國產(chǎn)全自動HIV-1 核酸定量檢測試劑盒的性能評價

楊 勇，蒲 偉，羅小虎

（巴中市疾病預(yù)防控制中心，四川 巴中 636600）

獲得性免疫缺陷綜合征（acquired immune deficiency syndrome，AIDS）是人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）感染引起的一種免疫缺陷性疾病[1]，治療困難極大，極易引起多種并發(fā)癥，最終導(dǎo)致患者死亡[2]。因此，如何有效控制AIDS流行是目前醫(yī)學(xué)界面臨的難題。由于目前還沒有能有效治療AIDS及預(yù)防HIV感染的藥物，因此現(xiàn)在只能通過早期篩查，查找傳染源，從根本上切斷HIV的傳播途徑，以有效避免AIDS的傳播[3]。HIV抗體檢測是診斷HIV感染的首選方法。HIV核酸檢測可作為輔助檢查手段使用，可用于HIV感染過程、病情進展及藥物療效的評估[4]。人類免疫缺陷病毒1型（human immunodeficiency virus-1，HIV-1）核酸檢測方法能夠定量檢測患者的HIV-1載量，準確反映體內(nèi)病毒含量，對于疾病診斷及療效評估具有重要意義[5]。雖然HIV-1核酸定量檢測試劑早已用于臨床，但大部分試劑為進口，價格昂貴，而且需要昂貴的儀器設(shè)備，導(dǎo)致檢測費用居高不下，難以在基層醫(yī)院及基層疾病控制中心推廣[6-7]。因此，開發(fā)檢測性能與進口試劑盒相當?shù)膰a(chǎn)試劑盒迫在眉睫[8]。目前，國內(nèi)已有廠商自主研發(fā)了一些HIV-1核酸定量檢測試劑盒，并用于臨床檢測，但準確性、敏感性尚不明確。本研究擬對國產(chǎn)全自動HIV核酸檢測試劑的主要性能進行評估，并與進口試劑進行比對，探討其臨床應(yīng)用的可行性。

1 材料和方法

1.1 樣本

收集巴中市疾病預(yù)防控制中心2018年2—5月210例臨床樣本，其中男127例、女83例，年齡15～68歲。感染HIV-1的樣本190例，非HIV-1感染樣本20例。所有樣本均采用乙二胺四乙酸二鉀抗凝，1 000×g離心15 min，吸取上層血漿待測。所有樣本均無重度溶血、變質(zhì)及反復(fù)凍融等情況。

1.2 儀器與試劑

靈敏度/定量參考品（HIV-1 RNA為 4.04×105IU/mL）及參考品稀釋液購自中國食品藥品檢定研究院（批號220017-20140930）。DYSW-AUTO48全自動液體處理工作站及Line-Gene 9600 Plus實時熒光定量PCR檢測系統(tǒng)均購自東北制藥集團遼寧生物醫(yī)藥有限公司。cobas AmpliPrep/cobas Taq-Man全自動核酸提取純化及實時熒光定量PCR檢測系統(tǒng)購自瑞士羅氏公司。待測試劑為NEPG全自動HIV-1核酸定量檢測試劑盒（簡稱國產(chǎn)NEPG HIV-1試劑，批號2018001），購自東北制藥集團遼寧生物醫(yī)藥有限公司。參比試劑為cobas AmpliPrep cobas TaqMan HIV-1 Test v2.0試劑盒（簡稱進口HIV-1試劑，批號Y06193），購自瑞士Roche公司。2種試劑盒的技術(shù)參數(shù)見表1。

表1 國產(chǎn)NEPG HIV-1試劑和進口HIV-1試劑的技術(shù)參數(shù)

1.3 方法

1.3.1 準確性 將靈敏度/定量參考品用參考品稀釋液稀釋成低（5.0×102IU/mL）、中（5.0×103IU/mL）、高（5.0×104IU/mL）3個濃度，采用國產(chǎn)NEPG HIV-1試劑檢測，每個濃度重復(fù)檢測3次，計算均值。將檢測結(jié)果用lg函數(shù)轉(zhuǎn)換成對數(shù)值。絕對偏差=測定結(jié)果均值的對數(shù)值-預(yù)期值的對數(shù)值。根據(jù)我國醫(yī)藥行業(yè)標準YY/T 1182—2010中的要求，絕對偏差≤±0.5個對數(shù)數(shù)量級為符合要求。

1.3.2 靈敏度 將靈敏度/定量參考品用參考品稀釋液稀釋至200、100、50、25 IU/mL，采用國產(chǎn)NEPG HIV-1試劑檢測，每個濃度重復(fù)檢測3次，計算可檢出濃度。

1.3.3 對照試驗 分別采用待測試劑和參比試劑雙盲檢測同份一血漿樣本，評價2種試劑的符合率和一致性。待測試劑的定性結(jié)果判斷：如果擴增曲線不呈現(xiàn)S型曲線或循環(huán)閾值（cycle threshold，Ct）為0，同時內(nèi)標檢測為陽性，報告為HIV-1 RNA陰性；除此之外，其他情況加上內(nèi)標檢測為陽性均判定為HIV-1 RNA陽性。

1.3.4 單位換算 根據(jù)基于核酸技術(shù)的HIV-1 RNA世界衛(wèi)生組織第1代國際標準品（NIBSC 97/656）[9]，1拷貝/mL相當于1.67 IU/mL。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析。呈正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以±s表示，組間比較采用配對t檢驗。采用Kappa檢驗評價2種試劑定性結(jié)果的一致性。采用線性回歸分析評價2種試劑定量結(jié)果的相關(guān)性。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 準確性分析

低、中、高濃度樣本測定結(jié)果的絕對偏差分別為0.05、0.08、-0.06，均符合要求。見表2。

表2 國產(chǎn)NEPG HIV-1試劑的準確性

2.2 靈敏度分析

濃度為200、100、50 IU/mL的樣本各檢測3次，結(jié)果均為陽性。濃度為25 IU/mL的樣本檢測3次，有1次未檢出。因此，國產(chǎn)NEPG HIV-1試劑的靈敏度為50 IU/mL（約30 拷貝/mL）。見表3。

表3 國產(chǎn)NEPG HIV-1試劑的靈敏度

2.3 對照試驗定性結(jié)果分析

分別采用國產(chǎn)NEPG HIV-1試劑和進口HIV-1試劑檢測210例樣本，檢測結(jié)果均為陽性的有164例，均為陰性的有46例，2種試劑定性結(jié)果的符合率均為100.00%，定性結(jié)果一致（Kappa值=1.00）。見表4。

2.4 對照試驗定量結(jié)果分析

將164例陽性樣本檢測結(jié)果以lg函數(shù)轉(zhuǎn)換成對數(shù)值，評價定量結(jié)果的相關(guān)性。線性回歸分析結(jié)果顯示，2種試劑檢測HIV-1載量的相關(guān)性良好（r=0.953），見圖1。2種試劑之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表4 2種試劑定性結(jié)果的一致性比較例（%）

圖1 國產(chǎn)NEPG HIV-1試劑與進口HIV-1試劑的相關(guān)性分析

由于核酸定量試劑在最低檢測限和最低定量限區(qū)域內(nèi)的檢測結(jié)果可能會出現(xiàn)偏差，所以根據(jù)低病毒血癥的HIV-1載量（50～1 000拷貝/mL），并結(jié)合國內(nèi)外試劑的檢測限和定量限，將定量檢測結(jié)果的低值區(qū)域定為20～1 000拷貝/mL。164例陽性樣本中低值樣本為31例。對2種試劑檢測低值樣本的結(jié)果進行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示相關(guān)性較好（r=0.823）。

3 討論

本研究使用的DYSW-AUTO48全自動液體處理工作站采用納米磁珠分離技術(shù)從樣本中分離、純化核酸。從加樣開始，全自動完成樣本裂解、核酸吸附、清洗、洗脫和試劑配置，無需人工干預(yù)，有效避免了人為因素的干擾，還能減少操作人員與臨床樣本的接觸，降低生物安全風險，且成本較低、操作簡便。

本研究結(jié)果顯示，國產(chǎn)NEPG HIV-1試劑與進口HIV-1試劑的檢測符合率為100.00%，相關(guān)性良好（r=0.953），低值樣本的相關(guān)性也較好（r=0.823），由此說明國產(chǎn)NEPG HIV-1試劑與進口HIV-1試劑檢測結(jié)果的一致性良好。國產(chǎn)NEPG HIV-1試劑的靈敏度為50 IU/mL（約30拷貝/mL），樣本用量較少（400 μL），與廠商聲明（檢測下限為50 IU/ml）一致。由于部分HIV-1感染者在抗病毒治療過程中會出現(xiàn)持續(xù)性低病毒血癥，病毒載量為50～1 000拷貝/mL，與耐藥發(fā)生、病毒學(xué)檢測失敗、持續(xù)性炎癥、微生物移位、高死亡率等密切相關(guān)[10]，所以HIV檢測試劑的高靈敏度性能具有重要的臨床意義。

綜上所述，國產(chǎn)NEPG HIV-1試劑可以滿足臨床應(yīng)用要求，檢測成本較低，檢測性能與進口HIV-1試劑相當，可用于HIV-1感染的早期診斷、疑難樣本的輔助診斷及AIDS的病情監(jiān)測等。