蕈樣肉芽腫皮損中TOX蛋白的表達(dá)及其診斷價(jià)值評(píng)估

張?bào)阊?王琳

四川大學(xué)華西醫(yī)院皮膚性病科，成都 610041

張?bào)阊悻F(xiàn)在川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院皮膚科，四川南充 637000

蕈樣肉芽腫（MF）是最常見(jiàn)的皮膚T細(xì)胞淋巴瘤（cutaneous T cell lymphoma，CTCL），約占所有皮膚淋巴瘤的50%［1］。隨著病情進(jìn)展，MF分為斑片期、斑塊期和腫瘤期。斑塊期和腫瘤期患者臨床及組織病理學(xué)改變具有特征性，診斷較為容易。而早期MF（斑片期）臨床表現(xiàn)差異較大，易與其他良性炎癥性皮膚病相混淆，組織病理學(xué)改變?nèi)狈μ禺愋?，炎癥細(xì)胞較多，而腫瘤細(xì)胞少，致T細(xì)胞受體基因重排容易出現(xiàn)假陰性，缺乏陽(yáng)性標(biāo)志物，需要更多可靠的指標(biāo)進(jìn)行早期預(yù)測(cè)。胸腺細(xì)胞選擇相關(guān)高遷移率族基因（thymocyte selection-associated high mobility group box gene，TOX基因）編碼TOX蛋白，TOX蛋白屬于高遷移率家族（high mobility group box，HMG-box）蛋白超家族的一員，主要通過(guò)修飾染色體結(jié)構(gòu)起轉(zhuǎn)錄因子的作用。2012年Zhang等［2］首次發(fā)現(xiàn)TOX在早期MF皮膚組織中的CD4+CD8-腫瘤T細(xì)胞中表達(dá)升高，在良性炎癥性皮膚病以及正常皮膚中不表達(dá)，從而提出TOX可能是診斷早期MF的分子標(biāo)志物。我們擬采用免疫組化法（SP法）檢測(cè)TOX在疑似MF、確診MF及良性炎癥性皮膚病中的表達(dá)情況，并結(jié)合前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果，探討TOX在MF中的診斷價(jià)值，尋找篩查及診斷早期MF的新方法。

材料與方法

1.材料：63份標(biāo)本均為四川大學(xué)華西醫(yī)院皮膚科病理室2003—2016年制備的石蠟包埋組織標(biāo)本。其中，30份為疑似MF病例標(biāo)本，23份為確診MF病例標(biāo)本，10份良性炎癥性皮膚病病例標(biāo)本。MF組織學(xué)診斷標(biāo)準(zhǔn)參照2008年WHO淋巴造血組織腫瘤分類(lèi)中對(duì)MF的組織學(xué)描述［3］。疑似MF病例是根據(jù)國(guó)際皮膚淋巴瘤學(xué)會(huì)和歐洲癌癥研究治療特別工作組（International Society for Cutaneous Lymphomas/European Organization for Research and Treatment of Cancer，ISCL/EORTC）提出的測(cè)算法則［4］，結(jié)合臨床表現(xiàn)及組織病理學(xué)改變高度懷疑為MF，但進(jìn)一步進(jìn)行免疫組化染色及T細(xì)胞受體基因重排（TCR-GR），未達(dá)到MF的診斷標(biāo)準(zhǔn)，即評(píng)分之和低于4分。

2.免疫組化檢測(cè)63份標(biāo)本中TOX蛋白表達(dá)

按鼠/兔共用二步法檢測(cè)試劑盒（美國(guó)Zymed公司）說(shuō)明進(jìn)行免疫組化染色。一抗為兔抗人TOX多克隆抗體（美國(guó)Sigma公司），工作濃度1∶400，二抗為標(biāo)記有辣根過(guò)氧化物酶的抗兔及抗小鼠免疫球蛋白的多聚物分子（美國(guó)Zymed公司）。將石蠟切片經(jīng)過(guò)脫蠟、水化、蛋白封閉、一抗孵育、二抗孵育、DAB染色、蘇木素復(fù)染核、脫水、透明、封片等步驟后，顯微鏡下觀察。細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒為染色陽(yáng)性。參考Fromowitz半定量積分法［5］和相關(guān)文獻(xiàn)［6-7］判定結(jié)果：隨機(jī)觀察5個(gè)400倍視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，陽(yáng)性細(xì)胞比例≤10%為陰性，＞10%為陽(yáng)性。結(jié)果由2名皮膚病理科醫(yī)生判定。

3.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件，卡方檢驗(yàn)分析比較各組間TOX蛋白表達(dá)的陽(yáng)性率，P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

30份疑似MF病例中，26份（86.7%）TOX蛋白表達(dá)陽(yáng)性，表現(xiàn)為表皮及真皮淺層散在TOX陽(yáng)性細(xì)胞（圖1A）。

23例確診MF病例中，20份（87%）TOX蛋白表達(dá)陽(yáng)性，3例陰性（2例為斑片期，1例為斑塊期）。10例斑片期中8例表達(dá)TOX蛋白，表現(xiàn)為表皮內(nèi)散在及真皮淺層較多TOX陽(yáng)性細(xì)胞（圖1B）；7例斑塊期中6例表達(dá)TOX，表現(xiàn)為表皮內(nèi)散在及真皮淺中層密集TOX陽(yáng)性細(xì)胞（圖1C）；6例腫瘤期病例均表達(dá)TOX蛋白，表現(xiàn)為表皮內(nèi)散在及真皮全層大量TOX陽(yáng)性細(xì)胞呈團(tuán)塊狀浸潤(rùn)（圖1D、1E），真皮內(nèi)陽(yáng)性細(xì)胞核大、深染，異形性明顯（圖1F）。

10份良性炎癥性皮膚病標(biāo)本中，3份TOX陽(yáng)性（銀屑病2例、慢性濕疹1例）（圖1G、1H）。

卡方檢驗(yàn)顯示，疑似MF組和MF組TOX陽(yáng)性率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.000 95，P=0.975）；疑似MF組織中TOX陽(yáng)性率明顯高于良性炎癥性皮膚病組（χ2=12.079，P=0.000 5），MF組亦高于良性炎癥性皮膚病組（χ2=10.705，P=0.001）。

討 論

TOX基因于 2002年由Wilkinson等［8］首次命名，他們發(fā)現(xiàn)處于分化階段的小鼠CD4+和CD8+胸腺細(xì)胞中TOX基因表達(dá)明顯升高。目前已證實(shí)，TOX基因與多種腫瘤相關(guān)，包括肺癌、乳腺癌、淋巴瘤、白血病等。2012年Zhang等［2］首次發(fā)現(xiàn)，TOX在早期MF皮損組織中的CD4+CD8-腫瘤T細(xì)胞中表達(dá)升高，在良性炎癥性皮膚病以及正常皮膚中不表達(dá)，從而提出TOX可能是診斷早期MF的分子標(biāo)志物。其后陸續(xù)有其他研究表明，TOX不僅表達(dá)于MF皮損組織中，在其他皮膚T細(xì)胞淋巴瘤、良性炎癥性皮膚病甚至正常皮膚中均有所表達(dá)［9-10］。同時(shí)也有研究顯示，TOX的表達(dá)不僅限于CD4+CD8-腫瘤T細(xì)胞中，在CD4-CD8+、CD4-CD8-和CD30+腫瘤T細(xì)胞中均可表達(dá)，甚至在部分皮膚B細(xì)胞淋巴瘤中也有表達(dá)［11］。因此有學(xué)者認(rèn)為，TOX對(duì)于MF的診斷不具有特異性［7］。

圖1 TOX蛋白在疑似和確診蕈樣肉芽腫（MF）及良性炎癥性皮膚?。˙ID）組織中的表達(dá)（SP法） 1A：疑似MF標(biāo)本中可見(jiàn)真皮淺層散在TOX陽(yáng)性細(xì)胞（×25）；1B：斑片期MF皮損中可見(jiàn)真皮淺層較多TOX陽(yáng)性細(xì)胞（×25）；1C：斑塊期MF皮損中可見(jiàn)真皮淺中層密集TOX陽(yáng)性細(xì)胞（×25）；1D：腫瘤期MF皮損中可見(jiàn)真皮全層大量TOX陽(yáng)性細(xì)胞呈團(tuán)塊狀浸潤(rùn)（×25）；1E：腫瘤期MF皮損中表皮內(nèi)散在分布的TOX陽(yáng)性細(xì)胞（箭頭）（×100）；1F：腫瘤期MF皮損中真皮內(nèi)可見(jiàn)密集TOX陽(yáng)性細(xì)胞，這些細(xì)胞核大、深染，異形性明顯（×400）；1G：部分BID皮損真皮淺層可見(jiàn)散在TOX陽(yáng)性細(xì)胞，但染色較淺（×25）；1H：部分BID皮損不表達(dá)TOX，均為背景染色，細(xì)胞未著色（×25）

本研究發(fā)現(xiàn)，在不同階段MF皮損中，TOX均有不同程度表達(dá)。與良性炎癥性皮膚病組相比，MF組TOX表達(dá)陽(yáng)性率明顯增高。3份TOX表達(dá)陽(yáng)性的良性炎癥性皮膚病標(biāo)本分別來(lái)自銀屑病和慢性濕疹病例，結(jié)合既往報(bào)道，我們推測(cè)TOX并非特異地表達(dá)于腫瘤細(xì)胞中，在反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞中也可表達(dá)，但表達(dá)強(qiáng)度及表達(dá)率均偏低。我們還發(fā)現(xiàn)，疑似MF組TOX蛋白表達(dá)率明顯高于良性炎癥性皮膚病組，但與MF組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本文疑似MF病例雖然并未診斷為MF，但30份標(biāo)本均可見(jiàn)不同程度異形淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，在這些異形細(xì)胞中部分可檢測(cè)到TOX蛋白表達(dá)，此類(lèi)細(xì)胞有可能是MF細(xì)胞，但仍需研究證實(shí)。

TCR基因重排是MF診斷及鑒別診斷的有效輔助方法［12］，但是由于早期MF皮損標(biāo)本中腫瘤細(xì)胞較少，混雜有大量反應(yīng)性炎癥細(xì)胞，導(dǎo)致早期MF的T細(xì)胞受體基因重排（TCR-GR）檢出率較低。本課題組前期嘗試使用激光捕獲顯微切割（laser capture microdissection，LCM）制備DNA模板，LCM可在不破壞組織結(jié)構(gòu)的前提下，直接獲取更為純凈的目標(biāo)細(xì)胞［13］，并成功證實(shí)，在疑似MF和確診MF病例中，使用LCM法比傳統(tǒng)氯-酚仿法制備DNA模板能檢出更多的陽(yáng)性病例，尤其是在早期MF病例中，所以認(rèn)為L(zhǎng)CM聯(lián)合PCR技術(shù)檢測(cè)TCR-GR是早期MF的有效輔助診斷手段［14］。

腫瘤細(xì)胞的克隆性增殖需要多種信號(hào)通路參與，目前已有研究證實(shí)，TOX可通過(guò)激活A(yù)KT和PI3K/AKT通路促進(jìn)MF腫瘤細(xì)胞的增殖和播散，具有致癌作用。所以我們推測(cè)，TOX的表達(dá)與TCRGR之間具有正相關(guān)性，但目前尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)63份標(biāo)本中29份（15份疑似早期MF、8份典型MF、6份良性炎癥性皮膚病）在早期由本課題組分別使用酚-氯仿法和LCM法制備DNA模板，用PCR檢測(cè)TCR-GR［14］。將TOX蛋白表達(dá)情況分別與兩種方法制備模板后進(jìn)行的TCR-GR檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析顯示，TOX蛋白表達(dá)與基于酚-氯仿法制備模板的TCR-GR檢測(cè)結(jié)果無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)性（r=1.00，P＞0.05），但與LCM法制備模板的TCR-GR檢測(cè)結(jié)果呈正相關(guān)（r=0.493，P＜0.01）。

在臨床上，有部分患者可檢測(cè)到克隆性T細(xì)胞群，但缺乏MF的組織病理學(xué)特征，有學(xué)者將其稱(chēng)之為“克隆性皮炎”或者“發(fā)育不全/潛在淋巴瘤”［15-16］，長(zhǎng)期隨訪顯示，他們發(fā)展為MF的風(fēng)險(xiǎn)更高［16-17］。所以，盡早發(fā)現(xiàn)此類(lèi)患者并進(jìn)行早期干預(yù)顯得尤為重要。盡管本課題組前期實(shí)驗(yàn)及大量文獻(xiàn)均顯示，LCM聯(lián)合PCR技術(shù)可提高TCR-GR的檢出率，有助于早期MF的診斷，但在實(shí)際工作中，由于LCM需要特殊的設(shè)備，所以臨床應(yīng)用受限，大部分醫(yī)院尤其是基層醫(yī)院仍使用傳統(tǒng)方法制備DNA模板，以致TCR-GR仍存在漏檢的現(xiàn)象，這對(duì)于早期MF及“克隆性皮炎”的患者來(lái)說(shuō)，可能耽誤其診斷及治療。因此，針對(duì)這類(lèi)患者需要尋找一些輔助標(biāo)記以確定其是否為MF，或者M(jìn)F的可能性。MF中TOX蛋白雖然特異性較差，但敏感性較好，本研究顯示TOX蛋白表達(dá)與LCM檢測(cè)的TCR-GR結(jié)果具有較好的正相關(guān)性，基于此，我們推測(cè)，在無(wú)法使用LCM對(duì)TCR-GR進(jìn)行檢測(cè)的情況下，TOX可作為替代手段對(duì)早期MF及“克隆性皮炎”患者進(jìn)行篩查，對(duì)TOX表達(dá)陽(yáng)性的患者，應(yīng)提高警惕，進(jìn)一步結(jié)合其他輔助檢查方法進(jìn)行判斷，對(duì)仍不能確診MF的患者，應(yīng)加強(qiáng)隨訪。

總之，本研究顯示，TOX在MF、疑似MF病例中的表達(dá)明顯高于良性炎癥性皮膚病，我們認(rèn)為T(mén)OX可作為MF的分子標(biāo)志物之一，敏感性較好，但特異性較差。MF尤其是早期MF的診斷仍面臨巨大的挑戰(zhàn)，目前尚無(wú)單一標(biāo)準(zhǔn)能夠確診，臨床聯(lián)系病理并結(jié)合免疫組化、分子生物學(xué)等其他輔助手段是診斷的關(guān)鍵，尋找更優(yōu)化的診斷方法任重而道遠(yuǎn)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突