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    基于16S rRNA基因分析蟲草寄主蝠蛾的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系

    2020-03-21 13:31:08彭樹英萬勝豪汪承巧韓蒙蒙汪雨晨耿雪俠張海軍
    關(guān)鍵詞:進(jìn)化樹冬蟲夏草蟲草

    彭樹英,李 俊,萬勝豪,汪 敏,汪 玲,汪承巧,韓蒙蒙,汪雨晨,耿雪俠,張海軍①

    (淮北師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,資源植物生物學(xué)安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,安徽 淮北235000)

    0 引言

    冬蟲夏草(Ophiocordyceps sinensis)為麥角菌科(Clavicipitaceae)冬蟲夏草菌(Ophiocordyceps sinensis(Berk.)G.H.Sung et al.(Cordyceps sinensis Berk.))寄生在蝠蛾屬(Hepialus)昆蟲幼蟲上長(zhǎng)出的子座及幼蟲尸體所形成的蟲菌復(fù)合體[1~3]. 感染此種真菌的昆蟲幼蟲在冬天形成致密的菌核即“冬蟲”,至次年春末夏初之際蟲體頭部長(zhǎng)出子座破土而出,即“夏草”[1-3]. 冬蟲夏草是一種極為珍貴的中藥材,具有補(bǔ)肺益腎[4]、止咳化痰、調(diào)節(jié)免疫力[5]、降血糖降血脂[6-7]、抗腫瘤[8]、抗氧化[9]和抗衰老[10]等多種功效. 冬蟲夏草寄主昆蟲的地理分布雖較獨(dú)特,但有其特定規(guī)律,主要分布于青海、西藏、四川、云南和甘肅五省境內(nèi)海拔3 000 m以上的青藏高原高寒草甸區(qū)[11]. 冬蟲夏草菌主要寄主昆蟲為蝠蛾屬昆蟲,根據(jù)傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)分析,中國(guó)境內(nèi)記錄的蝠蛾屬昆蟲累計(jì)達(dá)到六十多種,據(jù)推測(cè),未發(fā)現(xiàn)的種類可能會(huì)更多[12-13]. 1968年,Viette[14]以雄性生殖器抱器瓣底部明顯的突起為依據(jù),在蝙蝠蛾科下建立鉤蝠蛾屬(Thitarodes). 隨后,國(guó)外學(xué)者[15~17]將大部分蝠蛾種類歸于此屬. 由于昆蟲形態(tài)變化的可塑性及趨同進(jìn)化導(dǎo)致傳統(tǒng)分類法不夠準(zhǔn)確[18],而且對(duì)冬蟲夏草寄主的研究也多側(cè)重于形態(tài)特征、生物學(xué)特性分析,或蝠蛾屬昆蟲的種類和地理分布的研究[19~25],對(duì)我國(guó)不同產(chǎn)地冬蟲夏草寄主昆蟲之間的分子遺傳進(jìn)化關(guān)系的研究報(bào)道也較少,這將直接影響冬蟲夏草種質(zhì)資源的保護(hù)和有效利用[12].

    線粒體DNA(mtDNA)為雙鏈共價(jià)閉合環(huán)狀DNA,具有結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、無組織特異性、嚴(yán)格遵守母系遺傳、不易發(fā)生重組、進(jìn)化速率快等特點(diǎn)[11]. mtDNA是研究動(dòng)物遺傳多樣性和分子進(jìn)化的有效標(biāo)記,已廣泛用于昆蟲分類和分子系統(tǒng)學(xué)的研究. 一些學(xué)者嘗試將形態(tài)分類方法和分子生物學(xué)方法結(jié)合,以彌補(bǔ)傳統(tǒng)方法的不足. 陳永久等[26]曾利用線粒體細(xì)胞色素b 基因(Cytochrome b,Cyt b)序列首次分析5 種冬蟲夏草寄主蝠蛾的分子進(jìn)化關(guān)系. 程舟等[12]通過對(duì)冬蟲夏草寄主蝠蛾的線粒體Cyt b基因片段的序列分析,構(gòu)建分子系統(tǒng)樹,分析我國(guó)冬蟲夏草寄主蝠蛾種屬的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系和地域分布格局. 鄒志文等[13,18]以蝠蛾雄性生殖器抱器瓣結(jié)構(gòu)特征為依據(jù),修訂現(xiàn)行中國(guó)蝠蛾屬昆蟲分類系統(tǒng),將中國(guó)蝠蛾屬的62個(gè)種分別歸入擬蝠蛾屬(Parahepialus)、蝠蛾屬(Hepialus)、鉤蝠蛾屬(Thitarodes)及無鉤蝠蛾屬(Ahamus)等4個(gè)屬中,同時(shí)利用26 種原蝠蛾屬種類Cyt b基因片段構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹,證明將蝠蛾雄性抱器瓣特征作為分屬依據(jù)是合理可信的. 陳抒云等[27]對(duì)冬蟲夏草和其它蟲草等物種的寄主昆蟲分別通過COⅠ基因和Cyt b 基因進(jìn)行條形碼分析,表明COⅠ序列更適用于蟲草寄主昆蟲的DNA 條形碼研究. 近幾年,一些學(xué)者為深入研究蟲草寄主蝠蛾的分子進(jìn)化及其分類,已相繼測(cè)定多條蟲草寄主蝠蛾mtDNA全基因組序列[11,18,28~31].

    作為分子標(biāo)記,研究動(dòng)物進(jìn)化的mtDNA應(yīng)用最多的是Cyt b,細(xì)胞色素氧化酶亞基Ⅰ(COⅠ),NADH脫氫酶亞基(ND4),12S rRNA基因,A+T富集區(qū),腺苷三磷酸酶(ATP6或ATP8)等[32]. 16S rRNA基因亦是線粒體基因組中研究較多的基因,既含有保守序列,又含有與進(jìn)化距離相適應(yīng)的可變序列,被稱為進(jìn)化分子鐘[32]. 16S rRNA基因用于評(píng)價(jià)生物的遺傳多樣性和系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系的報(bào)道很多[33~38],但在冬蟲夏草寄主蝠蛾方面的研究尚未見報(bào)道. 本研究運(yùn)用線粒體16S rRNA基因序列對(duì)不同蟲草寄主蝠蛾的進(jìn)化關(guān)系進(jìn)行分析,以期為進(jìn)一步的遺傳系統(tǒng)進(jìn)化分析、種質(zhì)鑒定和資源保護(hù)奠定理論依據(jù).

    1 材料和方法

    1.1 基因序列來源

    目前已登錄至GenBank的蝠蛾科線粒體基因組全序列共有11條記錄,其中7條為蟲草寄主蝠蛾(其中6種蝠蛾基因序列有兩個(gè)序列號(hào)),亞香棒蟲草寄主蝠蛾1條,其他蝠蛾3條(其中2種蝠蛾基因序列有兩個(gè)序列號(hào)),從GenBank中獲取并下載蝠蛾科、其他科蛾類及果蠅(外群)線粒體16S rRNA和COⅠ基因序列(表1).

    表1 本研究序列來源及信息

    表1(續(xù))

    1.2 數(shù)據(jù)處理和系統(tǒng)進(jìn)化分析

    將從NCBI 中獲取的序列保存為Fasta 格式,用ClustalX 2.1 軟件進(jìn)行序列對(duì)比. 然后將比對(duì)序列用MEGA 7.0軟件統(tǒng)計(jì)不同蝠蛾科16S rRNA基因序列間的簡(jiǎn)約位點(diǎn)、可變位點(diǎn)、保守位點(diǎn)以及種間遺傳間距,并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹. 用DAMBE軟件分析基因序列的堿基組成,并分析AT或GC偏斜性,計(jì)算公式為AT-skew=[A-T]/[A+T]和GC-skew=[G-C]/[G+C][39]. 本研究基于冬蟲夏草、亞香棒蟲草的寄主昆蟲(蝠蛾類)及其他蛾類的16S rRNA基因用NJ法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹. 為評(píng)估16S rRNA基因作為分類依據(jù)分子標(biāo)記的可靠性,同時(shí)用相同物種線粒體基因組序列的16S rRNA 聯(lián)合COⅠ基因構(gòu)建ML 系統(tǒng)進(jìn)化樹. 將系統(tǒng)進(jìn)化樹中bootstrap自檢值設(shè)置為1 000.

    2 結(jié)果

    2.1 序列堿基組成分析

    將16S rRNA 基因序列進(jìn)行對(duì)比排列后,長(zhǎng)度為1 411 bp,其中保守位點(diǎn)1 054個(gè),簡(jiǎn)約位點(diǎn)143個(gè),可變位點(diǎn)310個(gè). 通過計(jì)算可知,A、C、G、T堿基的平均含量分別為44.1%、5.3%、9.6%、40.0%. A+T的平均含量為85.0%,明顯高于G+C 含量(15%). 由表2 可知,AT 和GC 的偏斜度均為正值且小于1,最小ATSkew值為0.005(T.sylvina),最大AT-Skew值為0.045(A.yunnanensis),最小GC-Skew值為0.26(T.sp.),最大GC-Skew值為0.326(H.xiaojinensis),說明11種蝠蛾堿基組成對(duì)AT顯著偏移.

    表2 11種蝠蛾的16S rRNA基因堿基組成

    2.2 蝠蛾科11種蝠蛾的種間遺傳距離

    由表3可知,在11種蝠蛾中,種間遺傳距離范圍在0.005~0.117之間,人支蝠蛾(T.renzhiensis)與阿爾泰蝠蛾(T.sp.)和貢嘎蝠蛾(T.gonggaensis)的種間遺傳距離為最?。?.005),T.sylvina與蒲氏鉤蝠蛾(T.pui)間的遺傳距離是最大(0.117). 蟲草寄主蝠蛾間的遺傳距離為0.005~0.51.T.sylvina與其他蝠蛾的遺傳距離范圍在0.099~0.117,相比其他蝠蛾間的遺傳距離明顯偏大.

    表3 11種蝠蛾16S rRNA基因的遺傳距離

    2.3 系統(tǒng)進(jìn)化分析

    基于16S rRNA基因和COⅠ基因聯(lián)合16S rRNA基因構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹均明顯分為兩個(gè)大分支. 在NJ樹(如圖1)中第Ⅰ支由蝠蛾科昆蟲包括蟲草寄主蝠蛾及其他蝠蛾構(gòu)成. 在蟲草寄主蝠蛾中,人支蝠蛾(T.renzhiensis)與阿爾泰蝠蛾(T.sp.)聚為一支,與貢嘎蝠蛾(T.gonggaensis)及小金蝠蛾(H.xiaojinensis)聚成一簇,與色季拉山蝠蛾(T.sejilaensis)與蒲氏鉤蝠蛾(T.pui)聚成的一支構(gòu)成姊妹群. 云南蝠蛾(A.yunnanensis)位于此支系的基部(自展值100%). 7種蟲草寄主蝠蛾構(gòu)成一個(gè)獨(dú)立的大支系(自展值為100%),表明屬間親緣關(guān)系較近. 如蝠蛾屬的兩種蝠蛾(Endoclita signifer和Endoclita minanus)單獨(dú)聚類在一起,與湖南棒蝠蛾(N.hunanensis)和Triodia sylvina位于蟲草寄主蝠蛾類群的基部. 而在ML樹中(如圖2),蟲草寄主蝠蛾聚類與NJ樹中一致,但非蟲草寄主蝠蛾中N.hunanensis與T.sylvina單獨(dú)形成一個(gè)支系,E.signifer和E.minanus聚類形成另一個(gè)單獨(dú)支系. 兩種樹中第Ⅱ大支均由蠶蛾科、織蛾科、菜蛾科、卷蛾科、舉肢蛾科和麥蛾科蛾類構(gòu)成,NJ 樹中蠶蛾科的家蠶Bombyx mori與Bombyx huttoni聚類形成一支,然后與菜蛾(Plutella xylostella)和卷蛾(Spilonota lechriaspis)形成一支. 舉肢蛾科、織蛾科和麥蛾科聚類形成另一支.ML樹中的第Ⅱ大支稍有不同,蠶蛾科單獨(dú)聚類成一支,菜蛾(Plutella xylostella)和卷蛾(Spilonota lechriaspis)也聚類成一支,其余科的蛾類均單獨(dú)形成一支(如圖1和圖2).

    圖1 基于線粒體16S rRNA基因構(gòu)建的NJ樹

    圖2 基于16S+COⅠ基因構(gòu)建的ML樹

    3 討論

    16S rRNA基因之所以成為常用的線粒體分子標(biāo)記,主要原因有如下幾點(diǎn):一是該基因存在于所有昆蟲的體內(nèi);二是16S rRNA 基因的保守性和特異性比較高[37];三是該基因序列較長(zhǎng),約含有50 個(gè)功能域[37]. COⅠ基因在線粒體DNA中分布普遍,具有多態(tài)性較高、基因進(jìn)化速率適中、適于通用引物擴(kuò)增等特點(diǎn),是昆蟲分子系統(tǒng)學(xué)研究中較為理想的分子標(biāo)記,該基因近年來在昆蟲的群體遺傳結(jié)構(gòu)和系統(tǒng)進(jìn)化方面有較多的研究[40]. 因此,在本研究中同時(shí)用蟲草寄主蝠蛾16S rRNA基因聯(lián)合COⅠ全基因構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹,以驗(yàn)證16S rRNA構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹的可靠性和有效性.

    通過對(duì)蝠蛾科蝠蛾線粒體16S rRNA 基因序列進(jìn)行分析,結(jié)果表明:序列中A+T 的平均含量為85.0%,G+C的平均含量為15.0%,堿基組成對(duì)A+T表現(xiàn)為顯著的偏移. 種間的最小遺傳距離為0.005(T.renzhiensis與T.sp.,T.renzhiensis與T.gonggaensis),說明三者的親緣關(guān)系較其他蛾類更近. 將蟲草寄主蝠蛾、其他蝠蛾及其他科蛾類的16S rRNA 基因全序列約1 400 bp個(gè)堿基作為系統(tǒng)進(jìn)化樹的分析位點(diǎn). NJ系統(tǒng)樹明顯分為2大支(圖1所示):第Ⅰ支由蝠蛾科昆蟲包括蟲草寄主蝠蛾及其他蝠蛾,7種蟲草寄主蝠蛾最先聚為一支,其中人支蝠蛾(T.renzhiensis)、阿爾泰蝠蛾(T.sp.)與貢嘎蝠蛾(T.gonggaensis)同屬鉤蝠蛾屬聚為一簇(種間遺傳距離最?。〗痱鸲辏℉.xiaojinensis)與3種鉤蝠蛾屬蝠蛾形成一個(gè)支系,說明小金蝠蛾(H.xiaojinensis)應(yīng)為鉤蝠蛾屬,這一結(jié)果印證并支持Kang[11]等的研究結(jié)論. 這一支系與色季拉山蝠蛾(T.sejilaensis)和蒲氏鉤蝠蛾(T.pui)形成的聚類簇互為姊妹群,而云南蝠蛾(A.yunnanensis)屬無鉤蝠蛾屬,獨(dú)立成一支. 以上結(jié)果與相關(guān)研究報(bào)道[11,18,29]所得結(jié)論一致. 同時(shí)發(fā)現(xiàn),蟲草寄主蝠蛾分布地域較近的也更趨于歸為一類,如蒲氏鉤蝠蛾(T.pui)和貢嘎蝠蛾(T.gonggaensis)均分布于西藏林芝地區(qū). 湖南棒蝠蛾(N.hunanensis)是亞香棒蟲草的寄主昆蟲,并不是冬蟲夏草的寄主昆蟲,但兩種蟲草形態(tài)卻極為相似,說明兩種蟲草寄主蝠蛾可能具有較近的親緣關(guān)系. 進(jìn)化樹分析結(jié)果亦表明,在非蟲草寄主蝠蛾中湖南棒蝠蛾(N.hunanensis)的確是與所有冬蟲夏草寄主蝠蛾關(guān)系較近的一支,而其他蝠蛾與蟲草寄主蝠蛾關(guān)系明顯稍遠(yuǎn)一些. 本研究分析蟲草寄主蝠蛾間的進(jìn)化關(guān)系而得出的結(jié)論與Zou等[18]和Kang等[11]的觀點(diǎn)基本一致. 本研究同時(shí)也用來源于相同物種線粒體基因組的COⅠ基因聯(lián)合16S rRNA構(gòu)建ML進(jìn)化樹(圖2所示),與單獨(dú)用16S rRNA基因構(gòu)建的進(jìn)化樹結(jié)果相符,在一定程度上支持鄒志文等[13]提出形態(tài)學(xué)分類的觀點(diǎn),即將蝠蛾屬以雄性生殖器抱器瓣結(jié)構(gòu)特征為依據(jù)分為4個(gè)屬的合理性. 這也說明16S rRNA基因可以進(jìn)行科屬級(jí)分類,作為系統(tǒng)進(jìn)化分析和分類的標(biāo)記基因是有效且可信的.

    本研究中樣本數(shù)有所欠缺,分布區(qū)域不均,因此今后研究過程中為更全面具體地進(jìn)行系統(tǒng)分類,還需要增加種群數(shù)量并結(jié)合其他分析技術(shù)手段,從而為蟲草寄主昆蟲的系統(tǒng)進(jìn)化研究提供更全面的科學(xué)依據(jù),同時(shí)為藥用蟲草資源的保護(hù)和利用奠定理論依據(jù).

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