外傷性癲癇生物標(biāo)志物的研究進(jìn)展

賈孝 ，周鳳娟 ，代濱濱 ，王旭 ，楊天潼

（1.中國政法大學(xué)證據(jù)科學(xué)教育部重點實驗室，北京 100088；2.司法文明協(xié)同創(chuàng)新中心，北京 100088）

外傷性癲癇（post traumatic epilepsy，PTE）以反復(fù)性外傷后癲癇發(fā)作（post traumatic seizures，PTS）為特征，是創(chuàng)傷性腦損傷（traumatic brain injury，TBI）的嚴(yán)重并發(fā)癥[1]。根據(jù)癲癇發(fā)作的時間，PTS通常被分為3類：（1）即刻PTS，發(fā)生在傷后24 h內(nèi)；（2）早期PTS，發(fā)生在傷后1周內(nèi)；（3）晚期PTS，發(fā)生在傷后1周[2]。目前，已有研究[2]證實，大腦遭受物理性損傷所致的異常放電和刺激所致的閾值改變可能是即刻、早期PTS的原因。此后，隨著出血、水腫、能量代謝障礙、離子環(huán)境破壞、膠質(zhì)細(xì)胞超負(fù)荷和谷氨酸釋放增加等病理生理變化，PTS持續(xù)發(fā)生[3]。原發(fā)性腦損傷和繼發(fā)性腦損傷共同導(dǎo)致的病理生理過程持續(xù)一段時間后，腦損傷區(qū)腦組織分子結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變，繼而出現(xiàn)膠質(zhì)細(xì)胞不良增生、神經(jīng)突觸信號傳導(dǎo)異常、興奮性和抑制性突觸傳導(dǎo)失衡，并造成神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)重組，最終導(dǎo)致持續(xù)性、無端反復(fù)性PTS[1]。這種晚期的癇性發(fā)作即真正意義上的PTE。因此，在PTE發(fā)生和發(fā)展的過程中，也伴隨有分子結(jié)構(gòu)和功能的變化，并為PTE的鑒定提供了客觀的生物標(biāo)志物。

兩院三部聯(lián)合發(fā)布的《人體損傷致殘程度分級》將PTE的殘疾評定分為3個等級。從鑒定標(biāo)準(zhǔn)條款規(guī)定的具體內(nèi)容來看，PTE的殘疾程度應(yīng)根據(jù)被鑒定人的癲癇發(fā)作類型、發(fā)作次數(shù)及藥物療效進(jìn)行綜合評定。然而在法醫(yī)學(xué)鑒定實踐中遇到PTE的客觀評定仍然是一大挑戰(zhàn)，原因如下：（1）雖然腦電圖是診斷PTE的客觀依據(jù)，但鑒定實踐中，有很多被鑒定人限于條件沒有及時進(jìn)行腦電圖檢查，同時由于大部分癲癇發(fā)作地點在家中，到醫(yī)院復(fù)診時已無癲癇發(fā)作表現(xiàn)，獲得發(fā)作期有意義的腦電圖檢查非常困難。因此，在鑒定實踐中，有相當(dāng)數(shù)量的鑒定缺乏客觀的腦電圖檢查支持。（2）影像學(xué)檢查也是診斷PTE的客觀依據(jù)之一，但影像學(xué)檢查結(jié)果尚不能與PTE完全對應(yīng)。在鑒定實踐中，PTE僅是顱腦損傷結(jié)局的一種，并不是顱腦損傷的唯一轉(zhuǎn)歸，雖然有軟化灶等影像學(xué)表現(xiàn)，但并不意味著一定是PTE。因此，影像學(xué)診斷作為PTE客觀診斷依據(jù)仍具有一定的局限性。如果能篩選出客觀的生物標(biāo)志物應(yīng)用于PTE鑒定，或許能夠得到更為客觀、準(zhǔn)確的鑒定意見。在癲癇研究領(lǐng)域，生物標(biāo)志物有很多種類，但從法醫(yī)學(xué)鑒定實踐角度出發(fā)，血液和腦脊液易于獲得，可供檢測的項目也比較豐富。因此，本文就血液和腦脊液（cerebrospinal fluid，CSF）中的生物標(biāo)志物進(jìn)行綜述，為研究PTE發(fā)生發(fā)展過程中的病理學(xué)變化提供借鑒，同時為PTE的客觀評定提供研究基礎(chǔ)和思路。

1 神經(jīng)炎癥性生物標(biāo)志物

神經(jīng)炎癥是PTE發(fā)生的主要病理生理學(xué)機制之一[4]。中、重度顱腦損傷后，損傷區(qū)的小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞激活，外周免疫細(xì)胞遷移，體循環(huán)和腦組織分泌大量的炎癥因子，導(dǎo)致神經(jīng)元結(jié)構(gòu)受損、突觸重塑、神經(jīng)元興奮性增強進(jìn)而誘發(fā)PTE[5]。

tau蛋白是一種微管結(jié)構(gòu)相關(guān)蛋白，通過參與突觸傳遞和維持微管穩(wěn)定性保證神經(jīng)元的正常功能[6]。目前，已有研究[6-7]表明，實驗TBI大鼠和TBI后的傷者腦組織中均出現(xiàn)了tau蛋白過度磷酸化。而在中、重度TBI后的傷者外周血中，總tau蛋白水平明顯高于正常人[8]。研究[6]表明，過度磷酸化的tau蛋白可引發(fā)神經(jīng)元結(jié)構(gòu)網(wǎng)絡(luò)重組（如苔蘚纖維發(fā)芽）、海馬顆粒細(xì)胞層的神經(jīng)元異常遷移、NR2B受體介導(dǎo)的谷氨酸釋放等一系列異常，這些異常與PTE密切相關(guān)。LIU等[9]研究發(fā)現(xiàn)，抑制tau蛋白的過度磷酸化，PTE發(fā)作也同時被抑制，該研究結(jié)果不但證明了tau蛋白與PTE的相關(guān)性，同時也提示我們深入研究PTE中tau蛋白的含量變化，可為法醫(yī)學(xué)PTE殘疾評定提供客觀的生物標(biāo)志物。

炎癥因子［包括白細(xì)胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）、IL-6和腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）］與神經(jīng)炎癥密切相關(guān)。實驗小鼠腦組織的IL-1β水平在TBI后可急劇升高，一般于傷后4d達(dá)到峰值[10]。IL-1β/IL-1R炎癥信號通路可通過介導(dǎo)Ca2+、γ-氨基丁酸和谷氨酸代謝等途徑導(dǎo)致神經(jīng)元過度興奮。同時，通過激活星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞形成神經(jīng)瘢痕，釋放神經(jīng)毒性介質(zhì)，導(dǎo)致神經(jīng)元丟失。該通路明顯增強血腦屏障（blood-brain barrier，BBB）的通透性，募集更多的外周白細(xì)胞至腦組織中促使癲癇發(fā)作。DIAMOND等[11]已經(jīng)證實人體CSF與血清中IL-1β比例越高，PTE發(fā)作的頻率越高。

高遷移率族B1（high mobility group B1，HMGB1）蛋白是一種細(xì)胞內(nèi)DNA結(jié)合蛋白，可通過激活膠質(zhì)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和外周免疫球蛋白引發(fā)免疫反應(yīng)[12]。HMGB1與多種受體［如Toll樣受體（Toll-like receptor，TLR）2和TLR4］結(jié)合，導(dǎo)致絲裂原活化蛋白激酶磷酸化，進(jìn)而活化核因子活化B細(xì)胞κ輕鏈增強子（nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells，NF-κB）信號通路，調(diào)節(jié)炎癥因子（包括IL-1α、IL-1β、IL-6、TNF-α等）的表達(dá)，從而介導(dǎo)神經(jīng)炎癥誘發(fā)PTE。另外，有研究[13]結(jié)果表明，在獲得性癲癇動物模型中，服用靶向氧化應(yīng)激藥物的大鼠可表現(xiàn)出HMGB1的阻斷，從而降低癲癇發(fā)作頻率。與HMGB1蛋白相似，熱休克蛋白70（heat shock protein 70，HSP70）常與 TLR2、TLR4結(jié)合介導(dǎo)神經(jīng)炎癥[14]。da SILVA FIORIN等[15]研究表明，在神經(jīng)元損傷2周后，癲癇組實驗大鼠HSP70免疫表達(dá)增加，而HSP70可通過抑制早期炎癥和氧化應(yīng)激從而降低癲癇的發(fā)作頻率。因此，他們預(yù)測HSP70具有神經(jīng)保護(hù)功能從而可以有效治療PTE，但該結(jié)果仍需進(jìn)一步驗證。綜上所述，HMGB1、HSP70均具有作為候選生物標(biāo)志物應(yīng)用于法醫(yī)學(xué)實踐參與PTE殘疾評定的潛在價值。

2 血管損傷性生物標(biāo)志物

出血和血腫是PTE發(fā)生損傷的基礎(chǔ)[16]。TBI后會出現(xiàn)各種不同程度的腦血管損傷，如腦微血管出血增加、血腦屏障通透性增加、硬腦膜下血腫和腦實質(zhì)內(nèi)出血等。DADAS等[17]指出，血腦屏障破壞是PTE的重要病理生理學(xué)機制，其中水通道蛋白4（aquaporin 4，AQP4）發(fā)揮了關(guān)鍵作用。AQP4是星形膠質(zhì)細(xì)胞中主要的水通道蛋白，對于維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)和細(xì)胞內(nèi)離子平衡至關(guān)重要。據(jù)報道[18]，TBI后實驗大鼠血清和CSF中AQP4均增加，水分子穩(wěn)態(tài)破壞形成腦水腫，血腦屏障通透性升高。另外，DADAS等[17]還指出，在腦組織中，AQP4介導(dǎo)的水分子運動與鉀離子（K+）傳導(dǎo)相偶聯(lián)。因此，AQP4可能通過介導(dǎo)K+通道，破壞血腦屏障進(jìn)而誘發(fā)PTE。

轉(zhuǎn)化生長因子β（transforming growth factors-β，TGF-β）是一種參與細(xì)胞分化、凋亡等多種生命進(jìn)程的生長因子[19]。在獲得性癲癇實驗動物模型中，白蛋白與激活素受體樣激酶5（activin receptor-like kinase 5，ALK5）受體結(jié)合，啟動星形膠質(zhì)細(xì)胞中的TGF-β信號通路，介導(dǎo)血腦屏障破壞和興奮性突觸傳遞[5]。此外，TGF-β還可通過調(diào)控星形膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的促炎因子、谷氨酸的釋放，改變水離子通道誘發(fā)PTE[5]。綜上所述，AQP4、TGF-β可成為司法鑒定實踐中鑒定PTE的潛在生物標(biāo)志物。

3 結(jié)構(gòu)性生物標(biāo)志物

神經(jīng)細(xì)胞的結(jié)構(gòu)性改變是導(dǎo)致PTE發(fā)生的重要機制，PTE的腦組織常伴有多種結(jié)構(gòu)變化，包括神經(jīng)元丟失、細(xì)胞增殖（如星形膠質(zhì)細(xì)胞增生）和突觸重組等。因此，TBI后神經(jīng)細(xì)胞釋放的各種特異性蛋白是診斷PTE的潛在生物標(biāo)志物。腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）作為中間神經(jīng)元發(fā)育、維持、可塑性和抑制性傳遞的關(guān)鍵營養(yǎng)因子，與酪氨酸激酶受體B（tyrosine kinase receptor B，trkB）相互作用介導(dǎo)γ氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）能的傳遞。GU等[20]研究表明，PTE實驗小鼠腦組織中的BDNF水平降低，導(dǎo)致GABA能下降；BDNF/trkB信號傳遞受阻可導(dǎo)致中間神經(jīng)元結(jié)構(gòu)異常。隨后，他們進(jìn)一步證實，在注射trkB小分子激動劑LM22A-4進(jìn)行治療的實驗小鼠體內(nèi)，增強BDNF/trkB信號傳遞會引起GABA的上升，降低癲癇的發(fā)作次數(shù)和程度，提示BDNF具有抑制PTE的作用[21]。研究[21]還表明，BDNF與興奮性傳遞、苔蘚纖維發(fā)芽息息相關(guān)，這些機制均可能參與PTE的發(fā)生。因此，BDNF可能是法醫(yī)學(xué)實踐中靈敏性及特異性均好的PTE鑒定生物標(biāo)志物。

NEUBERGER等[22]研究證實，TBI后神經(jīng)發(fā)生會增加神經(jīng)元興奮性和癲癇易感性，而血管內(nèi)皮生長因子A（vascular endothelial growth factor-A，VEGF-A）與神經(jīng)發(fā)生密切相關(guān)。反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞增生作為癲癇發(fā)作的高危因素[23]，可通過控制炎癥細(xì)胞進(jìn)入病灶、重建血腦屏障、降低氧化應(yīng)激進(jìn)而介導(dǎo)神經(jīng)炎癥，導(dǎo)致PTE的發(fā)生。因此，影響星形膠質(zhì)細(xì)胞增生的因素，如表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）、成纖維細(xì)胞生長因子（fibroblast growth factor，F(xiàn)GF）和內(nèi)皮素1（endothelin-1，ET-1）等均可作為鑒定PTE的候選生物標(biāo)志物[24]。

4 代謝性生物標(biāo)志物

人類大腦消耗的能量占機體總能量的20%，其中80%～90%的能量供應(yīng)于神經(jīng)元活動。TBI后，大腦的能量代謝平衡遭到破壞。在星形膠質(zhì)細(xì)胞-神經(jīng)元乳酸穿梭（astrocyte-neuron lactate shuttle，ANLS）模型中，星形膠質(zhì)細(xì)胞作為主要代謝支持細(xì)胞，可通過轉(zhuǎn)運蛋白參與谷氨酸的攝取，介導(dǎo)神經(jīng)元興奮性傳遞[25]。因此，上述調(diào)節(jié)星形膠質(zhì)細(xì)胞的相關(guān)因子可能成為潛在的代謝性生物標(biāo)志物。此外，已有研究[26]證實，腦葡萄糖代謝變化是TBI后許多不良轉(zhuǎn)歸（如PTE）的病理生理學(xué)基礎(chǔ)。癲癇發(fā)作必然會導(dǎo)致葡萄糖代謝增加，介導(dǎo)氧化應(yīng)激進(jìn)而誘發(fā)PTE。因此，氧化應(yīng)激的生物標(biāo)志物，如羥基壬烯酸（hydroxynonenal，HNE）、缺氧誘導(dǎo)因子1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）和超氧化物歧化酶 2（superoxide dismutase 2，SOD2）均為潛在的代謝性生物標(biāo)志物。并且該研究[26]表明，臨床實踐中可通過干擾葡萄糖代謝的靶點治療PTE，提示代謝性生物標(biāo)志物可作為PTE的生物分子標(biāo)志物，但目前仍需尋找更多與PTE相關(guān)的可用于客觀評定殘疾的代謝性生物標(biāo)志物。

5 總 結(jié)

PTE生物標(biāo)志物的篩選面臨一定的挑戰(zhàn)，作為一種客觀的診斷和鑒定標(biāo)志物，應(yīng)具備以下3個特點：（1）高度特異性、準(zhǔn)確性和可檢測性；（2）分析方法可靠且可重復(fù)測定；（3）能提供診斷和預(yù)后信息，以便法醫(yī)學(xué)和臨床工作者觀察、診斷、判斷預(yù)后。

盡管生物標(biāo)志物在診斷、治療及鑒定應(yīng)用中有良好的研究前景，但仍有以下局限性：

（1）時間局限性。PTE可在TBI后不同時間點出現(xiàn)癲癇發(fā)作，目前尚不清楚上述病理生理學(xué)變化出現(xiàn)的準(zhǔn)確時間，且即刻、早期PTE和晚期PTE的發(fā)病機制不同，因此，即刻、早期和晚期PTE中的潛在生物標(biāo)志物可能存在差異。此外，一些神經(jīng)炎癥性生物標(biāo)志物半衰期相對較短，可供檢測的時間窗較短。

（2）樣本局限性。在實際工作中，血清生物標(biāo)志物具有可重復(fù)性、無創(chuàng)等優(yōu)勢，無疑是最好的選擇。然而，一部分生物標(biāo)志物可能只存在于CSF中，在血清或血漿中含量甚微，因此部分生物標(biāo)志物的實際應(yīng)用會受限。此外，中、重度TBI后導(dǎo)致血腦屏障開放，CSF中特異的生物標(biāo)志物進(jìn)入外周血，稀釋了其在CSF中的濃度；中、重度TBI后出現(xiàn)腦水腫也會改變生物標(biāo)志物在CSF中的濃度。因此，將CSF中生物標(biāo)志物應(yīng)用到PTE鑒定實踐中，仍存在一定的困難。

（3）實驗局限性。在實踐中，年齡、性別是PTE的危險因素，然而現(xiàn)有的PTE動物模型實驗往往未考慮實驗動物的年齡和性別對PTE的潛在疊加影響。因此，通過動物實驗確定篩選出的生物標(biāo)志物并將其應(yīng)用到人體PTE診斷中，仍需要大量的驗證工作。

盡管將生物標(biāo)志物應(yīng)用于PTE鑒定實踐存在局限性，但這些局限性也是PTE領(lǐng)域的研究方向。目前，生物標(biāo)志物已廣泛應(yīng)用于腫瘤及非腫瘤疾病的臨床診斷和治療，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的日趨成熟，生物標(biāo)志物在損傷、死亡等法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域也必然會成為研究的新興熱點。PTE生物標(biāo)志物的篩選和確定，對PTE發(fā)病機制、預(yù)防、診斷、治療及鑒定具有重要的臨床和法醫(yī)學(xué)意義。