmr-22純合突變體及35S啟動子驅動的轉基因恢復植株HMR-HA/hmr的生殖發(fā)育情況(圖2(a)).野生型的植株生長正常,能夠形成較多飽滿的長角果;相比之下,hmr-22純合突變體抽苔時間顯著更晚,植株更矮、果莢短;而轉基因恢復植株HMR-HA/hmr果莢的大小和育性與野生型無明顯差異.進而,我們分別統(tǒng)計了野生型、hmr-22、HMR-HA/hmr3種基因型植株主苔的平均果莢數(shù)以及每個果莢內產(chǎn)生的種子數(shù)目.結果表明: 和野生型及轉基因恢復植物相比,hmr-22突變體中產(chǎn)生的果莢數(shù)目以及每個果莢中的種子數(shù)目均顯著減少(圖2(b)、(c)).以上結果說明HMR對于植物的營養(yǎng)生長過程與生殖生長過程均有較大影響,且HMR功能缺失導致植株育性下降,暗示它在生殖發(fā)育過程中可能發(fā)揮重要作用.

    2.4 花藥亞歷山大紅染色觀察花粉?;钚?/h3>

    為了明確HMR基因是否在花藥發(fā)育過程中發(fā)揮作用,我們對突變體的花藥進行了亞歷山大紅染色,通過觀察花藥的形態(tài)、花粉粒的數(shù)量以及花粉粒的活性進一步明確hmr-22的雄性生殖發(fā)育表型.染色結果顯示野生型花藥經(jīng)過染色后,4個飽含紅色活力成熟花粉粒的藥室清晰可見(圖3(a)),相比之下,hmr-22花藥雖然仍有正常的4藥室結構,但花粉粒的數(shù)量與野生型相比有比較明顯的下降(圖3(b));而在轉基因植株HMR-HA/hmr中花藥中的花粉數(shù)量與野生型相近,未見明顯異常(圖3(c)).以上結果表明hmr-22突變體的雄性發(fā)育過程存在缺陷,進一步暗示了HMR可能參與調控花藥的發(fā)育過程.

    2.5 半薄切片觀察突變體花藥細胞結構

    為了進一步探究HMR在花藥發(fā)育中發(fā)揮功能的時期及細胞層,我們采用半薄切片的方法對突變體花藥的發(fā)育過程和組織結構進行觀察,結果如圖4所示.野生型花藥在第5期時花藥形成了由外到內的表皮層、內皮層、中間層、絨氈層4層體細胞包圍著中央生殖細胞的典型形態(tài)特征(圖4(a));在第7期花藥藥室中能清晰地看到小孢子母細胞減數(shù)分裂形成的由4個單核花粉粒形成的四分體(圖4(b));第8期時小孢子從四分體內釋放到花藥的藥室中(圖4(c)).相比而言,hmr-22的花藥發(fā)育表型在第8期之前與野生型基本一致,各個細胞層分化正常(圖4(f)、(g)、(h)).

    花藥發(fā)育的后期為小孢子發(fā)育為花粉粒的階段,隨著花粉粒逐漸成熟,花絲不斷伸長以將花藥舉高,而提供營養(yǎng)物質的絨氈層細胞則會在第10期開始發(fā)生程序性死亡而逐漸降解,至第12期降解完全(圖4(d)、(e)).半薄切片結果顯示,在這一發(fā)育階段hmr-22的花藥結構與野生型相比出現(xiàn)了明顯的異常,野生型花藥的絨氈層細胞于第10~11期正常降解,而在hmr-22突變體中可觀察到絨氈層細胞的提前降解(圖4(i)),最終導致突變體第12期產(chǎn)生的花粉粒出現(xiàn)異常的空泡化而敗育(圖4(j)).而回補株系HMR-HA/hmr的切片結果顯示,其花藥發(fā)育過程正常,與野生型相比無較大差異(圖4(k)~(o)).同時,hmr-22突變體花粉在12期與野生型和轉基因恢復株系相比,花粉著色比較淺,且半數(shù)花粉空泡化,說明花粉發(fā)育及脂類物質合成可能不足(圖4(j)).以上結果暗示HMR功能異常影響了花粉發(fā)育過程.

    2.6 體外萌發(fā)實驗觀察花粉萌發(fā)率

    亞歷山大紅染色及半薄切片結果均證明hmr-22突變體的花藥發(fā)育出現(xiàn)異常,導致敗育花粉的形成.但我們仍然可以觀察到相當數(shù)量形態(tài)、活力正常的花粉.但這些染色正常的花粉是否具有正常萌發(fā)的能力呢?因此我們取第13期開放的花,將其花粉粒鋪于固體萌發(fā)培養(yǎng)基上,進行體外萌發(fā)實驗.多次重復的實驗結果顯示,野生型植株與HMR-HA/hmr轉基因的花粉粒體外萌發(fā)率接近50%,而hmr-22突變體花粉粒的萌發(fā)率則顯著降低至不足20%(圖3(d)),表明HMR基因功能異常影響了花粉活力和花粉萌發(fā)能力.這一結果和半薄切片中觀察到花粉著色淺及空泡化是吻合的.

    3 討 論

    雄蕊的正常發(fā)育是被子植物產(chǎn)生正??捎ǚ哿5那疤?,也是植物正常完成雙受精作用而繁衍后代的基礎,探究其發(fā)育過程及調控機制對于生殖發(fā)育基礎理論研究及針對農(nóng)作物的遺傳改良都具有重要意義.之前在模式植物擬南芥和水稻中進行的系列研究揭示了眾多調控雄性生殖發(fā)育的植物內在調控基因以及環(huán)境因子,比如高溫、干旱等.不同于動物面對脅迫條件可以逃避,植物無法移動,只能通過多種信號轉導途徑適應外部環(huán)境、調控自身生長發(fā)育過程.因此探究植物生長發(fā)育過程中對環(huán)境信號的響應是非常重要的.

    植物的生長發(fā)育不僅受到遺傳物質的控制,也受到各種環(huán)境信號的調節(jié),因此,植物的發(fā)育過程需要各種復雜的信號通路之間存在多層次的協(xié)調作用,以感知環(huán)境信號,實現(xiàn)對植物生命活動復雜而精確的調控,維持植物生長、繁殖與抵抗逆境之間的平衡,使生命活動的效率達到最大化.因此,一個基因同時參與調控多個生物學過程,是重要而有意義的.在眾多的環(huán)境因素中,光信號對于植物的發(fā)育起著至關重要的作用.一方面,光是植物的重要能量來源,另一方面,光也是調控包括生殖發(fā)育在內的植物發(fā)育過程的重要信號,光周期極大地調控了擬南芥的開花過程.但是目前我們對于哪些基因參與了光信號對于植物生長發(fā)育的調控過程依然所知甚少,對于這些基因在生殖方面的功能更知之甚少.光信號通路的HEMERA(HMR)基因被報道在光敏色素介導的紅光/遠紅光信號途徑中發(fā)揮重要的調控作用,對植物的光形態(tài)建成具有重要意義.但其是否參與調控生殖發(fā)育尚不清楚.

    本研究采用C端9aa TAD序列的點突變體hmr-22、野生型擬南芥Col-0以及轉基因恢復株系HMR-HA/hmr作為材料,通過對植株形態(tài)、果莢數(shù)量及長度、花藥育性、花藥發(fā)育過程、花粉萌發(fā)情況進行細致觀察和統(tǒng)計分析,明確了HMR功能異常會影響植物的生殖發(fā)育過程,并且發(fā)現(xiàn)這種影響是由于花藥絨氈層的后期形態(tài)和功能、花粉發(fā)育以及花粉萌發(fā)力均出現(xiàn)異常的綜合結果.此前沒有光信號中光敏色素相關基因在植物生殖發(fā)育過程中的功能研究報道,本文首次證明了光敏色素B信號途徑重要組分HMR參與調控擬南芥雄性生殖發(fā)育的過程.這一研究不僅揭示了光敏色素途徑在調控植物雄性育性中的功能,也為進一步深入研究其作用機制和信號轉導途徑奠定了基礎.同時,這一方向的深入探究對于理解植物生殖發(fā)育的平衡以及指導農(nóng)業(yè)生產(chǎn)具有重要意義.

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