雙酚A對河蜆呼吸代謝和抗氧化酶的毒性研究

張悅君，曾麗璇，康 園，張秋云

(華南師范大學化學與環(huán)境學院;教育部環(huán)境理論化學重點實驗室，廣州510006)

作為一種重要的有機化工原料，雙酚A(bisphenol A，BPA)被廣泛應用于塑料增塑劑、聚碳酸酯、環(huán)氧樹脂、抗氧化劑、農(nóng)藥、化妝品等生產(chǎn)中．日常生活中的塑料容器、食品包裝材料、容器內壁涂料上均可降解出BPA［1-2］．近年來針對BPA開展了廣泛的研究，均采用魚類、水蚤和海洋貝類作為指示生物進行研究［3-4］，關于BPA對雙殼貝類的毒性研究相對較少．河蜆(Corbicula fluminea)是一種主要棲息于淡水及咸淡水中的常見雙殼類，為河流中重要底棲動物．作為江河水庫等淡水生態(tài)系統(tǒng)的優(yōu)勢種，影響著當?shù)厮鷳B(tài)系統(tǒng)的物質循環(huán)［5］．由于河蜆具有分布廣泛、個體較大、生活史較長、遷移性小、不主動攝取食物、容易采集等特點，同時作為一種濾食性的動物，以水中的浮游生物(如硅藻、綠藻、原生動物、輪蟲等)為食料［6］，在食物鏈中具有重要作用，對毒物有很高的濃縮系數(shù)，能直接反映水體的污染狀況，因此河蜆被認為是水生生態(tài)毒理學上目標污染物低劑量長期作用下的毒性效應的指示生物［7］．國內BPA對河蜆的生態(tài)毒理研究尚處于起步階段．

由于環(huán)境水體中BPA含量較低，而低濃度污染物對生物的危害在短期內難以察覺［8］，動物耗氧率(Oxygen Consumption Rate，OCR)和排氨率(Ammonia Excretory Rate，AER)的變化可作為反映某些污染物毒性大小的敏感指標［9］．同時超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)、過氧化氫酶(Catalase，CAT)等抗氧化酶是生物體內保護系統(tǒng)的主要酶，其活性可作為生物逆境生理和衰老生理指標［10］．本文采用靜態(tài)染毒法，研究BPA急性暴露及亞急性暴露對河蜆呼吸代謝及抗氧化酶活性的影響，探討B(tài)PA對河蜆的毒性效應，為防治BPA污染提供依據(jù)．

1 材料與方法

1．1 儀器與試劑

BSA1245S-CW電子分析天平(賽多利斯科學儀器(北京)有限公司);UV-3100PC紫外可見分光光度計(上海美譜達儀器有限公司);玻璃勻漿器．

雙酚A(分析純);乙醇(分析純)．

1．2 試驗動物

試驗所用河蜆來自珠江三角洲河網(wǎng)中水質較好的增江．選取殼長(25．0 ±2．0)mm，殼高(19．40 ±0．20)mm，體質量為(4．00 ±0．40)g 的健康河蜆用于試驗．用經(jīng)過3天自然脫氯和已充分曝氣的自來水將河蜆在試驗室暫養(yǎng)1周，暫養(yǎng)期間水溫為(20±1)℃，自然光照．

1．3 試驗方法

1．3．1 急性毒性試驗 急性毒性采用半靜態(tài)換水式試驗，每24 h更換1次試驗液，換水后加入BPA至初始質量濃度．試驗容器為定制的容積為1 L的玻璃水族箱，每升水中放10只河蜆，試驗期間不喂食，試驗條件控制在水溫(20±1)℃，pH值7．5～8．0，溶解氧7～8 mg/L．預試驗設置3個間隔較大的質量濃度梯度，每組設3個平行，求出48 h的100%死亡、無死亡和大致半致死質量濃度．正式試驗按照預試驗所得結果以等對數(shù)間距設置5個試驗質量濃度組(5、7、10、14、20 mg/L)和 1 個空白對照組、1個溶劑對照組(體積分數(shù)0．1%的乙醇，下同)，每組設3個平行試驗．試驗期間連續(xù)觀察受試對象的活動情況，及時清除死亡的河蜆和代謝物，每隔24 h記錄河蜆的死亡情況．個體死亡的判斷標準:河蜆外膜收縮、刺激時腹足不能收縮、雙殼張開，多次用鑷子適度敲擊殼體并夾緊雙殼而沒有自動閉殼反應．暴露96 h后計算其半致死濃度(median lethal concentration，LC50)．然后按下式計算安全濃度(SC):SC=96 h LC50×0．01．

1．3．2 亞急性毒性試驗 亞急性毒性試驗的質量濃度設置參考了急性毒性試驗所得的數(shù)據(jù)結果，以96 h-LC50的1/10、1/8、1/4和 1/2設置4個質量濃度組，另設1個溶劑對照組(0．1%乙醇)，每組設3個平行，對河蜆進行亞急性染毒試驗，試驗采用半靜態(tài)換水，暴露期間的實驗方法與96 h-LC50急性毒性試驗相同，每天觀察記錄河蜆的死亡情況，及時清除死亡的河蜆和代謝物．

1．3．3 耗氧率和排氨率的測定 采用劉其根［11］等的方法進行測定．根據(jù)試驗前后代謝瓶內水中的溶解氧及氨氮含量，按下列公式計算河蜆的耗氧率和排氨率:

式中:OR為單位體質量耗氧率(mg·g-1·h-1);DO0和DOt為試驗開始、在t時間結束時水中DO的含量(mg/L);V為代謝瓶中水的體積(L);W為河蜆質量(g);t為試驗持續(xù)時間(h)．

式中:NR為單位河蜆個體質量排氨率(mg·g-1·h-1);N0和Nt為試驗開始、在t時間結束時水中NH3-N的質量濃度(mg/L);V為代謝瓶中水的體積(L);W為河蜆質量(g);t為試驗持續(xù)時間(h)．

1．3．4 酶活性的測定 亞急性毒性試驗結束后，從各組中各取出數(shù)只河蜆盡快剖開，用濾紙對其吸干水分后，稱取軟體組織0．50 g用6．7×10-3mol/L磷酸鹽緩沖溶液(pH 7．0)3．0 mL進行勻漿，勻漿液倒入離心管中，加3 mL磷酸鹽緩沖溶液沖洗勻漿器后，也倒入離心管中，在4 000 r/min離心30 min，取上清液為粗酶液．

(1)SOD活性測定 采用鄒國林［12］改進的鄰苯三酚自氧化法，波長λ=325 nm．SOD酶活性單位定義為:每毫升反應液中，每分鐘抑制鄰苯三酚自氧化速率達50%的酶量定義為一個酶活性單位．

(2)CAT活性測定 采用徐鏡波等［13］的紫外分光光度法進行測定，波長λ=240 nm．CAT酶活性定義為:一個過氧化酶單位相當于在規(guī)定條件下，于25℃、pH 7．0，每分鐘分解1μmol過氧化氫所需的酶量．

(3)總蛋白含量的測定 采用Bradford法［14］，即考馬斯亮藍法．10．00 mL Bradford染色液加入0．30 mL待測蛋白，混勻后在595 nm處檢測吸光度．以牛血清白蛋白(BSA)為標準蛋白做出的標準曲線計算各樣本蛋白含量．

1．4 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)使用SPSS 16．0軟件進行統(tǒng)計分析，用PROBIT模型計算LC50及其95%置信區(qū)間(95%C．I．);文中描述性統(tǒng)計值以3次平均數(shù)±標準偏差(mean±SD)表示，組間數(shù)據(jù)采用T檢驗法進行分析，得出顯著性差異的相關信息，P＜0．05認為存在顯著性差異，P＜0．01認為存在極顯著差異．

2 結果與討論

2．1 BPA對河蜆的急性毒性分析

急性毒性試驗結束后，空白對照組以及BPA溶劑對照組均無死亡．觀察發(fā)現(xiàn)，試驗期間未死亡個體的活動能力下降，用鑷子適度敲擊河蜆殼體時，其閉殼速度緩慢，用玻璃棒刺激河蜆的腹足時，其收縮速度緩慢，其外套膜邊緣有黏性絮狀物包被．

在同一試驗質量濃度組中，隨著暴露時間的延長河蜆死亡率均呈現(xiàn)出逐漸增加的趨勢(表1)．表示化學物質對生物的生態(tài)毒理學危害性可根據(jù)其LC50分為4個等級［15］:≤1 mg/L為極高;1～10 mg/L為高毒;10～100 mg/L為中毒;＞100 mg/L為低毒．參照分級標準，BPA對河蜆的毒性為高毒．

表1 BPA對河蜆的急性LC50值Table 1 LC50 value of Asian clam for BPA

目前，已有許多學者關注BPA對水生生物的半致死濃度．

比較表1和表2可以看出，河蜆對BPA的耐受性遠高于鯉魚，與泥鰍、水螅、斑馬魚和雌性日本青鳉較為接近，由此得出不同水生生物對BPA的耐受性差異較大，可能與不同水生生物的呼吸渠道以及代謝解毒能力的差異相關，其中泥鰍除腮之外還可用皮膚呼吸，而魚鰓是污染物發(fā)揮毒性作用的靶器官之一，因此，與鯉魚、斑馬魚相比泥鰍對BPA的耐受性更強［18］;而河蜆作為雙殼貝類生物，具有堅硬的外殼保護，能有效減少身體與污染物的接觸，從而降低污染物的毒性損害［21］，但同時河蜆作為活動力差的貝類品種，因無回避能力，暴污程度較大，故其對BPA的耐受性介于不同水生生物之間．

表2 BPA對水生生物的急性LC50值Table 2 LC50 value of aquatic organisms for BPA

2．2 BPA對河蜆的亞急性毒性分析

根據(jù)急性毒性試驗結果(表1)BPA對河蜆的96 h-LC50為6．34 mg/L，以 BPA 對河蜆的 96 h-LC50的1/10、1/8、1/4和1/2設置4個質量濃度組，即0．63、0．79、1．59、3．17 mg/L．7 d 的亞急性毒性試驗結束后，對照組均無死亡，其他濃度組死亡率均低于5%．

2．2．1 BPA對河蜆呼吸代謝的影響 在BPA暴露下，河蜆耗氧率和排氨率隨著暴露質量濃度的升高(表3)，耗氧率和排氨率先降低后升高再降低，各暴露質量濃度組中的耗氧率和排氨率均低于溶劑對照組．在低質量濃度暴露下(0～0．79 mg/L)，河蜆耗氧率和排氨率表現(xiàn)為受到抑制，其中在0．63 mg/L時耗氧率和排氨率均受到顯著抑制(P＜0．05)，而在0．79 mg/L時，耗氧率和排氨率均受到極顯著抑制(P＜0．01);隨著BPA暴露質量濃度的升高(0．79～1．59 mg/L)，河蜆耗氧率和排氨率呈升高趨勢，但仍顯著低于溶劑對照組(P＜0．05);而隨著暴露質量濃度的繼續(xù)升高(1．59～3．17 mg/L)，耗氧率和排氨率再次降低表現(xiàn)為受到極顯著抑制(P＜0．01)．

表3 BPA對河蜆呼吸代謝和抗氧化酶活性的影響Table 3 Effect of BPA on respiratorymetabolism and antioxidant enzymes of Asian clam

2．2．2 BPA對河蜆抗氧化酶活性的影響 在BPA暴露下，河蜆軟體組織SOD和CAT活性隨著暴露質量濃度的升高也有顯著的變化(表3)，總體趨勢為隨著BPA質量濃度的升高SOD和CAT活性先降低后升高再降低，其中各質量濃度組中CAT活性均低于溶劑對照組．在低質量濃度暴露下(0～0．79 mg/L)，河蜆 SOD和 CAT活性受到一定抑制，在0．63 mg/L時SOD和CAT活性均受到輕微抑制，在0．79 mg/L時，SOD和CAT活性均受到極顯著抑制(P＜0．01);隨著BPA暴露質量濃度的升高，河蜆SOD和CAT活性呈升高趨勢，其中在1．59 mg/L時，SOD的活性受到顯著誘導(P＜0．05)，而 CAT仍極顯著低于溶劑對照組(P＜0．01);隨著暴露質量濃度的繼續(xù)升高(1．59 ～3．17 mg/L)，SOD 和CAT活性再次降低表現(xiàn)為受到極顯著抑制(P＜0．01)．

在BPA較低暴露質量濃度下，河蜆的耗氧率和排氨率、SOD和CAT活性有所降低，其中在0．63 mg/L時均無極顯著性的變化，直至0．79 mg/L時其耗氧率和排氨率以及2種酶活性才受到極顯著性的抑制，隨著質量濃度的繼續(xù)升高，河蜆耗氧率和排氨率、2種酶活性相對均有所升高，而在濃度極高時其耗氧率和排氨率以及2種酶活性才又受到極顯著性的抑制，表明此時BPA對河蜆抗氧化酶系統(tǒng)和呼吸代謝能力產(chǎn)生了一定的毒性效應．

3 結論

BPA對河蜆的96 h-LC50為6．34 mg/L;在試驗質量濃度范圍內，河蜆耗氧率和排氨率、SOD、CAT活性隨暴露質量濃度升高均呈現(xiàn)先下降后上升再下降的趨勢，表明BPA可對河蜆產(chǎn)生明顯的氧化脅迫和毒性效應．

總體而言，在本試驗中，河蜆耗氧率和排氨率以及2種酶活性指標對BPA較敏感，且均呈現(xiàn)出較好的一致性和規(guī)律性，至于這些呼吸代謝以及抗氧化酶內在的變化機理，這將是下一步在分子水平上的研究重點．

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