氨基酮戊酸-光動力療法對尖銳濕疣組織中血管內(nèi)皮生長因子和增殖細(xì)胞核抗原表達(dá)的影響

尹光文 劉聰 王小云 張華 王夢奇

鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院皮膚科 450052

尖銳濕疣由人乳頭瘤病毒（HPV）感染引起的常見性傳播疾病，其傳染性強，少數(shù)甚至有癌變可能。臨床上缺乏有效的抗HPV感染的藥物，傳統(tǒng)治療方法如激光、冷凍等雖可清除疣體，但不能清除HPV亞臨床感染及潛伏感染，導(dǎo)致治療后復(fù)發(fā)率高，常給患者帶來較大痛苦，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量［1］。氨基酮戊酸光動力療法（aminolevulinic acid photodynamic therapy，ALA-PDT）治療尖銳濕疣具有療效好、復(fù)發(fā)率低、不良反應(yīng)少、可重復(fù)治療和適用于特殊人群等優(yōu)點［2-3］。我們通過檢測ALA-PDT治療前后尖銳濕疣患者疣體組織中血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）和增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）的表達(dá)變化，探討ALA-PDT對尖銳濕疣組織血管生成和增生的影響。

一、對象與方法

1.對象：2016年10月至2017年9月就診于鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院皮膚科門診的56例尖銳濕疣患者。其中，男30例，女26例，年齡19～65（34.55±12.25）歲；病程2周至3個月［（50.32±19.60）d］。男性患者疣體多位于陰莖、包皮、系帶、肛周等部位，女性皮損主要分布在會陰、陰道口等部位?；颊呔叩湫团R床表現(xiàn)，醋酸白試驗均陽性，臨床表現(xiàn)不典型的經(jīng)組織病理證實符合尖銳濕疣的病理改變?；颊呔党醮尉驮\，無其他系統(tǒng)性疾病。本研究通過鄭州大學(xué)基層倫理審查委員會審查批準(zhǔn)（科研快審2016-71），受試者均簽署知情同意書。

2.試劑：兔抗人VEGF多克隆抗體和兔抗人PCNA多克隆抗體產(chǎn)自武漢伊萊瑞特生物科技有限公司，3，3-二氨基聯(lián)苯胺顯色試劑盒及過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素（SP）試劑盒產(chǎn)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

3.治療方法：將氨基酮戊酸散（復(fù)旦張江生物醫(yī)藥股份有限公司）充分溶解于0.5 ml滅菌注射用水，配制成濃度為20%的溶液，嚴(yán)格按照ALA-PDT的治療方法操作，每周治療1次。治療前以手術(shù)刀片取56例尖銳濕疣疣體組織設(shè)為對照組。第1次治療后1周，同法取與治療前相同位置的疣體組織作為實驗組。所有標(biāo)本切除后立即固定24 h，石蠟包埋，制作4 μm厚切片。

4.免疫組化SP法檢測VEGF及PCNA的表達(dá)：按試劑盒說明采用免疫組化SP法檢測組織切片角質(zhì)形成細(xì)胞中VEGF及PCNA的表達(dá)，以已知染色陽性切片作為陽性對照，用PBS替代一抗作為陰性對照。VEGF陽性表達(dá)定位在細(xì)胞質(zhì)，PCNA陽性表達(dá)定位于細(xì)胞核，陽性表現(xiàn)均為淡黃色至棕褐色顆粒樣物質(zhì)。評定標(biāo)準(zhǔn)參照相關(guān)文獻(xiàn)［4］，對VEGF和PCNA表達(dá)綜合染色強度和陽性細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的百分比進行半定量處理：未著色為0分，淺黃色1分，黃色2分，棕黃或棕褐色3分；陽性細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)百分比≤10%、11%～25%、26%～50%、51%～75%、≥76%分別對應(yīng)評分0、1、2、3、4分。2項評分的乘積為總分，總分9～12分為強陽性（+++），6～8分為陽性（++），1～4分為弱陽性（+），0分為陰性（-）。

5.統(tǒng)計學(xué)處理：采用SPSS17.0軟件分析實驗數(shù)據(jù)，分別采用χ2檢驗和秩和檢驗分析治療前后VEGF及PCNA蛋白表達(dá)率和表達(dá)強度的差異，采用Spearman分析檢驗VEGF及PCNA蛋白表達(dá)的相關(guān)性。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

二、結(jié)果

1.ALA-PDT治療前后尖銳濕疣組織中VEGF的表達(dá)：見圖1。VEGF表達(dá)定位在細(xì)胞質(zhì)，陽性細(xì)胞遍布表皮全層，基底層、棘層顯著表達(dá)，顆粒層表達(dá)漸減弱。ALA-PDT治療前，56例尖銳濕疣患者中40例（71.43%）表達(dá)VEGF，表達(dá)強度多為++～+++；治療后25例（44.64%）表達(dá)VEGF，表達(dá)強度多為-～+。治療前后VEGF表達(dá)率差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=8.25，P＜0.05），表達(dá)強度差異亦有統(tǒng)計學(xué)意義（H=11.29，P ＜ 0.05），見表1。

2.ALA-PDT治療前后尖銳濕疣組織中PCNA的表達(dá)：見圖1。PCNA表達(dá)于細(xì)胞核，分布在表皮的基底層、棘層甚至顆粒層，呈淡黃色至棕褐色。ALA-PDT治療前，56例尖銳濕疣患者中41例（73.21%）表達(dá)PCNA，表達(dá)強度為++～+++；治療后23例（41.07%）表達(dá)PCNA，表達(dá)強度為-～+。治療前后PCNA表達(dá)率差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=11.81，P＜0.05），表達(dá)強度差異亦有統(tǒng)計學(xué)意義（H=12.22，P＜0.05），見表1。

圖1 氨基酮戊酸-光動力療法治療前后血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）在尖銳濕疣（CA）組織中的表達(dá)（SP法） 治療前，CA組織細(xì)胞VEGF表達(dá)強度較高，PCNA呈高強度表達(dá)；治療后，CA組織細(xì)胞VEGF和PCNA表達(dá)強度均下降

表1 ALA-PDT治療前后尖銳濕疣組織中VEGF和PCNA的表達(dá)強度 例

3.ALA-PDT治療前后尖銳濕疣組織中VEGF與PCNA表達(dá)的相關(guān)性：治療前后尖銳濕疣組織中VEGF與PCNA表達(dá)均呈正相關(guān)（rs值分別為0.202、0.273，均P ＜ 0.05）。

三、討論

VEGF是血管形成最強有力的調(diào)控因子，其表達(dá)降低能夠減少新生血管的生成。有文獻(xiàn)報道，VEGF在尖銳濕疣組織中呈高表達(dá)狀態(tài)，其表達(dá)強度和微血管密度存在明顯聯(lián)系［5］。ALA-PDT治療膠質(zhì)瘤24 h后，VEGF表達(dá)逐漸下降，最終抑制血管生成，進而達(dá)到抗腫瘤目的［6］。本研究結(jié)果顯示，尖銳濕疣組織中VEGF在ALA-PDT治療前高表達(dá)，而ALA-PDT治療后表達(dá)明顯減少，治療前后差異有統(tǒng)計學(xué)意義，推測ALA-PDT可通過降低VEGF表達(dá)而抑制血管的生成，這可能是ALA-PDT治療CA的作用機制之一，但具體機制有待進一步研究。

PCNA也是反映細(xì)胞增殖活性的指標(biāo)，參與多種生理過程，是細(xì)胞增殖狀態(tài)的理想標(biāo)志物［7］。既往研究發(fā)現(xiàn)，尖銳濕疣組織高表達(dá)PCNA［8］，表明尖銳濕疣組織角質(zhì)形成細(xì)胞增殖活躍。Xie等［9］觀察發(fā)現(xiàn)ALA-PDT治療后24 h，人鼻咽癌裸鼠腫瘤細(xì)胞中PCNA表達(dá)明顯降低。我們觀察發(fā)現(xiàn)，PDT治療后尖銳濕疣組織角質(zhì)形成細(xì)胞中PCNA表達(dá)率和表達(dá)強度均明顯降低，與Xie等［9］研究結(jié)果一致。提示ALAPDT能夠抑制尖銳濕疣組織角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖，但其確切機制尚不清楚，推測抑制血管生成可能是ALA-PDT抑制CA組織角質(zhì)形成細(xì)胞增殖的作用機制之一。

有研究表明，尖銳濕疣組織中存在VEGF和PCNA的過度表達(dá)，二者表達(dá)存在正相關(guān)性［10］。本研究結(jié)果顯示，ALAPDT治療后尖銳濕疣組織中VEGF與PCNA表達(dá)呈正相關(guān)，推測ALA-PDT通過抑制VEGF表達(dá)來抑制血管生成，進而抑制角質(zhì)形成細(xì)胞增殖，促進尖銳濕疣消退。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突