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    尼古丁通過抑制JAK/STAT通路對HUVECs增殖和凋亡的影響研究

    2020-03-21 08:31:32王思雯張珺馬君張璐
    關鍵詞:尼古丁心腦血管內皮細胞

    王思雯,張珺,馬君,張璐

    吸煙是影響多種疾病發(fā)生的風險因素,包括肺癌、高血壓、動脈硬化、胃部疾病和腦部疾病。尼古?。╪icotine)又名煙堿,是煙草中的主要有害成分之一,會直接引起肺細胞凋亡損傷,近年來有研究發(fā)現(xiàn)尼古丁會直接影響血管內皮細胞的生長,誘發(fā)心腦血管疾病,但是尼古丁對血管內皮細胞的影響效果和機制尚不明確[1-3]。JAK/STAT信號通路是一種快速傳遞的信號通路,參與激活各種細胞因子與受體結合并參與細胞的增殖、凋亡和分化[4]。本次研究主要分析尼古丁對人臍靜脈血管內皮細胞(HUVECs)的影響以及對JAK/STAT通路的影響,探究尼古丁對血管內皮細胞的影響。

    1 材料與方法

    1.1 實驗材料HUVECs購自ATCC(美國)。MEM培養(yǎng)基以及胎牛血清購自Gibco(美國)。尼古丁購自Sigma(美國)。CCK-8試劑盒和凋亡試劑盒購自Dojindo(日本)。酶標儀型號ELX 800,公司為Bio-Teck(美國)。流式細胞儀購自BD公司(美國)。JAK、p-JAK、STAT、p-STAT、Bax、Bcl-2和Caspase-3一抗體和二抗均來自Abcam公司(美國)。PVDF膜(Bio-Rad,美國)。PCR引物由Genewiz(蘇州,中國)設計和合成。逆轉錄試劑盒TaKaRa和SYBR Prellix Ex TaqTM實時PCR試劑盒購自TaKaRa(日本)。

    1.2 細胞分組與培養(yǎng)HUVECs在含有10%的胎牛血清的MEM培養(yǎng)基中培養(yǎng),培養(yǎng)條件為37℃,5%的CO2,相對濕度95%。將細胞分為對照組、尼古丁1組、尼古丁2組、尼古丁3組,分別在培養(yǎng)基中加入終濃度為0、10-8、10-7、10-6mol/L的尼古丁,培養(yǎng)24 h。

    1.3 檢測方法

    1.3.1 顯微鏡觀察在培養(yǎng)48 h后,使用顯微鏡觀察細胞形態(tài)。

    1.3.2 CCK-8檢測細胞活力CCK-8法被應用于測定細胞活力。將細胞接種于96孔板,加入10 μl CCK-8試劑并在37℃,5%的CO2中培養(yǎng)4 h。使用酶標儀測量每個孔在450 nm處的吸光度(OD)。

    1.3.3 流式細胞術檢測細胞凋亡流式細胞術用于檢測細胞凋亡情況,細胞洗滌、重懸后分別按照試劑盒說明書加入試劑,通過流式細胞儀檢測凋亡率。

    1.3.4 Western blot使用Western Blot檢測細胞中JAK、p-JAK、STAT、p-STAT蛋白水平。在液氮的保護下裂解細胞,在12000 rpm,4℃下離心15 min收集上清液,使用BCA方法確定蛋白質濃度。使用10%的SDS-PAGE凝膠用于電泳,電泳后使用PVDF膜轉膜并在室溫下用5%無脂牛奶封閉2 h。加入一抗室溫震蕩2 h,后在4℃孵育過夜,加入二抗。使用GAPDH作為內參。

    1.3.5 PCR使用PCR法檢測Bax、Bcl-2和Caspase-3 mRNA表達。細胞裂解后收集總RNA,通過在95℃下激活DNA聚合酶5 min進行PCR,然后進行40個循環(huán)(95℃/10 s和60℃/30 s),最終延伸72℃下10 min,保持在4°C,GAPDH作為內參,使用2-ΔΔCT法分析mRNA水平。

    1.4 統(tǒng)計學處理實驗數(shù)據(jù)均以平均值±標準偏差(SD)表示。統(tǒng)計分析使用SPSS 19(SPSS,Inc.,Chicago,IL,USA)。進行單因素方差分析(ANOVA)以評估實驗組之間的差異。統(tǒng)計學顯著性表示為P<0.05。

    2 結果

    2.1 尼古丁對細胞形態(tài)的影響使用顯微鏡觀察尼古丁對細胞形態(tài)的影響,結果顯示對照組和尼古丁1組中內皮細胞呈現(xiàn)多邊形,胞漿豐富,邊界清晰,并且細胞排列緊密,呈現(xiàn)鋪路石狀態(tài)。而尼古丁2組細胞出現(xiàn)輕微的萎縮,排列緊密度降低,尼古丁3組的細胞呈現(xiàn)萎縮狀態(tài)(圖1)。

    2.2 尼古丁對細胞活力的影響在干預后12 h和24 h,尼古丁可劑量依賴性的抑制HUVECs活力(表1)。

    2.3 尼古丁對細胞凋亡的影響尼古丁可以劑量依賴性的促進HUVECs凋亡(表2、圖1)。

    2.4 尼古丁對JAK/STAT通路的影響尼古丁可顯著抑制p-JAK/t-JAK和p-STAT/t-STAT的水平(表3和圖2)。

    2.5 尼古丁對Bax、Bcl-2和Caspase-3 mRNA的影響尼古丁可顯著的提高Caspase-3和Bax mRNA的水平,抑制Bcl-2 mRNA的水平(表4)。

    表1 尼古丁細胞活力的影響

    表2 尼古丁對細胞凋亡的影響(%)

    圖1 干預后24 h流式細胞術檢測尼古丁對細胞凋亡的影響

    表3 尼古丁對JAK/STAT通路的影響

    圖2 干預后24h Western blot檢測尼古丁對細胞凋亡的影響

    表4 尼古丁對Bax、Bcl-2和Caspase-3 mRNA的影響

    3 討論

    心腦血管疾病是影響人類健康的重大疾病,調查顯示在全世界范圍內,每年死于心腦血管疾病的人數(shù)超過1500萬人。我國是心腦血管疾病大國,而吸煙是引起心腦血管疾病的主要誘因之一[5]。研究發(fā)現(xiàn)吸煙患者的冠心病的發(fā)病率顯著高于不吸煙者,吸煙不但會提高血液的黏度,還會引起內皮細胞損傷,引起血管內皮功能異常,引起高血壓、冠心病、腦梗死等的發(fā)病風險[6]。

    研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)尼古丁會直接影響肺功能并引起肺損傷[7]。尼古丁在進入集體后會經(jīng)由血液輸送,直接影響血管、心臟以及腦血管,作用于血管內皮細胞,直接影響血管內皮功能。為分析尼古丁對血管的影響,我們使用HUVECs作為研究對象,研究不同尼古丁濃度對細胞的影響。結果顯示在高濃度的尼古丁影響下,HUVECs形態(tài)發(fā)生變化,出現(xiàn)萎縮,并且細胞間排列不緊密。并且進一步的研究結果也顯示尼古丁可以劑量依賴性的抑制細胞HUVECs活力,促進HUVECs的凋亡。國內有研究顯示尼古丁會通過調節(jié)自噬影響血管內皮細胞功能[8]。吳雨徑等[9]研究也發(fā)現(xiàn)尼古丁可以抑制HUVECs增殖。國外也有研究顯示尼古丁可通過Akt通路誘導HUVECs凋亡[10]。這提示尼古丁會降低HUVECs的活力并誘導其凋亡。

    為進一步研究尼古丁影響HUVECs的機制,我們分析不同尼古丁濃度下培養(yǎng)24 h后JAK/STAT通路和凋亡蛋白的影響。JAK受到環(huán)境或其他刺激被激活后,使STAT的酪氨酸磷酸化,并且STAT會進入細胞核直接調節(jié)靶基因的表達[11]。JAK/STAT通路的激活會直接促進促凋亡蛋白Caspase-3和Bax的表達并抑制Bcl-2 的表達[12]。本次研究結果顯示尼古丁可顯著的抑制HUVECs的p-JAK/t-JAK和p-STAT/t-STAT的水平,并且尼古丁可顯著的提高Caspase-3和Bax mRNA的水平,抑制Bcl-2 mRNA的水平。國內有研究顯示HUVECs損傷與JAK/STAT通路的抑制有關,并且提高JAK/STAT的水平可減少HUVECs損傷[13]。國外也有研究顯示高糖會通過抑制JAK2/STAT3的水平引起HUVECs損傷[14]。Hu等[15]的研究也得到了相似的結果。這提示尼古丁可能通過抑制JAK/STAT通路磷酸化的水平促進Caspase-3和Bax并抑制Bcl-2的水平,誘導HUVECs凋亡。

    綜上所述,尼古丁可能通過下調JAK/STAT通路調節(jié)凋亡相關蛋白的表達,抑制HUVECs活力并促進其凋亡。這可能與吸煙引起心腦血管疾病有關,但是關于其具體的影響機制還需要進一步的研究。

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