分散微固相萃取-高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定水樣中3種氯霉素類和11種激素類藥物殘留

粟有志 李艷美 周 均 尚 爽 李 芳 王興磊

(1.伊犁師范大學(xué)污染物化學(xué)與環(huán)境治理重點實驗室新疆伊寧 835000；2.中華人民共和國伊寧海關(guān)新疆伊寧 835000)

氯霉素類和激素類藥物是臨床治療、畜牧水產(chǎn)、個人護理等領(lǐng)域常用藥品。目前由于這些藥品的濫用，兩類藥物已成為擾亂人體及動物正常生命活動的環(huán)境污染物[1]。近年來，水環(huán)境中氯霉素類和激素類藥物殘留常有檢出，濃度在ng/L～μg/L范圍[2，3]。氯霉素類和激素類殘留的分析方法主要有液相色譜法[4-6]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[7-9]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[10，11]。由于水環(huán)境中此兩類藥物的含量很低，常需有效的前處理技術(shù)進行富集和凈化，其中液相微萃取[7,11]和固相萃取(SPE)[8-10]是主要的前處理技術(shù)。分散微固相萃取技術(shù)(DMSPE)原理是將待凈化提取液直接加入含有固體填料的離心管中，通過渦旋、振蕩、離心等方式將待測目標(biāo)物吸附于填料上，而后通過解吸溶劑進行洗脫。DMSPE相較于傳統(tǒng)的SPE技術(shù)，無需繁瑣的上樣、淋洗、平衡等過程，具有消耗溶劑少、價格低廉、耗時短等特點，已在水環(huán)境、牛奶等樣品的藥物殘留分析中得到廣泛應(yīng)用[12，13]。

本研究以官能化聚苯乙烯/二乙烯苯填料(PEP)作為吸附凈化材料，采用DMSPE技術(shù)對河水和自來水進行前處理，結(jié)合高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS)，建立了快速測定水樣中3種氯霉素類:甲砜霉素(Thiamphenicol，TPC)、氟苯尼考(Flurbenicol，F(xiàn)BC)、氯霉素(Chloramphenicol，CRP)，以及11種激素類：諾龍(Nandrolone，NL)、己烯雌酚(Diethylstilbestrol，DTSB)、己二烯雌酚(Dienetrol，DNT)、睪酮(Testosterone，TTT)、己烷雌酚(Hexoestrol，HXT)、甲基睪酮(Methyltestosterone，MTT)、甲地孕酮(Megestrol，MGT)、安宮黃體酮(Medroxyprogesterone Acetate，MPA)、美侖孕酮(Melengestrol，MLT)、孕烯二酮(Progesterone，PGT)、丙酸睪酮(Testosterone propionate，TTP)14種藥物殘留的分析方法。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

1200型高效液相色譜儀(Agilent公司)；API5000型三重四極桿質(zhì)譜儀(Applied Biosystems公司)；3-18K型臺式冷凍離心機(Sigma公司)；N-EVAP-112型氮吹儀(Organomation公司)；MS3型渦旋振蕩器(IKA公司)。

14種藥物標(biāo)準(zhǔn)品均購自Dr.Ehrenstorfer公司。分別準(zhǔn)確稱取各標(biāo)準(zhǔn)品10 mg(精確至0.0001 g)于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，配成質(zhì)量濃度為1 000 mg/L的單一標(biāo)準(zhǔn)儲備液，于冰箱4 ℃儲存?zhèn)溆谩Ｒ砸译?水(1∶9,V/V)為稀釋液，配制10 mg /mL的中間混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。乙腈、甲醇、甲酸均為色譜純(Merck公司)；酸性氧化鋁(ALA)、N-丙基乙二胺(PSA)(40 μm)吸附填料購自Agilent公司；官能化聚苯乙烯/二乙烯苯極性增強聚合物(PEP，80～10 μm)、強陰離子交換混合機理的水可浸潤型聚合物(PAX，40～60 μm)、強陽離子交換混合機理的水可浸潤型聚合物(PCX，40～60 μm)、弱陽離子交換混合機理的水可浸潤型聚合物(PWCX,40～60 μm)、強陰離子交換機理的硅膠(SAX，50 μm)、新型碳黑材料(PestiCarb，120～400 mesh)、官能化聚苯乙烯/二乙烯苯中等極性聚合物(HXN，40～60 μm)等吸附填料均購自Agela公司。實驗用水由Milli-Q Advangtage A10超純水系統(tǒng)(Millipore公司)制備。

1.2 樣品采集與保存

河水采自伊犁河伊寧市段，自來水采自實驗室。樣品采集于棕色玻璃瓶中，采集水樣前，先用水樣洗滌取樣瓶及蓋子2～3次，充滿至溢出后蓋上蓋子，于4 ℃保存，保存時間一般不超過7 d。

1.3 樣品前處理

稱取50±5 mg PEP吸附填料，置于50 mL離心管中，加入2 mL甲醇，先以3 000 r/min渦旋30 s，再以8 000 r/min離心1 min，棄去上層甲醇，在離心管中準(zhǔn)確加入50 mL水樣，以3 000 r/min渦旋30 s，再以8 000 r/min離心1 min，移出上層水樣至離心管中(剩余約4 mL水樣)。將剩余上層水樣全部轉(zhuǎn)移至裝有0.45 μm尼龍膜的5 mL注射器中，過濾，棄去濾液。在離心管中加入4 mL甲酸-甲醇(1∶99,V/V)，然后以3 000 r/min渦旋30 s，8 000 r/min離心1 min，將上層甲酸-甲醇轉(zhuǎn)移至原來裝有0.45 μm尼龍膜的5 mL注射器中，過濾，收集濾液于15 mL玻璃試管中。加入4 mL甲酸-甲醇重復(fù)操作一次，合并兩次洗脫液，于40 ℃水浴中氮吹至干，用0.5 mL乙腈-水(1∶9,V/V)溶解定容后，供HPLC-MS/MS分析。

1.4 LC-MS/MS條件

色譜條件：JADE-PAK CB-C18柱(100 mm×2.1 mm,3 μm)；流動相：A相為水溶液，B相為甲醇。梯度洗脫程序如下：0～0.5 min(B相10%)，0.5～1.0 min(B相10%～70%)，1.0～6.0 min(B相70%～95%)，6.0～7.0 min(B相95%)，7.0～7.5 min(B相95%～10%)，7.5～12.0 min(B相10%)。柱溫：30 ℃；流速：0.25 mL/min，進樣量：10 μL。

質(zhì)譜條件：電噴霧電離源(ESI)，正、負(fù)離子掃描，以多重反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式檢測；實驗所用的氣體均為高純氮；碰撞氣(CAD)壓力為41 kPa；氣簾氣(CUR)壓力為150 kPa；霧化氣(GS1)壓力為450 kPa；輔助氣(GS2)壓力為410 kPa；去溶劑溫度500 ℃；ESI-模式下，電噴霧電壓(IS)為-4.5 kV，預(yù)四極桿Q0入口電壓(EP)為-10 V，碰撞室出口電壓(CXP)為-22 V；ESI+模式下，IS為5.5 kV，Q0 EP為10 V，CXP為22 V。14種藥物的定性/定量離子對、碰撞能量(CE)及去簇電壓(DP)見表1。

表1 3種氯霉素類和11種激素類藥物的質(zhì)譜分析參數(shù)Table 1 Optimized parameters of MS/MS for 3 Chloramphenicols and 11 Hormones

(續(xù)表1)

*quantification transition.

2 結(jié)果與討論

2.1 儀器條件的優(yōu)化

配制50 ng/L的單一藥物的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別采用ESI+和ESI-進行母離子掃描，確定其準(zhǔn)分子離子峰。選擇信號強的分子離子峰進一步對子離子、去簇電壓、碰撞能量等參數(shù)進行優(yōu)化，參照歐盟指令(657/2002/EEC)決議中有關(guān)規(guī)定，本文選擇離子豐度最高、本底干擾最小的兩個離子對作為特征離子對，其中信號較大的離子對作為定量離子。實驗比較了不同濃度的甲酸水溶液、乙酸銨水溶液、甲酸和乙酸銨的水溶液、純水所組成的無機相(A相)，乙腈、甲醇組成的有機相(B相)。通過不同A相與B相的組合分析發(fā)現(xiàn)：適合于ESI+的藥物以甲酸水溶液-乙腈為流動相時響應(yīng)信號較高；適合于ESI-的藥物以水-甲醇為流動相時響應(yīng)信號較高。綜合考慮正負(fù)離子的響應(yīng)信號，本研究最終選擇水-甲醇為流動相。通過優(yōu)化梯度洗脫程序，14種藥物均能得到較好的分離度和色譜峰形?；趦?yōu)化結(jié)果，建立的多重反應(yīng)監(jiān)測(MRM)質(zhì)譜分析參數(shù)見表1。

2.2 DMSPE條件的優(yōu)化

2.2.1 吸附劑和洗脫劑的選擇比較了ALA、PSA、PEP、PAX、PCX、PWCX、SAX、PestiCarb和HXN 9種不同類型吸附劑對3種氯霉素類和11種激素類藥物的吸附效果。移取50 mL空白河水，加入中間混合標(biāo)準(zhǔn)溶液至各藥物的濃度均為50 ng/mL，分別加入0.1 g吸附劑，渦旋30 s進行吸附，計算吸附劑對14種藥物的吸附率。結(jié)果表明：ALA的吸附率為19.5%～81.5%，PSA的吸附率為13.0%～82.1%，SAX的吸附率為9.7%～81.3%，其余6種吸附劑的吸附率均在98%以上。分別以10 mL乙腈、甲醇、甲酸-甲醇(1∶99,V/V)、氨水-甲醇(5∶95,V/V)為洗脫劑進行解吸實驗。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，甲醇和乙腈的洗脫率普遍低于甲酸-甲醇(1∶99,V/V)和氨水-甲醇(5∶95,V/V)的洗脫率。以甲酸-甲醇洗脫時，PestiCarb的洗脫率為1.4%～50.0%，HXN的洗脫率為42.1%～99.5%，PAX的洗脫率為50.5%～111.2%，PWCX的洗脫率為58.7%～101.3%，PCX的洗脫率為54.1%～93.6%，PEP的洗脫率為81.6%～110.8%。以氨水-甲醇為洗脫劑時，PestiCarb的洗脫率為2.2%～25.5%，HXN的洗脫率為42.1%～98.2%，PAX的洗脫率為60.4%～108.2%，PWCX的洗脫率為52.9%～92.2%，PCX的洗脫率為58.7%～95.5%，PEP的洗脫率為66.8%～116.6%。因PestiCarb對目標(biāo)物的吸附容量過大，難以將目標(biāo)物解吸，洗脫率偏低；PAX、PWCX、PCX 3種吸附劑具有聚合物均衡吸附和離子交換吸附的雙重機理，洗脫劑對部分目標(biāo)物的洗脫率較差；HXN難以滿足NL、DNT、TTT 3種藥物的洗脫率同時滿足方法學(xué)要求。實驗以PEP為吸附劑，以甲酸-甲醇(1∶99,V/V)為洗脫劑，目標(biāo)物的回收率較好。

2.2.2 吸附劑用量的選擇移取50 mL空白河水，加入中間混合標(biāo)準(zhǔn)溶液至各藥物的濃度均為50 ng/mL。分別稱取25、50、100、150、200、300 mg PEP吸附劑進行吸附實驗。結(jié)果表明：用量25 mg時，除己二烯雌(DNT)的吸附率為94.8%，其他不同用量條件下，14種藥物的吸附率均在98%以上。本研究選擇吸附劑PEP的用量為50 mg。

2.2.3 吸附時間的選擇稱取50 mg PEP吸附劑，加入50 mL各藥物濃度為50 ng/mL的河水，比較渦旋15、30、60、90、120 s不同渦旋時間對吸附效率的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在上述范圍內(nèi)，14種藥物的吸附效率均在98%以上。考慮到15 s時間過短，可能影響吸附效果，本研究最終選擇渦旋30 s。

2.2.4 水樣pH的選擇移取50 mL空白河水，加入中間混合標(biāo)準(zhǔn)溶液至各藥物的濃度均為50 ng/mL，用稀HCl或NaOH溶液，分別將河水pH調(diào)至3、5.8、8.5進行吸附實驗。結(jié)果表明，3種pH條件下，14種藥物的吸附率均在98%以上。因所采集水樣pH在6.7～7.6范圍，故實驗無需調(diào)節(jié)pH。

2.2.5 洗脫劑的體積的選擇在50 mL空白河水中加標(biāo)至各藥物的濃度為0.5 ng/mL，吸附完成后，用16 mL甲酸-甲醇(1∶99,V/V)分4次洗脫(每次用量4 mL)，分別收集每次洗脫液氮吹至干，用0.5 mL乙腈-水( 1∶9,V/V)定容后分析。結(jié)果表明，當(dāng)進行第3次洗脫時，回收率無明顯提高。故選擇8 mL甲酸-甲醇分2次洗脫。經(jīng)DMSPE前處理的河水加標(biāo)樣品的MRM色譜圖見圖1。

2.2.6 與常規(guī)SPE方法的對比對比固相萃取小柱Agela Cleanrt PEP(60 mg/3mL)、Waters Oasis HLB(60 mg/3mL)和DMSPE方法對3種氯霉素類和11種激素類藥物的實驗回收率。PEP和HLB固相萃取預(yù)先用3 mL甲醇和3 mL水活化，上樣50 mL加標(biāo)濃度為500 ng/L的河水樣品，用3 mL水淋洗，抽干，用8 mL甲酸-甲醇(1∶99,V/V)洗脫，收集洗脫液，40 ℃水浴中氮氣吹至干，用0.5 mL乙腈-水(1∶9,V/V)定容溶解。3種不同處理方法對14種目標(biāo)分析物的回收率無明顯差別(圖2)。

圖1 空白河水中添加濃度為10 ng/L的3種氯霉素類和11種激素類藥物的MRM色譜圖Fig.1 MRM chromatograms of 3 chloramphenicols and 11 hormones adding concentration of 10 ng/L in blank river waterNo.1-14 are the same as Table 1.

圖2 三種不同前處理對14種目標(biāo)分析物的回收率Fig.2 The recovery of 14 target analytes by three different pretreatments

2.3 基質(zhì)效應(yīng)、線性范圍、檢出限和定量限

采用相對響應(yīng)值法根據(jù)公式計算基質(zhì)效應(yīng)(ME)：ME=Am/Ac×100%。其中Am表示空白基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)響應(yīng)值；Ac表示純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)響應(yīng)值?；|(zhì)效應(yīng)為87.5%～106.5%，均可忽略。將中間混合標(biāo)準(zhǔn)溶液逐級稀釋成0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20、50 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)曲線工作溶液。以峰面積(Y)對分析物的質(zhì)量濃度(X)作線性回歸，14種藥物的相關(guān)系數(shù)(r2)大于0.994。檢出限按照信噪比(S/N)≥3確定，其范圍為0.1～3.1 ng/L；以S/N≥10確定定量限，其范圍為0.2～10.4 ng/L。14種藥物的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍、相關(guān)系數(shù)、基質(zhì)效應(yīng)、檢出限與定量限詳見表2。

2.4 方法的準(zhǔn)確度和精密度

實驗選擇了河水、自來水的空白樣品，設(shè)3個加標(biāo)濃度，濃度分別為2、10、100 ng/L，每個水平重復(fù)6次。河水和自來水的回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差見表3。14種藥物的回收率在53.6%～90.4%之間，日內(nèi)精密度為5.2%～16.9%。

表2 3種氯霉素類和11種激素類藥物的線性范圍、標(biāo)準(zhǔn)曲線、相關(guān)系數(shù)、基質(zhì)效應(yīng)、檢出限與定量限Table 2 Linear equation,linear ranges,correlation coefficients (r2),matrix effec,limits of determination (LOD) and limits of quantification (LOQ) of 3 chloramphenicol and 11 hormones

表3 3種氯霉素類和11種激素類藥物的在河水和自來水中的添加回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)Table 3 Recoveries and relative standard deviations (RSDs) of the 3 chloramphenicols and 11 hormones in river water(n=6)

2.5 樣品測定

利用本方法對伊犁河伊寧市段的三個采樣區(qū)域(城市上游、中游、下游)的河水及實驗室自來水共計10個樣品進行分析，均未檢出3種氯霉素類和11種激素類藥物。

3 結(jié)論

本研究建立了水樣中14種藥物殘留的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析方法。方法的定量限、回收率和精密度均滿足痕量分析要求，可為水中此類物質(zhì)的監(jiān)控提供技術(shù)支持。