高效液相色譜測定兒童體內(nèi)霉酚酸血藥濃度

許澤君，孫芳，景霞

嗎替麥考酚酯在1995 年被美國食品和藥品管理局批準(zhǔn)應(yīng)用于腎臟和心臟移植，并取得了良好的效果［1］。后來作為新型免疫抑制劑在臨床應(yīng)用廣泛［2］。由于它的腎毒性較小［3-5］，常用于兒童腎病綜合征等免疫缺陷疾病的治療。嗎替麥考酚酯進入體內(nèi)之后，迅速水解成霉酚酸，發(fā)揮免疫作用。在病兒服藥后，由于個體差異，在相同劑量下，霉酚酸的血藥濃度相差較大［4］，因此，需要定期監(jiān)測并及時調(diào)整服藥劑量，提高臨床療效。目前霉酚酸的血藥濃度測定方法主要包括免疫法、高效液相色譜法及液相-質(zhì)譜聯(lián)用法等［6-11］。其中高效液相色譜法較為經(jīng)濟、便捷，檢測結(jié)果不受代謝物的影響。本研究建立了高效液相色譜法測定兒童血漿中霉酚酸的濃度，并以此監(jiān)測腎病綜合征病兒的血藥濃度。雖然此法已有若干報道［12-15］，但這些報道均存在一些不足，有的方法使用緩沖鹽溶液作為流動相，可能對儀器或色譜柱造成損傷；有的方法未選擇內(nèi)標(biāo)或者內(nèi)標(biāo)存在著被其他藥物干擾的可能；還有部分方法的血樣處理過程相對復(fù)雜。本研究于2017 年11月至2018年4月建立的方法對這些問題加以改善，使高效液相色譜測定兒童血漿中霉酚酸的濃度更加簡潔、方便。

1 材料

1.1 藥品與試劑 霉酚酸標(biāo)準(zhǔn)品（純度大于98%，Lot.086M4010V，SIGMA）；萘啶酸標(biāo)準(zhǔn)品（純度99.0%，Lot107089，Dr.Ehrenstorfer）。甲醇、乙腈為色譜純；純化水由南京醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院自制。空白血漿由南京醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院提供。

1.2 儀器 Agilent 1260 Infinity 高效液相色譜儀（G1312B二元泵，G1316A柱溫箱，G4212B二極管陣列檢測器），十萬分之一分析天平（瑞士Mettler Toledo，MS205DU），Vortex-5 渦旋振蕩器（江蘇海門市其林貝爾儀器制造有限公司），abbott 離心機（德國hettich公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 檢測條件 色譜柱Agilent Eclipse Plus-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）。流動相為0.1%三乙胺溶液（用10%磷酸調(diào)節(jié)PH 為3.5±0.1）-乙腈＝60∶40；流速為1.0 mL/min；柱溫為25oC；檢測波長為215 nm，進樣量為40 μL。

2.2 溶液的配制 對照品溶液：精密稱取霉酚酸標(biāo)準(zhǔn)品12.5 mg，到25 mL 容量瓶加甲醇到刻度，然后超聲震蕩2 min。置于-30oC 冰箱內(nèi)保存。內(nèi)標(biāo)溶液：精密稱取萘啶酸標(biāo)準(zhǔn)品3.6 mg，到100 mL 容量瓶加甲醇到刻度，然后超聲震蕩2 min。置于-30oC冰箱內(nèi)保存。

2.3 樣品處理 精密吸取血漿樣品200 μL 置于1.5 mL 離心管中，加入20 μL 內(nèi)標(biāo)，加入甲醇400 μL，渦旋震蕩5 min 后，10 800 r/min 離心8 min，取全部上清液，加入5 μL 5%的磷酸水溶液，渦旋震蕩1 min 后，10 800 r/min 離心8 min。吸取上清進樣。

2.4 方法專屬性試驗 將空白血漿（不含內(nèi)標(biāo)），病兒服藥后的血漿（含內(nèi)標(biāo)）按“2.3”處理后，在“2.1”色譜條件下，進樣，得色譜圖（圖1）?？梢娧獫{內(nèi)源性物質(zhì)的保留時間在3 min 左右，內(nèi)標(biāo)萘啶酸的保留時間在8.1 min 左右，主峰霉酚酸的保留時間在12.8 min左右，無雜質(zhì)峰干擾，各個峰分離度及峰形良好，空白血樣在霉酚酸和萘啶酸色譜峰位置無吸收。

圖1 空白血漿（A）和病兒血漿（B）高效液相色譜圖

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線 取對照品溶液適量，用空白血漿等比稀釋，配制成濃度為0.20，0.39，0.78，1.56，3.13，6.25，12.50，25.00，50.00 μg/mL 的系列血漿樣品，按照“2.3”項下方法處理后進行測定。以對照品與內(nèi)標(biāo)的峰面積比（Y）和對照品濃度（X）作線性回歸，得回歸方程Y＝0.340 3X-0.003 6，r＝0.999 6。

2.6 方法回收率和精密度 配制0.39，25.00，50.00 μg/mL 高、中、低3種濃度的血漿樣品，每一濃度1 d內(nèi)按“2.3”項下方法平行操作5次；連續(xù)測定3 d。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，考察對照品的方法回收率及日內(nèi)、日間精密度（表1）。

表1 回收率及精密度（n＝5）

2.7 生物樣品的穩(wěn)定性 考察霉酚酸0.39，25.00，50.00 μg/mL高、中、低3 種濃度的血漿樣品在凍融1次，反復(fù)凍融3 次，室溫放置12 h，4oC 冰箱內(nèi)放置12 h，等不同溫度條件下的穩(wěn)定性。結(jié)果在各個條件下基本穩(wěn)定（表2）。

2.8 病兒樣本測定結(jié)果 根據(jù)已報道的有限采樣法［16］，測定南京醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院病兒體內(nèi)霉酚酸暴露量。本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會赫爾辛基宣言》相關(guān)要求，病兒近親屬對研究方案簽署知情同意書。病兒在服用嗎替麥考酚酯分散片（賽可平）2周達穩(wěn)態(tài)后，于清晨服藥前（0 h），服藥后0.5 h和2 h 3個時間點取靜脈血1～2 mL于EDTA抗凝管，立即送實驗室離心，取上清，按照上述的方法檢測濃度。按0～12 h 藥-時曲線下面積（AUC0～12h）＝7.75+6.49×C0+0.76×C0.5+2.43×C2計算。從2017年11月至2018 年4 月，6 個月內(nèi)共檢測177 例次。其中63 例12 h 內(nèi)霉酚酸暴露量小于30 mg·L-1·h-1，占35.6%，102例在30～60 mg·L-1·h-1，占57.6%，12例大于60 mg·L-1·h-1，占6.8%。

3 討論

3.1 試驗方法 本研究處理血樣時，采用了二倍體積的甲醇直接蛋白沉淀法，和其他常用的固相萃取法和液-液萃取法相比，該方法成本低，操作簡便，花費時間較短，靈敏度也能滿足臨床樣本測試的需求。然而，處理后發(fā)現(xiàn)上清有些許渾濁，對照品峰形較差，后優(yōu)化方法，經(jīng)磷酸酸化，離心后進樣，可得到較澄清的上清液和較好的峰形。在流動相方面，我們沒有使用緩沖鹽體系，這樣可以延長色譜柱壽命，簡化流動相配制。選擇萘啶酸作為內(nèi)標(biāo)的原因是它在當(dāng)前的流動相條件下出峰時間適宜，不受其他雜質(zhì)峰干擾。并且對兒童一般不會使用喹諾酮類藥物，不會造成干擾。

3.2 檢測結(jié)果 由于肝腸循環(huán)的存在，霉酚酸的谷濃度一般被認為不能很好地反映其在體內(nèi)的暴露水平。但在一個用藥間隔內(nèi)多點采血會給病人，特別是兒童病人造成很大痛苦。因此，有限采樣法［17］監(jiān)測霉酚酸暴露量的方法被較多地采用。由于兒童病人的特殊性，本研究想在一個用藥間隔內(nèi)多點采血以建立有限采樣法的估算公式較為困難，所以對住院病兒采用了上述三點采血法和相應(yīng)的估算公式，預(yù)估他們體內(nèi)的暴露藥量。霉酚酸暴露量在腎病綜合征中起最佳作用的范圍尚無定論，按其在移植病人中能起最佳的免疫抑制作用［18］的范圍30～60 mg·L-1·h-1來看，這些病兒有1/3 未能達標(biāo)，另有6%超過上限，可能增加了不良反應(yīng)發(fā)生的風(fēng)險。

表2 血漿中霉酚酸穩(wěn)定性分析（n＝5）

由于門診清晨時需要采血的病人眾多，門診病人如果采3個血樣，可能會造成采血時刻不準(zhǔn)確，進而影響預(yù)估值的準(zhǔn)確性。在統(tǒng)計已測樣本的谷濃度和預(yù)估的霉酚酸暴露量之后（表3），我們發(fā)現(xiàn)，當(dāng)谷濃度在＞1.0～3.5 μg/mL［19］之間時，病人霉酚酸暴露量是（42.1±11.4）mg·L-1·h-1，在靶范圍30～60 mg·L-1·h-1之間占比為84%（77/92）。因此，為方便在門診定期監(jiān)測血藥濃度的病人，可以選擇監(jiān)測谷濃度是否在＞1.0～3.5 μg/mL之間。如果谷濃度不在這個范圍內(nèi)，或者病人發(fā)生劑量調(diào)整時，我們會建議該病兒按有限采樣法，估算更精確的霉酚酸暴露量。

表3 177例次樣本谷濃度和預(yù)估的霉酚酸暴露量的統(tǒng)計分析

3.3 試驗總結(jié) 本試驗建立了霉酚酸血藥濃度高效液相色譜測定方法。在本色譜條件下，霉酚酸的理論塔板數(shù)大于8 000，整個檢測在15 min 左右完成，相關(guān)物質(zhì)保留時間適當(dāng)。該方法線性關(guān)系良好，重現(xiàn)性高，可用于醫(yī)院病兒霉酚酸血藥濃度的檢測，為臨床提供可靠的參考，保障合理和安全用藥。但由于項目開展時間較短，經(jīng)驗不足和兒童群體的特殊性，還需進一步改進病兒霉酚酸暴露量的估算方法，并結(jié)合臨床，探索霉酚酸暴露量在不同病種時更合理的范圍。