擬南芥中MRG2與BAF60相互作用的研究

蔡茜茜，蘇 偉

(1.復旦大學 生命科學學院 植物科學研究所，上海 200438； 2.復旦大學 遺傳工程國家重點實驗室，上海 200438)

MRG2是擬南芥中MRG家族成員之一，與酵母的Eaf3(ESA1-associated factor 3)，果蠅的MSL3(Male-Specific Lethal 3)以及哺乳動物的MRG15(Morf-Related Genes on chromosomes 15)同源.MRG家族蛋白都含有兩個保守的結(jié)構(gòu)域，分別是處于N端的Chromo結(jié)構(gòu)域和C端的MRG結(jié)構(gòu)域[1-3].酵母中Eaf3是組蛋白乙酰化轉(zhuǎn)移酶NuA4復合物的組成成分，同時也是組蛋白去乙?；窻pd3S復合物的組成成分.研究發(fā)現(xiàn)，Eaf3的Chromo結(jié)構(gòu)域與H3K36甲基化相互作用，促進Rpd3S在基因編碼區(qū)的去乙?；饔肹4-5].果蠅MSL蛋白對于提高雄性X染色體的轉(zhuǎn)錄至關(guān)重要，MSL復合物通過擴散組蛋白H4K16乙酰基標記來上調(diào)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄[6-7]，也有研究表明： MSL3是三甲基化修飾的H3K36的閱讀蛋白，MSL3中的Chromo結(jié)構(gòu)域還可以在體外結(jié)合DNA和甲基化狀態(tài)的H4K20[8-9].哺乳動物中MRG15缺失導致小鼠胚胎死亡、纖維細胞壞死、細胞加速衰老和DNA修復功能損失等表型，表明MRG蛋白在許多細胞活動中發(fā)揮重要的調(diào)控作用[10-11].MRG結(jié)構(gòu)域能夠結(jié)合多種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子和染色質(zhì)重塑因子，包括組蛋白去乙?；皋D(zhuǎn)運共阻遏物mSin3A和核蛋白PAM14(Protein-Associated MRG， 14kDa)[12].人類MRG15可以調(diào)節(jié)核小體組蛋白H4和H2A的乙酰化修飾水平，這種修飾可以改變核小體與DNA之間的相互作用，從而促進修飾后的組蛋白與其他調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄激活蛋白之間的相互作用.另外，MRG15通過閱讀三甲基化修飾的H3K36參與基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控、RNA前體可變剪切和染色質(zhì)重塑[13-15].

MRG蛋白家族在高等植物中的研究相對較少.我們實驗室的前期研究表明： 水稻MRG702(Morf-Related Gene 702)作為H3K36的甲基化閱讀蛋白，識別H3K36甲基化修飾，基因表達下調(diào)的MRG702Ri植株呈現(xiàn)晚花、劍葉葉夾角變小、節(jié)間變短、分蘗減少等表型，參與油菜素甾醇信號通路調(diào)控[16].我們實驗室和Toshiro Ito實驗室分別發(fā)現(xiàn)并報道了擬南芥MRG1/2作為組蛋白甲基化閱讀蛋白，能夠識別H3K36甲基化并招募轉(zhuǎn)錄因子CO(transcription factor CONSTANS)，促進FT(FLOWERINGLOCUST)基因的表達，進而促進植物開花[17-18].此外，MRG還能夠與PIF7(Phytochrome-Interacting Factor 7)相互作用，參與擬南芥避蔭反應調(diào)節(jié)[19].

SWI/SNF(Switching/Sucrose Non-Fermenting)復合物是ATP依賴的染色質(zhì)重塑蛋白，依賴ATP水解能量改變核小體結(jié)構(gòu)，同時能夠識別組蛋白末端的乙?；ㄟ^結(jié)合肌動蛋白或其相關(guān)蛋白ARPs(nuclear Actin-Related Proteins)調(diào)節(jié)復合物與染色質(zhì)的結(jié)合[20-22].酵母中SWI/SNF同源復合物能夠和乙酰轉(zhuǎn)移酶共同參與激活目的基因的轉(zhuǎn)錄表達[23-25].除了調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄功能以外，酵母ySWI/SNF(yeast SWI/SNF)還參與DNA復制，促進DNA復制起始，也可以參與核小體核苷酸切除修復過程[26-27].酵母SWP73是SWI/SNF復合物的重要組分，在轉(zhuǎn)錄激活中發(fā)揮作用.SWP73的同系物，在果蠅中稱為BAP60(Brahma Associate Protein 60)，在人類中稱為BAF60(BRM/BRG1 Associated Factor 60).哺乳動物中BAF由9～12個亞基組成，BAF60家族最少有3個成員，包括普遍存在的BAF60a，在肌肉和胰腺組織中表達的BAF60b和BAF60c[28].

植物SWI/SNF核心酶對植物的生長發(fā)育起著至關(guān)重要的作用，核心酶的缺失會導致植株矮小，生長緩慢等多種表型[29-30].擬南芥基因組編碼兩個高度同源的SWP73蛋白，包括SWP73a/CHC2和SWP73b/CHC1，其中CHC1也被稱作BAF60.SWP73在擬南芥葉片和花的發(fā)育中起到不同的作用，CHC2突變體表現(xiàn)出短日照早花表型，ChIP-seq數(shù)據(jù)顯示FLC(FLOWERINGLOCUSC)表達量減少.BAF60突變體植株生長弱小，葉片和花均有缺陷，表現(xiàn)出晚花以及花粉不育表型[31-33].研究表明： BAF60主要通過影響組蛋白修飾和調(diào)節(jié)基因環(huán)的形成兩種方式調(diào)節(jié)擬南芥基因表達.BAF60通過調(diào)節(jié)DNA可親和性，調(diào)節(jié)下胚軸細胞大小，抑制下胚軸的伸長[34];通過抑制H3K9乙?；?，促進H3K27三甲基化，抑制細胞分裂素兩個關(guān)鍵的合成基因IPT3(ISOPENTENYLTRANSFERASE3)和IPT7(ISOPENTENYLTRANSFERASE7)的表達，使得BAF60缺失突變體呈現(xiàn)根長變短，內(nèi)源細胞分裂素增多的表型[35].以上報道證明，BAF60對擬南芥根系、葉片生長以及開花等多發(fā)面發(fā)展至關(guān)重要.

在真核生物中MRG和BAF60同屬于表觀調(diào)控因子，兩者無論在哺乳動物或者擬南芥中都有著高度重合的調(diào)節(jié)功能，包括調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄表達、DNA修復等.

我們的研究首先通過免疫共沉淀結(jié)合質(zhì)譜分析獲得了MRG2結(jié)合蛋白，并對其中的BAF60與MRG2的關(guān)系進行深入研究.體內(nèi)外蛋白質(zhì)相互作用實驗均證實MRG2和BAF60能夠相互作用.通過分析RNA-seq和RT-qPCR數(shù)據(jù)獲悉在mrg1mrg2雙突變擬南芥植株中多個IPT基因轉(zhuǎn)錄水平升高，這與之前對于BAF60突變體材料的研究結(jié)果一致.ChIP實驗結(jié)果證明MRG2蛋白富集于IPT3基因編碼區(qū).這些結(jié)果證明了在植物細胞中MRG2和BAF60蛋白相互作用共同調(diào)控IPT3基因的轉(zhuǎn)錄表達，有助于理解組蛋白修飾識別蛋白在染色質(zhì)結(jié)構(gòu)重塑和基因表達調(diào)控方面的生物學功能.

1 材料與方法

1.1 材料

擬南芥(Arabidopisisthaliana)均為哥倫比亞生態(tài)型(Columbia， Col-0);大腸桿菌克隆菌株EscherichiacoliTOP10，大腸桿菌表達菌株E.coliRosetta DE3;農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化菌株AgrobacteriumtumefaciensGV3101;原核和植物瞬時表達載體為pGEX-4T-1、pET-30a、pXY103、pXY104、pXY105、pXY106;以上材料均為本實驗室保存.

植物培養(yǎng)土壤成分： 蛭石，珍珠巖，黑土2∶1∶2比例混合;營養(yǎng)液： 固體花無缺1∶1000溶解在水中;MS培養(yǎng)基： MS-0255 4.9g/L，蔗糖10g/L，氫氧化鉀調(diào)pH值5.7，固體培養(yǎng)基中加入9g/L瓊脂粉，118℃滅菌30min;植物培養(yǎng)條件： 相對濕度80%，恒溫22℃，光照強度100μmol/(m2·s)即適當日照條件;大腸桿菌LB培養(yǎng)基： 氯化鈉10g/L，酵母提取物5g/L，胰蛋白胨10g/L，氫氧化鉀調(diào)pH值7.0，固體培養(yǎng)基中加入14g瓊脂粉，118℃滅菌30min，選擇培養(yǎng)基含100μg/mL氨芐霉素或50μg/mL卡那霉素;農(nóng)桿菌YEB培養(yǎng)基： 蔗糖5g/L，酵母提取物1g/L，牛肉提取物5g/L，蛋白胨5g/L，硫酸鎂2mol/L，氫氧化鉀調(diào)pH值7.2，118℃滅菌30min，選擇培養(yǎng)基含25μg/mL利福平，50μg/mL卡那霉素，選擇培養(yǎng)基成分滅菌后添加.大腸桿菌培養(yǎng)條件37℃，農(nóng)桿菌培養(yǎng)條件28℃，避光.

MS-0255購自Duchefa Biochemie公司;高保真KOD酶購自Toyobo公司;質(zhì)粒提取試劑、膠回收試劑購自Axygen公司;RNA提取試劑TRIzol購自Ambion公司;反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Promega公司;SYBR，DNA限制性內(nèi)切酶，T4DNA連接酶，rTaq酶等購自TaKaRa公司;其他常規(guī)試劑購自國藥集團試劑有限公司.PCR引物合成由上海華津生物科技有限公司完成;克隆測序由上海杰李生物科技有限公司完成.

1.2 方法

1.2.1 RNA的提取和熒光定量PCR

酒精消毒擬南芥種子，鋪在滅菌后MS培養(yǎng)基上，4℃春化2d后，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，14d后，使用TRIzol試劑抽提Col-0和mrg1mrg2中的總RNA，反轉(zhuǎn)錄按照Promega試劑盒中方法進行.熒光定量PCR使用SYBR試劑，采用PCR儀(BIO-RAD，CFX96)檢測兩種植物材料中基因mRNA水平，分析基因轉(zhuǎn)錄本，引物序列如表1所示，ACTIN2用于作為基因表達內(nèi)參.

表1 定量PCR及載體構(gòu)建引物列表Tab.1 Primers for Real-time PCR and Vector contruction

1.2.2 蛋白體外結(jié)合實驗(Pull-down)

使用引物MRG2-1/MRG2-10擴增MRG2cDNA，并克隆到表達載體pET-30a中，轉(zhuǎn)化至E.coliRosetta DE3感受態(tài)中，使用引物BAF60-1/BAF60-6，BAF60-1/BAF60-2，BAF60-3/BAF60-4，BAF60-5/BAF60-6分別擴增BAF60cDNA，并克隆到表達載體pGEX4T-1中，轉(zhuǎn)化至E.coliRosetta DE3感受態(tài)中.擴大培養(yǎng)后收集菌體，用裂解緩沖液(1×PBS，0.1% Triton X-100，10%甘油，1mmol/L DTT，1mmol/L 蛋白酶抑制劑，100μg/mL溶菌酶)重懸，超聲裂解后高速離心取上清，加入清洗后的GST珠子4℃孵育2h，使用清洗緩沖液(1×PBS，10%甘油，1mmol/L DTT，1mmol/L蛋白酶抑制劑)清洗珠子4次，使用SDS-PAGE蛋白膠檢測蛋白純化結(jié)果.HIS標簽蛋白純化與上述GST標簽一致，緩沖液成分略有不同.將純化好的GST標簽蛋白用Pull-down結(jié)合緩沖液(1×PBS，0.2% NP-40，10mg/mL牛白蛋白)孵育1h，加入洗脫不帶珠子的MRG2蛋白孵育3h，使用清洗緩沖液(20mmol/L Tris-HCl pH 8.0，300mmol/L氯化鈉，0.5% NP-40)清洗珠子4次，利用商品化的抗體HIS(Abcam)進行Western Blot實驗檢驗結(jié)果，引物序列如表1所示.

1.2.3 雙分子熒光互補實驗(Bimolecular Fluorescence Complementation, BiFC)

雙分子熒光互補實驗按照Sun等[36]方法進行，使用MRG-11/MRG2-12引物擴增MRG2cDNA，并克隆到載體pXY106中.使用引物BAF60-7/BAF60-8擴增BAF60cDNA，并克隆到載體pXY104和pXY105中.將上述克隆載體轉(zhuǎn)化至AgrobacteriumtumefaciensGV3101中，YEB培養(yǎng)菌液濃度OD值到達1.0后，使用BiFC垂懸液(1mmol/L MES，10mmol/L氯化鎂，100μmol/L乙酰丁香酮，pH 5.6)重懸農(nóng)桿菌，1∶1注射滲透到4～6周齡煙草(Nicotianabenthamiana)葉片中，使用激光掃描共聚焦顯微鏡(LSM 710，ZEISS德國)觀察滲透后2～3d的熒光定位，引物序列如表1所示.

1.2.4 染色質(zhì)免疫共沉淀(Chromatin Immunoprecipitation， ChIP)

使用酒精消毒擬南芥種子，鋪在滅菌后MS培養(yǎng)基上，4℃春化2d，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14d，浸泡于固定液中(0.4mol/L蔗糖，10mmol/L Tris-HCl pH 8.0，1mmol/L EDTA，0.1mmol/L蛋白酶抑制劑，1%甲醛)，室溫條件下使用真空抽抽氣機抽15min，抽氣3次后加入2.5mol/L的甘氨酸終止反應.Millin-Q沖洗干凈之后，用紙吸干水分.用液氮冷凍將植物材料研磨為粉末，加入15～30mL ChIP裂解緩沖液Ⅰ(0.4mol/L蔗糖，10mmol/L Tris-HCl pH 8.0，10mmol/L氯化鎂，5mmol/L巰基乙醇，0.1mmol/L 蛋白酶抑制劑，1片Cocktail)，震蕩混勻，4℃旋轉(zhuǎn)孵育30min，用100μm的尼龍膜進行過濾，4℃離心20min，去上清，用裂解緩沖液Ⅱ(0.25mol/L蔗糖，10mmol/L Tris-HCl pH 8.0，10mmol/L氯化鎂，1% TritonX-100，5mmol/L巰基乙醇，0.1mmol/L蛋白酶抑制劑)重懸，4℃離心10min，去上清，加入300μL超聲緩沖液(1% SDS，50mmol/L Tris-HCl pH 8.0，10mmol/L EDTA)重懸，超聲處理90s，4℃高速離心10min，取上清，稀釋SDS濃度為0.1%，加入抗體，4℃孵育過夜，加入40μL Protein A beads，4℃孵育1h，先后用低鹽洗脫液(150mmol/L氯化鈉，1% TritonX-100，20mmol/L Tris-HCl pH 8.0，0.1% SDS，2mmol/L EDTA)，高鹽洗脫液(500mmol/L氯化鈉，1% TritonX-100，20mmol/L Tris-HCl pH 8.0，0.1% SDS，2mmol/L EDTA)，氯化鋰洗脫液(0.25mol/L氯化鋰，1%脫氧膽酸鈉溶液，1% NP-40，10mmol/L Tris-HCl pH 8.0，1mmol/L EDTA)洗脫一次，TE洗脫液(10mmol/L Tris-HCl pH 8.0，1mmol/L EDTA)洗兩次.加入500μL洗脫液(1% SDS，0.1mol/L碳酸氫鈉)，65℃水浴洗脫，收集洗脫液，加入20μL 5mol/L氯化鈉，65℃水浴過夜解交聯(lián).加入8μL 0.5mol/L EDTA，16μL Tris-HCl pH 8.0，2μL蛋白酶K，45℃消化1h.加入酚氯仿，離心后取上清，加入4μL DNAmate，1/10體積的3mol/L乙酸鈉，加入兩倍體積預冷無水乙醇，4℃高速離心20min，加入75%乙醇洗滌沉淀，熒光定量PCR方法如上所述進行.

2 結(jié) 果

2.1 MRG2相互作用蛋白的篩選

MRG是我們實驗室首先報道出的，它是擬南芥MRG蛋白家族的兩個成員，可以識別組蛋白H3K4和H3K36上的甲基化修飾.為了更加深入地研究MRG2在細胞核內(nèi)的功能，我們通過質(zhì)譜分析法獲得了一些與MRG2相互作用的蛋白序列.其中包括MRG2家族蛋白，組蛋白H2A，核轉(zhuǎn)運因子NTF2家族蛋白等(表2).與BAF60相關(guān)的兩條特殊結(jié)合肽段質(zhì)譜圖見圖1，它們的蛋白序列分別為DLNNLLANAEK和ILEDGVDPDQPGFVQK.比對結(jié)果顯示，肽段LEDGVDPDQPGFVQK在BAF60氨基酸序列235～250位上，肽段DLNNLLANAEK在BAF60氨基酸序列427～437位上.BAF60是SWI/SNF蛋白家族之一，是一種染色質(zhì)重塑復合體的重要組分，而關(guān)于擬南芥MRG家族與SWI/SNF染色質(zhì)重塑復合體的關(guān)系還沒有任何報道，因此我們將對擬南芥BAF60與MRG2的相互作用關(guān)系和功能進行深入研究.

表2 質(zhì)譜獲得MRG2結(jié)合蛋白BAF60Tab.2 Identification of BAF60 as MRG2-interacting protein by mass spectrometry experiment

2.2 體外Pull-down實驗證明MRG2與BAF60能夠相互作用

為了證明MRG2與BAF60在植物體內(nèi)外均有相互作用，我們首先構(gòu)建了BAF60全長和截短蛋白，BAF60蛋白屬于SWIB蛋白家族，該家族蛋白都有一個結(jié)構(gòu)和功能相似的結(jié)構(gòu)域，因此我們同時構(gòu)建了3個截短蛋白，分別為BAF60-1(1～314aa)、BAF60-2(315～394aa)和BAF60-3(395～534aa)，其中BAF60-2包含SWIB家族結(jié)構(gòu)域(圖2(a)).

將BAF60編碼序列克隆到pGEX4T-1原核表達載體上，在E.coliRosetta DE3菌株中進行誘導表達，使用GST融合珠子純化蛋白.獲得體外純和蛋白后，進行體外Pull-down實驗，其中HIS-MRG2蛋白與GST蛋白作為陰性對照組.實驗結(jié)果顯示MRG2與BAF60在體外有較好的相互作用(圖2(b))，我們發(fā)現(xiàn)BAF60全長可以與MRG2結(jié)合，截短蛋白BAF60-1可以與MRG2結(jié)合，證明MRG2結(jié)合于BAF60蛋白的N端，并且，質(zhì)譜結(jié)果顯示的特殊結(jié)合肽段LEDGVDPDQPGFVQK位于BAF60-1段蛋白序列中，這進一步證明了MRG2可以與BAF60結(jié)合.

2.3 雙分子熒光互補實驗證明MRG2與BAF60在植物細胞內(nèi)相互作用

為了進一步證明MRG2和BAF60能夠在植物體內(nèi)相互作用，我們構(gòu)建了pXY104-BAF60和pXY105-BAF60原核表達重組載體，將構(gòu)建好的載體以及空載體分別轉(zhuǎn)入AgrobacteriumtumefaciensGV3101中，YEB培養(yǎng)擴增，使用垂懸液重懸，并和同樣方法培養(yǎng)的pXY106-MRG2原核表達重組載體，YEB培養(yǎng)擴增.將兩種配對重懸液混合注射至煙草葉片中，避光培養(yǎng)3d.其中pXY106-MRG2/pXY104、pXY104-BAF60/pXY103和pXY106-BAF60/pXY105為陰性對照組，取煙草葉片制作玻片，使用共聚焦熒光顯微鏡觀察葉片細胞，我們發(fā)現(xiàn)在煙草葉片細胞核內(nèi)MRG2和BAF60有較好的蛋白結(jié)合，并且負對照組沒有熒光顯示(圖3).

2.4 mrg1mrg2突變體中IPT表達量上升

在上一階段中，我們已經(jīng)證明了MRG2和BAF60在植物體內(nèi)外均有較強的結(jié)合.Jégu等研究者的報道顯示，BAF60突變體材料中IPT系列基因的表達量上升，表明BAF60能夠抑制IPT基因的轉(zhuǎn)錄表達[35].為了探尋MRG2與BAF60是否共同作用于IPT系列基因，我們對實驗室已有的RNA-seq數(shù)據(jù)進行了分析，結(jié)果顯示IPT3、IPT5和IPT73種基因絕對表達量均有上升，其中IPT3和IPT7上升倍數(shù)較高(圖4(a)).

我們進一步提取了mrg1mrg2突變體植株幼苗總RNA，使用RT-qPCR方法檢測雙突變mrg1mrg2中IPT3、IPT5和IPT7的相對表達量，發(fā)現(xiàn)IPT3、IPT5和IPT73種基因的相對表達量均有上升，而IPT3和IPT7相對表達量顯著上升，這與RNA-seq數(shù)據(jù)變化一致，(圖4(b)).檢測還發(fā)現(xiàn)雙突變mrg1mrg2中BAF60基因的表達量幾乎不變(圖4(c))，表明MRG1/2的功能缺失不影響B(tài)AF60基因的轉(zhuǎn)錄表達，猜測MRG2和BAF60在植物體內(nèi)可能通過蛋白相互作用共同影響IPT基因的表達.

2.5 ChIP分析MRG2結(jié)合于IPT基因組區(qū)域

為了證實MRG2確實參與了IPT3、IPT5和IPT7基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，我們對野生型和35S：MRG2-FLAG/Col-0過表達于野生型背景的擬南芥材料進行染色體免疫共沉淀實驗(ChIP).提取14d擬南芥幼苗的核蛋白，超聲破碎，把染色質(zhì)的DNA消化成片段，使用FLAG抗體沉淀MRG2-FLAG融合蛋白，提取MRG2-FLAG結(jié)合的DNA，在目的基因IPT3的5′UTR區(qū)、基因內(nèi)和3′UTR共選取10個區(qū)段，使用q-PCR技術(shù)檢測各段DNA的含量.ChIP-PCR結(jié)果顯示(圖5)，在Col-0背景下，MRG2富集程度沒有明顯變化，而在過表達植物材料35S：MRG2-FLAG/Col-0背景下，MRG2在第4、第5、第8區(qū)段有明顯富集.該區(qū)段在IPT3基因內(nèi)部區(qū)，與BAF60調(diào)節(jié)H3K4me3區(qū)域一致，推測MRG2很可能與BAF60共同調(diào)節(jié)IPT3基因轉(zhuǎn)錄表達[35].

3 討 論

表觀遺傳學調(diào)控是指在不改變DNA序列的情況下調(diào)節(jié)染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)和狀態(tài)，調(diào)控基因的表達，主要包括組蛋白修飾，染色質(zhì)重塑，DNA甲基化，組蛋白變體等[37].MRG家族蛋白和BAF60復合物蛋白均屬于表觀調(diào)控因子.人類MRG15可以結(jié)合或者識別甲基化的H3K4，H3K36，通過招募轉(zhuǎn)錄因子或者直接參與調(diào)控目的基因轉(zhuǎn)錄[13-15，38].在組蛋白乙?；矫?，MRG15是組蛋白乙酰化轉(zhuǎn)移酶NuA4復合物的成分之一，主要通過與乙酰化酶和乙酰轉(zhuǎn)移酶相互作用，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄[12，39].BAF60屬于SWI/SNF蛋白家族，該家族可以識別組蛋白乙?；?，將染色質(zhì)重塑機制和組蛋白修飾聯(lián)系在一起，協(xié)同發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用[22].在人類中，MRG15與hBRM都具有抑制基因轉(zhuǎn)錄的功能[14，40]，也都具有DNA修復的功能[38，41]，可以說兩個蛋白在基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控方面都發(fā)揮了至關(guān)重要的功能.

在高等植物中，MRG2能夠參與擬南芥開花通路的調(diào)控，MRG2識別FT啟動子區(qū)域H3K36me3招募轉(zhuǎn)錄因子CO，促進FT基因轉(zhuǎn)錄表達，MRG2的缺失導致擬南芥晚花表型[17-18].十分巧合的是，BAF60突變體材料也表現(xiàn)為晚花，研究認為BAF60通過調(diào)節(jié)組蛋白標記修飾，包括促進H3K27甲基化，抑制H3K9乙?；?，以及直接調(diào)節(jié)H2A.Z沉積，染色質(zhì)凝結(jié)成環(huán)抑制FLC的表達[42-43].BAF60還能調(diào)節(jié)擬南芥根系和根尖分生組織的發(fā)展，促進分生組織中細胞的周期循環(huán)，通過直接抑制H3K4me3的富集，促進H3K27me3的富集，作用于靶基因調(diào)控植物生長發(fā)育過程[35].本研究中發(fā)現(xiàn)了MRG2和BAF60蛋白在植物體內(nèi)相互作用，而在mrg1mrg2雙突變體材料中，BAF60的轉(zhuǎn)錄沒有發(fā)生變化，表明MRG2不影響B(tài)AF60基因的轉(zhuǎn)錄表達，暗示了MRG2和BAF60蛋白很可能是通過蛋白的協(xié)同作用調(diào)控基因表達.盡管目前還沒有關(guān)于MRG2抑制H3K4me3的功能報道，但是人類MRG15早已被報道能夠通過去甲基化下調(diào)H3K4甲基化水平，維持一個低甲基化狀態(tài)，維持正常轉(zhuǎn)錄[14].擬南芥MRG2是否影響H3K4甲基化修飾是我們以后研究的重點.

此外，我們不僅發(fā)現(xiàn)了MRG2和BAF60蛋白間的作用關(guān)系，而且還發(fā)現(xiàn)了它們共同調(diào)控的靶基因IPT3.已有文獻報導，BAF60通過抑制H3K4me3，促進H3K27me3以及在IPT3/IPT7基因啟動子區(qū)域成環(huán)的方式抑制IPT3/IPT7基因的表達[35].在mrg1mrg2雙突變材料中，qRT-PCR實驗和RNA-seq數(shù)據(jù)庫中都顯示IPT基因表達上升，MRG2和BAF60都能夠負調(diào)控IPT基因的轉(zhuǎn)錄表達.報道中還指出BAF60調(diào)節(jié)IPT3/IPT7基因內(nèi)部區(qū)H3K4me3程度，而MRG2已被證明是H3K4me3的閱讀蛋白，ChIP實驗證明，MRG2正好在IPT3基因內(nèi)部區(qū)富集，這些實驗證據(jù)也進一步證實了MRG2、BAF60和H3K4me3在調(diào)控IPT基因表達的方面具有非常密切的關(guān)系.但是，要證明MRG2是否真正參與BAF60調(diào)控IPT基因表達的通路僅有以上實驗證據(jù)是不足的，更需要遺傳材料方面的實驗證據(jù).在以后的研究中我們需要構(gòu)建MRG家族與BAF60家族的多突變體遺傳材料，統(tǒng)計多方面的植物生長表型數(shù)據(jù)，從而揭示MRG2與BAF60調(diào)控植物生長發(fā)育的分子機制.