耐力訓(xùn)練對(duì)兔心房肌細(xì)胞IKAch和心房顫動(dòng)的影響

袁斗，路敏，譚琛，姚建民，李丹，黃思慧，武忠

有計(jì)劃的有氧耐力運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練誘導(dǎo)心臟發(fā)生的生理性的適應(yīng)性改變，如生理性肥厚和重構(gòu)，稱為運(yùn)動(dòng)員心臟。大多數(shù)運(yùn)動(dòng)愛好者或運(yùn)動(dòng)員均超出5～10倍或以上的推薦運(yùn)動(dòng)量或運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度，部分達(dá)到了高等運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度[1]。有規(guī)律的運(yùn)動(dòng)可以引起心臟機(jī)能產(chǎn)生良好適應(yīng)性變化，并降低心血管疾病的危險(xiǎn)性[2]，而高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)則常伴有各樣的心血管疾病[2-4]，其對(duì)心臟的結(jié)構(gòu)、電生理機(jī)能等可造成嚴(yán)重?fù)p害[5]，甚至運(yùn)動(dòng)者出現(xiàn)心源性猝死；近年來多項(xiàng)研究[6-8]中均證實(shí)接受長(zhǎng)時(shí)間，高強(qiáng)度的耐力訓(xùn)練者的房顫發(fā)生率明顯增高。而治療方法的選擇依賴于機(jī)制的確定，為此本研究通過我們前期研究的兔運(yùn)動(dòng)性房顫模型[9]來力求發(fā)現(xiàn)了一種潛在的過度運(yùn)動(dòng)促進(jìn)房顫發(fā)生的病理生理機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物運(yùn)動(dòng)模型的制備實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選擇33只成年健康新西蘭大耳白兔，體重3.0～4.0 kg，雌雄不拘，由北京海淀興旺實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖場(chǎng)提供。實(shí)驗(yàn)兔在本實(shí)驗(yàn)室經(jīng)適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，將其隨機(jī)分為3組，每組11只，包括對(duì)照組、中強(qiáng)度耐力運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練組（Groups M）、高強(qiáng)度耐力運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練組（Groups H）。其中對(duì)照組不做任何處理，籠內(nèi)生活，自由飲食。耐力運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練組，采用兔實(shí)驗(yàn)跑臺(tái)（由北京智鼠多寶生物科技有限公司研制），練持續(xù)16周（第1周為適應(yīng)性訓(xùn)練），每周5 d，每天1 h或一次性力竭（不足1 h）。Groups M：坡度0度，速度15 m/min，Groups H：坡度0度，速度30 m/min。在訓(xùn)練過程中為了保證訓(xùn)練質(zhì)量，我們輕拍其背部，讓其繼續(xù)跑動(dòng)[9]。

1.2 固有心率（IHR）的檢測(cè)適應(yīng)性喂養(yǎng)后，第一次檢測(cè)各組兔IHR，以后每隔8周檢測(cè)一次，共3次。實(shí)驗(yàn)兔用0.5%戊巴比妥經(jīng)耳緣靜脈麻醉后，用普羅奈爾0.5 mg/kg 耳緣靜脈注射，10 min后給予阿托品 0.25 mg/kg耳緣靜脈注射，觀察用藥后10 min內(nèi)的最慢心率即為IHR。

1.3 兔電生理實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蜏?zhǔn)備訓(xùn)練目標(biāo)完成后，各組實(shí)驗(yàn)兔隨機(jī)各取6只，用3%戊巴比妥經(jīng)耳緣靜脈麻醉后，開胸取出心臟，在溫度37℃、速度20 ml/min下行Langendorff經(jīng)主動(dòng)脈逆向灌流，灌流液為改良的Krebs-Henseleit（K-H）緩沖液（NaCl：118，KCl：2.8, KH2PO4：1.2；CaCL2：2.5；MgSO4：0.5；丙酮酸：2.0；NaHCO3：25；葡萄糖：5.5；Na2EDTA：0.57，mmol/L）。從右心耳部置入雙極特氟龍涂層的起搏電極，在基礎(chǔ)頻率3.3 Hz，電刺激脈沖的脈寬是3 ms，刺激電壓幅度是起搏閾值的3倍，應(yīng)用心臟程序刺激法（S1S2）起搏（Astro-Med公司Grass-S88X型刺激儀，美國(guó)）。12導(dǎo)聯(lián)心電圖采用具備Wilson終端的模擬的非接觸式12導(dǎo)聯(lián)心電圖記錄系統(tǒng)（Harvard Apparatus公司，美國(guó)）采集心電信號(hào)，所有心電信號(hào)經(jīng)Biopac心電放大系統(tǒng)處理后存儲(chǔ)于計(jì)算機(jī)（實(shí)驗(yàn)完成后分別剪取各組實(shí)驗(yàn)兔左心房組織標(biāo)記并存于液氮罐中備用）。

1.3.1 APD90的記錄及AERP的測(cè)定在左心耳遠(yuǎn)端置入單極特氟龍涂層的記錄電極，待心臟穩(wěn)定后，記錄從左房單相APD90；測(cè)定AERP：采用S1S2刺激反向掃描法，S1S2呈8:1，步長(zhǎng)為3 ms，基礎(chǔ)起搏周長(zhǎng)303 ms，S1S2偶聯(lián)間期從120 ms開始以2 ms步長(zhǎng)遞減。AERP定義為S2不能引起心房激動(dòng)的最長(zhǎng)S1S2周期[10]。

1.3.2 誘發(fā)房顫測(cè)定AERP結(jié)束后，從不應(yīng)期開始逐漸增加S1S2的刺激周長(zhǎng)（增加步長(zhǎng)2 ms)直到連續(xù)增加刺激周長(zhǎng)不能誘發(fā)房顫為止。

1.3.3 給藥方法生理鹽水配置分別乙酰膽堿（Ach）、阿托品溶液，用微量注射泵經(jīng)灌流系統(tǒng)分別向冠脈內(nèi)注入乙酰膽堿（1 μm/L Ach）+不同濃度阿托品溶液（0、0.0001、0.0005、0.001、0.002 mg/ml），給藥15～20 min后，藥物達(dá)到終濃度，開始記錄并測(cè)定電生理指標(biāo)。

1.4 心房肌細(xì)胞急性分離及全細(xì)胞膜片鉗取訓(xùn)練目標(biāo)完成后各組剩余實(shí)驗(yàn)兔5只，共15只，用3%戊巴比妥經(jīng)耳緣靜脈麻醉后，開胸取出心臟，放入用氧飽和的無鈣臺(tái)式液（mmol/L：MgCL21.0、NaCL 137、NaH2PO40.33、HEPES 10、KCL 5.4、Glucose 10，PH用NaOH調(diào)至7.4在25℃）中沖洗，沖洗完畢后，心臟懸掛并用絲線固定在Langendorff滴灌頭上，在溫度37℃、速度10～12ml/min下行經(jīng)主動(dòng)脈逆向Langendorff灌流，先用鈣臺(tái)式液（在無鈣臺(tái)式液中加入CaCL2，使Ca濃度為1.8 mmol/L）灌流2～3 min使心臟復(fù)跳泵出心腔內(nèi)殘血，再用無鈣臺(tái)式液灌流3～5 min排出冠脈內(nèi)血液并使心臟停跳，最后改用酶解液（于50 ml無鈣臺(tái)式液中加入Collagenase Ⅱ 20 mg和Trypsin 2 mg）循環(huán)灌流20～25 min（如圖1）。待心房半透明時(shí)且呈現(xiàn)疏松、膨脹狀態(tài)，剪下左心房分別置于KB液中并迅速剪成1 mm3的小組織塊，吸管間斷輕輕吹打，使細(xì)胞松散脫離組織塊，在低倍顯微鏡下吹打至單個(gè)細(xì)胞充滿視野。用150目的尼龍紗網(wǎng)過濾細(xì)胞懸液。分離出的單個(gè)心房肌細(xì)胞在KB液（mmol/L：KCL 39.97、KOH 80、HEPES 10.7、KH2PO425、MgSO47H2O 3、Glucose 10.09、EGTA 0.53、Taurine 19.98、L-glutamic acid 50.3，PH用KOH調(diào)至7.4在25度，或7.3在35度）中保存，室溫下穩(wěn)定1 h后備用（灌流液和KB液均通100% O2飽和20 min以上，灌流時(shí)仍然保持通氧狀態(tài)）。分離后細(xì)胞存活率85%以上，細(xì)胞外形完整，折光性良好，橫紋清晰（圖2）。

實(shí)驗(yàn)前，吸取混勻后的細(xì)胞懸液0.5 ml滴入灌流槽中，靜置10 min，待細(xì)胞自然貼壁后，再以100%O2飽和的細(xì)胞外液（mmol/L：CaCL20.65、MgCL25.0、HEPES 5.0、N-methyl-D-glucamine 149.0，PH值用HCL調(diào)至7.4）灌流5～10 min，沖洗細(xì)胞，至清晰視野后，于灌流槽中分別加入Dof 5 nm/L阻斷IKr，CdCl2100 μm/L阻斷ICa，L,TTX 100 μm/L阻斷INa，4-AP 50 μm/L阻斷Ito，Glibenclamide 10 μmol/L阻斷IK-ATP）。采用全細(xì)胞膜片鉗記錄法[11]，在電壓鉗制模式下記錄IKAch電流，電極充滿細(xì)胞內(nèi)液（mmol/L：KCL 45.0、K-aspartate 85.0、Na-pytuvate 5.0、MgATP 5.0、HEPES 10.0、EGTA 10.0、Glucose 11.0，PH值用KOH調(diào)至7.4）的入液電阻為2～3 MΩ。調(diào)節(jié)電位補(bǔ)償、三維操縱器使電極尖端與細(xì)胞表面形成穩(wěn)定接封，給予電極內(nèi)負(fù)壓吸引，形成高阻封接（電阻達(dá)l GO以上）。穩(wěn)定5 min后啟動(dòng)應(yīng)用軟件pClampex 10.0中的刺激程序（IK-Ach的I-V曲線的刺激方案為Vh-40 mV，Vt從-100 mV開始，以10 mV階躍刺激至+60 mV，鉗制時(shí)間300 ms，采樣頻率0.2 kHz），觀察并記錄細(xì)胞膜離子通道電流，用電流密度（pA/pF）表示離子通道電流大?。ㄊ覝?2～24 ℃下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)）。

圖1 Langendorff灌流分離兔心房肌細(xì)胞

1.5 RT-PCR檢測(cè)kir3.1、kir3.4 mRNA表達(dá)于液氮灌中取出各組兔左心房組織100 mg，用Trizol法提取各組左心房組織mRNA溶液，經(jīng)濃度和純度檢測(cè)后，行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)（模板RNA 4 μg、50 μM反轉(zhuǎn)錄引物T18 4.0 μl、DEPC處理H2O至24 μl→ 混勻、70 ℃ 5 min，立即冰浴→5×buffer 8.0 μl、10 mM dNTP 2.0 μl、RNase Inhibito 1 μl、M-MuLV 2.0 μl、補(bǔ)足DEPC水至40 μl→42 ℃ 60 min，70 ℃ 15 min→在冰上冷卻5 min備用 ）獲取mRNA的cDNA，以PT-PCR法將cDNA進(jìn)行擴(kuò)增（2×Ex TaqMix 12.5 μl、10 μM引物F/R混合物0.5 μl、Eva green 1.25 μl、l對(duì)應(yīng)的模板cDNA各1 μl，其中一管不加模板用GAPDH作陰性對(duì)照，補(bǔ)加ddH2O至25 μl?；靹蚝笾糜赑CR儀中擴(kuò)增：95 ℃ 5 min預(yù)變性，95 ℃ 30 s→66 ℃ 20 s（熒光檢測(cè)），40 cycles，4 ℃ pause）。采用2-△△CT法計(jì)算kir3.1、kir3.4基因的相對(duì)表達(dá)量。引物：北京中美泰和生物科技有限公司合成，引物信息（表1）。

圖2 單個(gè)兔心房肌細(xì)胞

表1 引物信息

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用one-way 或two-way多組間比較；計(jì)數(shù)資料采用例數(shù)（百分比）表示，采用卡方檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用Graph Pad Prism5.0繪圖。

2 結(jié)果

2.1 不同訓(xùn)練強(qiáng)度對(duì)兔心臟IHR的影響訓(xùn)練前Group C、M、 H各組之間相互比較均無統(tǒng)計(jì)差異（P=0.931、P=0.948和P=0.983）；8周時(shí)：與訓(xùn)練前比較，高強(qiáng)度訓(xùn)練組IHR低于訓(xùn)練前，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；組間比較：Group Mvs. Group C and H均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.139和P=0.099），高強(qiáng)度訓(xùn)練組兔心臟IHR低于對(duì)照組（Group H＜Group C=差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.004）；16周時(shí)：與訓(xùn)練前比較，訓(xùn)練組IHR均低于訓(xùn)練前，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；隨著運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度增加，兔心臟IHR降低，Group C＞Group M＞Group H差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）（圖3）。

2.2 不同訓(xùn)練強(qiáng)度對(duì)兔心房肌細(xì)胞APD90、ERP及AF發(fā)生率的影響不同組間，Ach背景相同，相同劑量阿托品（0～0.002 mg/ml）作用下高強(qiáng)度耐力運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練組APD90、AERP小于其他兩組，AF發(fā)生率高于其他兩組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Group Hvs. Group C and M，P＜0.001），而Group Cvs. Group M之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.488）；組內(nèi)比較，隨著阿托品劑量增加（0～0.002 mg/ml）APD90、AERP相應(yīng)延長(zhǎng)（P＜0.05），AF發(fā)生率降低有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）（圖4）。

2.3 不同強(qiáng)度耐力運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)兔心房肌細(xì)胞IKAch的作用Group H:IKAch電流密度在左房肌細(xì)胞較Group C、M顯著的增大[-100 mV:（14.18±1.74）vs.（9.92±1.20）和（11.07±1.95）pA/pF；+50 mV：（10.75±1.68）vs.（5.57±0.59）和（8.25±0.85）pA/pF；P＜0.003），Group M在+50 mV時(shí)電流密度增大（vs. Group C，P=0.001），在-100 mV時(shí)電流密度無顯著變化（vs. Group C，P=0.249）（圖5～6）。

圖3 不同強(qiáng)度的耐力運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練下兔IHR的變化

圖4 Ach及Ach+不同濃度阿托品對(duì)不同強(qiáng)度的耐力運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練下兔左心房APD90（A）、AERP（B）和AF發(fā)生率（C）的影響

2.4 不同強(qiáng)度耐力運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)兔心房肌細(xì)胞IKAch電流-電壓曲線的影響IKAch電流內(nèi)向成分隨刺激脈沖的正向移動(dòng)而減小，在-50 mV時(shí)反轉(zhuǎn)為外向電流，在電位反轉(zhuǎn)前，Group H電流密度明顯增大，隨著電壓更負(fù)的方向移動(dòng)，增大越明顯，而Group M則無此現(xiàn)象。隨著運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度的增加反轉(zhuǎn)電位以上不同鉗制電壓下均使IKAch電流增加，表現(xiàn)為電流-電壓關(guān)系上移，但耐力運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)反轉(zhuǎn)電位和整流特性沒有明顯影響（圖7）。

2.5 不同強(qiáng)度耐力運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練組兔左心房組織Kir3.1和Kir3.4 mRNA表達(dá)變化左心房組織Kir3.1和Kir3.4的 mRNA表達(dá)量均隨著運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度增加而增加（Group Hvs. Group C、M，Group Mvs. Group C，P＜0.05）（表2）。

圖5 兔心房組織IKAch電流密度

圖6 不同強(qiáng)度的運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)兔左心房組織IKAch電流密度的影響：鉗制電壓為-100 mv（A），鉗制電壓為+50 mv（B）

圖7 不同強(qiáng)度的運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)兔左心房組織IKAch電流-電壓曲線的影響

表2 不同強(qiáng)度的運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)兔心房組織Kir3.1和Kir3.4 mRNA表達(dá)量（2-△△CT）

3 討論

有計(jì)劃的有氧耐力運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練誘導(dǎo)心臟發(fā)生的生理性的適應(yīng)性改變，如生理性肥厚和重構(gòu)，稱為運(yùn)動(dòng)員心臟。我們的運(yùn)動(dòng)兔有著和人運(yùn)動(dòng)心臟一樣的表現(xiàn)：心率減慢、心肌肥厚、心房增大[9]等，過度的運(yùn)動(dòng)且長(zhǎng)時(shí)間刺激進(jìn)一步使紊亂的生理平衡加劇，導(dǎo)致一系列心血管調(diào)控功能失常改變，如竇房結(jié)功能、心房電生理特性[12]，目前高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)促進(jìn)房顫的機(jī)制知之甚少，本研究我們注意到了3種可能性：心房擴(kuò)張[9]，竇房結(jié)功能改變，迷走神經(jīng)張力增強(qiáng)。心房擴(kuò)張是運(yùn)動(dòng)員心臟的一個(gè)典型特征[13]，心房擴(kuò)張是房顫促進(jìn)的決定因素[14-17]。

目前公認(rèn)長(zhǎng)期運(yùn)動(dòng)后心率變緩副交感神經(jīng)緊張性增加，交感神經(jīng)興奮性降低導(dǎo)致的[18-20]；交感神經(jīng)主要作用于心臟的竇房結(jié)和房室結(jié)的傳導(dǎo)性及自律性[21]；多數(shù)研究表明[22,23]心臟自主神經(jīng)系統(tǒng)可導(dǎo)致觸發(fā)活動(dòng)或折返，從而誘發(fā)房顫，由于IHR是全部阻斷自主神經(jīng)系統(tǒng)對(duì)心臟的支配后，竇房結(jié)自身頻率的反映，是監(jiān)測(cè)竇房結(jié)自律性功能的一項(xiàng)指標(biāo)。有研究表明[24]反復(fù)力竭運(yùn)動(dòng)可引起竇房結(jié)細(xì)胞自律活動(dòng)減慢，這與我們研究運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練后IHR明顯較運(yùn)動(dòng)前慢，且高強(qiáng)度組減慢幅度明顯大于其他組相一致。由此我們認(rèn)為長(zhǎng)期的運(yùn)動(dòng)訓(xùn)使竇房結(jié)自律性發(fā)生改變[25]，使竇房結(jié)自律性降低，使其對(duì)異位興奮的抑制作用減弱，從而房顫易于發(fā)生。可能由于反復(fù)高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)可引起竇房結(jié)細(xì)胞缺血缺氧及離子通道功能活動(dòng)的改變，從而竇房結(jié)節(jié)律被打亂，引起房顫[24]。

KAch是由Kir3.1和Kir3.4所編碼的鉀離子通道，主要存在于哺乳動(dòng)物心房組織中，能被迷走神經(jīng)興奮所釋放的Ach激活，是受G蛋白調(diào)節(jié)的，是心房相對(duì)特異性的鉀離子通道，是調(diào)節(jié)心房肌膜電位和動(dòng)作電位復(fù)極為主要功能，降低心肌收縮力、興奮性和自律性[26-28]。

房顫的發(fā)生與IKAch的關(guān)系，說法不一。諸多學(xué)者研究[29,30]發(fā)現(xiàn)房顫患者心房肌細(xì)胞中IKAch顯著增高，認(rèn)為IKAch與房顫的發(fā)生有著密切關(guān)系；但亦有許多研究者[31,32]研究持反向觀點(diǎn)。本研究在灌流液中加入IKAch激活劑Ach記錄結(jié)果顯示高強(qiáng)度組實(shí)驗(yàn)兔房顫的可誘導(dǎo)性顯著高于其他兩組；同時(shí)在Ach背景下加入不同濃度IKAch抑制劑阿托品記錄表明同組實(shí)驗(yàn)兔隨著阿托品劑量增加房顫的可誘導(dǎo)性降低，但在相同阿托品劑量下，高強(qiáng)度組實(shí)驗(yàn)兔房顫的可誘導(dǎo)性高于其他兩組，APD、AERP隨著運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度的增加而縮短，隨著阿托品劑量的增加而相應(yīng)延長(zhǎng)；Ach激活I(lǐng)KAch能導(dǎo)致房顫的發(fā)生，阻斷IKAch能減少房顫的發(fā)生，此結(jié)果與Kovoor等[33]研究結(jié)果相一致。因此我們可認(rèn)為高強(qiáng)度的耐力運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練使兔心臟心肌細(xì)胞膜KAch數(shù)量增加或功能增強(qiáng)。為此我們進(jìn)一步研究表明隨著運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度的增加實(shí)驗(yàn)兔心房肌細(xì)胞膜Kir3.1和Kir3.4的mRNA表達(dá)增加且單個(gè)心房肌細(xì)胞IKAch電流密度也相應(yīng)提高，高強(qiáng)度的耐力運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練使兔心臟心房肌細(xì)胞膜上KAch數(shù)量增加和KAch功能增強(qiáng)；而房顫發(fā)生機(jī)制[34-38]之一：心臟迷走神經(jīng)張力增加，釋放的神經(jīng)遞質(zhì)Ach與心房肌細(xì)胞膜上M2受體結(jié)合，在GTP結(jié)合蛋白作用下激活的KAch通道；增加細(xì)胞內(nèi)K+外流，加快細(xì)胞復(fù)極，致使APD、AERP縮短，多波折返的發(fā)生，并且心房傳導(dǎo)減慢和心房擴(kuò)大使AERP離散度的增加，從而使心房的異位激動(dòng)增加，進(jìn)而心房?jī)?nèi)差異性傳導(dǎo)突出，形成心房?jī)?nèi)的折返或微折返，最終誘發(fā)房顫。

我們認(rèn)為實(shí)驗(yàn)兔在長(zhǎng)期的高強(qiáng)度耐力運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練后，心房擴(kuò)大，心迷走神經(jīng)分布增多且不均，而心房肌細(xì)胞膜長(zhǎng)期的接受大量乙酰膽堿刺激，以致Kir3.1和Kir3.4的mRNA表達(dá)水平增加、與其所編碼的KAch通道數(shù)量增加、功能增強(qiáng)，為房顫的誘發(fā)及維持提供結(jié)構(gòu)及物質(zhì)基礎(chǔ)。又由于心房擴(kuò)大、心房?jī)?nèi)迷走神經(jīng)末梢分布不均一，IKAch激活亦不均一，縮短APD和AERP，心房折返波長(zhǎng)縮短，最終導(dǎo)致的房顫發(fā)生。