SNP array 在頸項透明層增厚胎兒產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用

李 瑞，時盼來，王愛玲，王建紅，肖艷華，孔祥東

（1.焦作市婦幼保健院醫(yī)學(xué)遺傳與產(chǎn)前診斷中心，河南 焦作 454000；2.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院遺傳與產(chǎn)前診斷中心，河南 鄭州 450000）

近年來，在產(chǎn)前超聲檢查中，孕11～13+6周胎兒頸項透明層（nuchal translucency，NT）厚度被作為早期發(fā)現(xiàn)胎兒染色體異常，特別是非整倍體異常敏感且特異的指標之一[1-2]。大多數(shù)NT增厚胎兒在染色體核型正常的情況下預(yù)后良好，但少部分胎兒出生后合并神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育異常或遺傳綜合征[3-4]，可能與染色體核型分析技術(shù)難以檢測染色體亞微觀結(jié)構(gòu)異常有關(guān)。

染色體微陣列分析（chromosomal microarray analysis，CMA）可檢測常規(guī)核型分析不能分辨的拷貝數(shù)變異（copy number variation，CNV），特別在染色體微缺失微重復(fù)檢出方面有出色的表現(xiàn)[5]。單核苷酸多態(tài)性微陣列技術(shù)（single nucleotide polymorphism array，SNP array）作為CMA技術(shù)中的一種，除可檢測CNV外，還可檢測出單親二體、三倍體（或其他多倍體）及一定水平的嵌合體。目前已有研究報道CMA可進一步檢出0%～8%的具有臨床意義的染色體微缺失和微重復(fù)[6]，但有關(guān)CMA在NT增厚胎兒中應(yīng)用的報道較少，確切的臨床價值尚待大樣本數(shù)據(jù)支持。且不同研究對NT厚度截取的標準不同，尤其缺乏臨界性NT增厚（2.5～3.5 mm）胎兒相關(guān)研究數(shù)據(jù)。因此，本研究收集433份樣本，探討SNP array在孕11～13+6周超聲顯示胎兒NT增厚，特別是臨界性NT增厚中的臨床應(yīng)用價值。

1 材料和方法

1.1 研究對象

選取2016年4月—2018年10月鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院產(chǎn)前診斷中心孕11～13+6周超聲顯示胎兒NT增厚（厚度≥2.5 mm），并接受產(chǎn)前診斷的孕婦431例，胎兒433例，其中426例單胎妊娠，3例雙胎妊娠（1例雙胎妊娠1個胎兒進行檢測，2例雙胎妊娠2個胎兒均進行檢測），雙胎妊娠均為雙絨毛膜雙羊膜腔。孕婦年齡20～45歲，平均（29.75±4.57）歲，孕周11+3～24+5周，平均（16.48±3.49）周。通過絨毛穿刺或羊膜腔穿刺獲取胎兒絨毛或羊水細胞進行產(chǎn)前診斷，絨毛標本121例，羊水標本312例。所有標本均采用SNP array進行全基因組染色體高分辨率掃描分析，同時應(yīng)用多重定量熒光聚合酶鏈反應(yīng)（quantitation fluorescence polymerase chain reaction，QF-PCR）快速檢測常見的21、18、13及性染色體數(shù)目異常。本研究經(jīng)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準（KS-2018-KY-36），所有孕婦均經(jīng)臨床咨詢并簽署知情同意書。

1.2 分組

（1）根據(jù)NT厚度分為4個組：A組NT厚度2.5～3.4 mm，共194例（44.80 %）；B組NT厚度3.5～4.4 mm，共132例（30.48 %）；C組NT厚度4.5～5.4 mm，共53例（12.24 %）；D組NT厚度≥5.5 mm，共54例（12.47 %）。（2）根據(jù)胎兒產(chǎn)前超聲的異常類型分為2個組，單純性NT增厚組373例（86.14 %）；合并其他超聲異常組60例（13.86 %），其中頸部水囊瘤21例、全身水腫8例、胎兒鼻骨缺失或發(fā)育不良6例、合并α波異常4例、其他單項異常17例；2項或2項以上異常4例。

1.3 標本收集

121例（27.94 %，121/433）孕婦（孕11～14周）在超聲引導(dǎo)下經(jīng)腹行絨毛膜穿刺術(shù)，對所得宮腔內(nèi)組織進行挑選，去除血塊、胎盤等組織，挑出1～2根長約5 mm的絨毛在0.9%氯化鈉溶液中洗凈。312例（72.06 %，312/433）孕婦（孕16～24周）在超聲引導(dǎo)下經(jīng)羊膜腔穿刺術(shù)獲取羊水20 mL。對自愿接受染色體變異片段來源追蹤的胎兒父母，抽取其2 mL外周血于乙二胺四乙酸二鉀真空采血管，行父母驗證，用于鑒定CNV的性質(zhì)。

1.4 基因組DNA提取

絨毛組織與外周血采用Eppendorf epMotion 5075 m工作站（德國Eppendorf公司）相應(yīng)DNA提取程序提取全基因組DNA；羊水細胞使用基因組DNA提取試劑盒（德國QIAGEN公司），按照標準操作流程進行提取。提取的DNA置于-20 ℃低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 多重QF-PCR

選取21、18、13號染色體及性染色體上的短串聯(lián)重復(fù)序列（short tandem repeat，STR）作為目的擴增片段，利用多重QF-PCR 檢測常見染色體數(shù)目異常。STR 位點共26個，其中21號染色體包括：D21S1435、D21S11、D21S1411、D21S1444、D21S1442和D21S1437；18號染色體包括：D18S978、D18S535、D18S386、D18S976和GATA178F11；13號染色體包括：D13S742、D13S634、D13S628、D13S305和D13S1492；性染色體包括：DXS1187、XHPRT、DXS2390、

SRY、DXYS267、DXYS218、AMELXY、AMELX、ZFY和ZFX；另含有T1（指示7號與X 染色體）及T3（指示3 號與X 染色體）位點。采用Devyser compact v3 kit（瑞典Devyser AB公司），按照說明書要求進行DNA提取，PCR擴增條件：95 ℃預(yù)變性15 min；94 ℃變性 30 s，58 ℃退火1 min，72 ℃延伸90 s，共26個循環(huán)。擴增產(chǎn)物用ABI-3130XL基因分析儀（美國ABI公司）進行毛細管電泳，并用配套軟件GeneMapper v3.2.1分析數(shù)據(jù)。根據(jù)臨床生化協(xié)會/臨床分子遺傳協(xié)會制定的標準[7]判斷結(jié)果。

1.6 SNP array檢測及數(shù)據(jù)分析

采用美國Affymetrix公司提供的高分辨率全基因組CytoScan 750K芯片嚴格按照Affymetric公司提供的操作流程，進行DNA消化、擴增、純化、片段化、標記信號、雜交、洗片染色以及掃描。采用Chromosome Analysis Suite（ChAS）軟件比對GRCH37（human genome 19，hg19）分析結(jié)果，結(jié)合鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院產(chǎn)前診斷中心實驗室內(nèi)部數(shù)據(jù)和國際在線基因組與表型公共數(shù)據(jù)庫，包括DGV（http：//dgv.tcag.ca/dgv/app/home）、Decipher（https：//decipher.sanger.ac.uk）、OMIM（http：//omim.org/）等分析結(jié)果。按照美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)和基因組學(xué)會（American College of Medical Genetics and Genomics，ACMG）制定的CNV臨床意義指南[8]要求對＞100 Kb的CNV致病性分為三類五級，本研究采用三分類，（1）致病性拷貝數(shù)變異（pathogenic copy number variation，pCNV）；（2）臨床意義不明確（variant of unknown significance，VOUS）CNV；（3）良性拷貝數(shù)變異（benign copy number variation，bCNV）。對VOUS的CNV進行父母驗證，如果胎兒CNV來源于父母，歸為bCNV。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

采用 SPSS 16.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。計數(shù)資料以率表示，組間比較采用χ2檢驗，頻次＜5的采用Fisher精確概率法；計量資料以±s表示，比較采用t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 多重QF-PCR及SNP array總體檢測情況

QF-PCR 共檢出染色體數(shù)目異常49例（11.32%，49/433），檢出率最高的為標準型21-三體（6.47%，28/433），其次為18-三體（2.08%，9/433），特納綜合征最少（1.15%，5/433）。SNP array檢出了QF-PCR所檢出的所有染色體數(shù)目異常，另外檢出1例22-三體嵌合體，1例21-三體同時合并8號三體嵌合體，1例21-三體合并CNV異常。SNP array檢出的CNV變異種，對7例胎兒的父母進行了胎兒來源驗證，其中3例新發(fā)突變，4例為父母來源。驗證后共有15例pCNV，22例VOUS CNV，1例單親二倍體（uniparental disomy，UPD）。見表1。

2.2 不同分組的SNP array結(jié)果

A、B、C和D組染色體數(shù)目異常檢出率分別為4.64%、11.36%、26.42%和22.20%，pCNV檢出率分別為1.0%、4.5%、3.8%和9.3%，見表2。單純性NT增厚組染色體數(shù)目異常和pCNV檢出率分別為9.91%和2.14%，合并其他超聲異常組分別為21.67%、11.67%，見表3。

2.3 染色體數(shù)目異常及pCNV與孕婦年齡的關(guān)系

383例染色體數(shù)目正常與50例異常孕婦平均年齡分別為（29.581 6±4.423 6）歲與（31.220 0±5.463 4）歲，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。418例非pCNV與15例pCNV孕婦平均年齡分別為（29.933 3±6.638 2）與（29.766 3±4.499 0），差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表4。

表1 多重QF-PCR與SNP array檢測結(jié)果 例/%

2.4 pCNV結(jié)果

SNP array共檢出15例pCNV，13例胎兒NT厚度≥3.5 mm；2例為2.5～3.4 mm，且合并其他超聲異常。見表5。

表2 不同NT厚度組的SNP array檢測結(jié)果例（%）

表3 單純性NT增厚組與合并其他超聲異常組SNP array檢測結(jié)果 例（%）

表4 不同組別孕婦年齡比較

表5 15例檢測pCNV胎兒相關(guān)臨床特征及檢測結(jié)果

3 討論

NT是妊娠11～13+6周胎兒頸背部出現(xiàn)的一層無回聲帶，為皮下組織內(nèi)的液體積聚。在胚胎正常發(fā)育過程中，妊娠10～14周時頸部淋巴囊與頸靜脈竇相通，少量淋巴液積聚在頸部，出現(xiàn)短暫回流障礙，形成暫時性NT，正常妊娠NT厚度呈正態(tài)性分布。妊娠14周后，NT通常會消退，但部分病例會演變成頸部水腫或水囊瘤。有研究發(fā)現(xiàn)約20%的NT增厚胎兒染色體存在異常，且其發(fā)生概率隨著胎兒NT厚度的增加而增加[9-10]。YANG等[11]的研究結(jié)果顯示，在296例NT厚度＞3 mm的病例中，核型分析結(jié)果顯示染色體異常的病例占19.9%（59/296）。1項孕早期超聲篩查胎兒NT的研究發(fā)現(xiàn)，218例NT增厚的病例中染色體異常占22.02%（48/218），其中數(shù)目異常39例，數(shù)目異常中21-三體綜合征所占比例達50%（24/48），其次為18-三體綜合征，占16.67%（8/48）[12]。另一項研究得出了相同的結(jié)論，NT增厚且染色體異常的胎兒中，21-三體綜合征占50%、18-三體綜合征或13-三體綜合征占25%、特納綜合征占10%[13]。本研究結(jié)果顯示，433例NT增厚胎兒中，染色體數(shù)目異常發(fā)生率隨NT增厚而增高，厚度在2.5～3.4 mm時，數(shù)目異常發(fā)生率為4.64%，厚度在3.4～4.4 mm時，數(shù)目異常發(fā)生率為11.36%，當(dāng)厚度超過4.5 mm時，發(fā)生率＞20%。本研究的結(jié)果稍低于相關(guān)研究[11-13]，可能與SNP array檢測內(nèi)容僅為數(shù)目異常，不能檢出核型分析所能檢出的易位、倒位等平衡性結(jié)構(gòu)異常有關(guān)。數(shù)目異常發(fā)生率居前3位的分別是21-三體綜合征、18-三體綜合征及特納綜合征，與相關(guān)報道一致。

BORNSTEIN等[14]報道在NT增厚胎兒中pCNV整體檢出率為4.3%，在單純性NT增厚病例中為1.6%，合并其他異常時檢出率為5.9%。HILLMAN等[15]結(jié)合文獻分析發(fā)現(xiàn)，單純性NT增厚胎兒pCNV的檢出率為3.6%，當(dāng)合并其他超聲異常時，pCNV檢出率為5.2%。本研究結(jié)果顯示，NT厚度超過3.5 mm時，pCNV發(fā)生率在4%以上，單純性NT厚度增厚的病例中pCNV發(fā)生率為2.14%（8/373），基本與文獻報道一致。然而，本研究發(fā)現(xiàn)NT增厚合并其他超聲異常時，pCNV發(fā)生率為11.67%（7/60），高于相關(guān)報道，可能與患者納入標準或病例標本量較少有關(guān)，具體結(jié)論還有待進一步研究。通過統(tǒng)計學(xué)分析可以看出，NT增厚合并其他超聲異常的pCNV檢出率為11.67%，明顯高于單純性NT增厚組的2.14%，建議NT增厚合并其他超聲異常的胎兒在染色體核型分析或數(shù)目分析正常后進行CMA檢測。

有研究認為孕婦年齡增大與染色體不分離有關(guān)，染色體數(shù)目非整倍體發(fā)生率隨孕婦年齡增長而增高[16]，特別是21-三體發(fā)生率在≥35歲孕婦中顯著增加[17-18]。本研究結(jié)果也印證了這一結(jié)論，染色體數(shù)目異常組孕婦年齡與染色體數(shù)目正常組比較具有明顯的統(tǒng)計學(xué)差異。但是pCNV組與非pCNV組的孕婦平均年齡分別為（29.77±4.50）和（29.93±6.64）歲，并無顯著差異，這提示導(dǎo)致染色體微缺失、微重復(fù)與數(shù)目異常的原因并不同，具體機制還有待研究。因此，在選擇CMA檢測指標時，不應(yīng)將孕婦年齡作為影響因素。

目前，國際上對于NT截斷值采用NT厚度超過第95百分位數(shù)還是第99百分位數(shù)存在爭議。在我國，NT增厚截斷值亦缺乏統(tǒng)一標準。本研究結(jié)果顯示，194例臨界性NT厚度（2.5～3.4 mm）胎兒與239例NT厚度超過3.4 mm胎兒，無論染色體數(shù)目異常還是pCNV發(fā)生率均存在統(tǒng)計學(xué)差異。且pCNV情況顯示，NT厚度為2.5～3.4 mm的2例pCNV胎兒同時合并其他超聲結(jié)構(gòu)異常。因此，本研究認為不應(yīng)該常規(guī)對臨界性NT厚度胎兒行CMA檢測，除非胎兒同時合并其他指征。

NT厚度對于孕早期提示染色體異常發(fā)生率具有重要意義，如果及時進行檢驗，可以極大地將診斷窗口前移。染色體G顯帶核型分析作為臨床上染色體病診斷的金標準，孕早期受制于細胞培養(yǎng)失敗率較高，且耗時較長（7～21 d），不利于盡早診斷。本研究采用QF-PCR進行檢測，可快速、準確檢測21、18、13及性染色體數(shù)目異常。聯(lián)合SNP array在全基因組水平高分辨（100 Kb）檢測染色體CNV，染色體數(shù)目變異檢出率為11.55%（50/433），pCNV變異檢出率為3.46%（15/433）。從本研究結(jié)果可以看出，染色體數(shù)目異常的發(fā)生率遠高于CNV，產(chǎn)前診斷在不能采用核型分析金標準方法檢驗時，應(yīng)首先通過QF-PCR檢測排除染色體數(shù)目異常，再采用CMA檢測CNV，以最快速地報告診斷結(jié)果。

綜上所述，NT厚度及其是否合并其他超聲指標異常與染色體數(shù)目異常及pCNV均存在一定的關(guān)聯(lián)性，建議采用NT厚度超過第99百分位數(shù)（3.5 mm）時為截斷值進行相應(yīng)檢測。孕婦年齡與pCNV發(fā)生率無關(guān)。對于孕早期NT增厚的胎兒，應(yīng)聯(lián)合應(yīng)用多重QF-PCR與CMA進行快速準確的產(chǎn)前診斷。