大鼠中心靜脈導(dǎo)管相關(guān)性血栓模型的建立方法▲

甘 曉 應(yīng)燕萍 韋 艷 趙慧函 蔣慶娟 文 萃

(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院護(hù)理部,南寧市 530021,電子郵箱：ganxiao0722@126.com)

中心靜脈血管通路裝置(central venous access device,CVAD)也稱中心靜脈導(dǎo)管,是一種經(jīng)皮置入體內(nèi)且末端位于上腔或下腔靜脈的裝置,主要用于化療、輸入血液制品、胃腸外營養(yǎng)及其他療法，或者血流動(dòng)力學(xué)監(jiān)測[1-2]。CVAD的優(yōu)越性使得其在臨床上得到廣泛應(yīng)用，在美國，每年有超過500萬個(gè)CVAD被用于臨床[3]。但CVAD可引起許多導(dǎo)管相關(guān)并發(fā)癥，其中導(dǎo)管相關(guān)性血栓(catheter-related thrombosis,CRT)是最常見且最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一。有研究顯示CRT發(fā)生率為13.8%，其中近90%的CRT為無癥狀血栓[4]。目前有關(guān)CRT的臨床研究很多，但相關(guān)的基礎(chǔ)研究較少，CRT的發(fā)生機(jī)制尚不明確。本研究通過經(jīng)頸外靜脈留置CVAD的方法建立大鼠CRT模型，為CRT的基礎(chǔ)研究提供模型參考，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：無特定病原體級(jí)SD大鼠58只，雄性，體重170～220 g，購自廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK桂2014-0002。大鼠飼養(yǎng)于室溫為(24±2) ℃，相對(duì)濕度為40%～60%的無特定病原體級(jí)實(shí)驗(yàn)室中，自由飲水、攝食。

1.1.2 主要試劑與儀器：水合氯醛(天津市大茂化學(xué)試劑廠，批號(hào)：20180514)，10%中性福爾馬林固定液(廣州維格斯生物科技有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：18101201)，頸靜脈導(dǎo)管及接頭(思科諾生物科技北京有限公司，1#)，切片機(jī)(德國Leica公司，型號(hào)：RM2245)，正置熒光顯微鏡(日本Olympus公司，型號(hào)BX53 )

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組：將58只雄性SD大鼠隨機(jī)(計(jì)算機(jī)法)分為對(duì)照組(n=3)、假手術(shù)組(n=15)和模型組(n=40)。將假手術(shù)組和模型組再隨機(jī)(計(jì)算機(jī)法)平均分為建模后1、4、7、10、14 d組。

1.2.2 CRT模型的建立：參考Terry等[5]提出的手術(shù)方法進(jìn)行置管。模型組采用10%水合氯醛經(jīng)腹腔注射進(jìn)行麻醉，右側(cè)頸部備皮，常規(guī)消毒、鋪巾，沿氣管右側(cè)0.5 cm縱切頸部1.5 cm，鈍性游離右頸外靜脈長約1 cm。用3-0絲線結(jié)扎游離靜脈的遠(yuǎn)心端，于結(jié)扎點(diǎn)下將靜脈剪一切口，從靜脈切口將導(dǎo)管往上腔靜脈方向插入2.5 cm，回抽見回血后經(jīng)導(dǎo)管輸入1 mL生理鹽水封管，3-0絲線分別固定導(dǎo)管突起部上、下端，防止導(dǎo)管脫出或深入血管，見圖1。將導(dǎo)管頭端埋于頸部皮下組織，縫合皮膚，結(jié)束手術(shù)。假手術(shù)組按模型組麻醉大鼠后切開頸部，鈍性分離暴露右頸外靜脈后立即縫合頸部皮膚。對(duì)照組不做任何處理，正常飼養(yǎng)。

1.2.3 CRT的評(píng)估：假手術(shù)組及模型組在建模后相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行解剖取材，對(duì)照組在同期飼養(yǎng)的最后一天解剖取材，各組均取同側(cè)靜脈組織。大鼠腹腔注射10%水合氯醛進(jìn)行麻醉，解剖頸部取右頸外靜脈至上腔靜脈的組織(模型組需拔出靜脈導(dǎo)管后取材)，置于10%中性福爾馬林中固定48 h，脫水經(jīng)石蠟包埋、切片，行蘇木精-伊紅染色法染色，在顯微鏡下觀察置管靜脈的形態(tài)學(xué)變化。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料以例數(shù)(百分比)表示。

2 結(jié) 果

2.1 一般情況 58只SD大鼠中，模型組有1只大鼠因建模時(shí)麻醉過量死亡(建模7 d組)，其余57只大鼠均存活。大鼠置管成功率100.0%(39/39)，導(dǎo)管留置期間無導(dǎo)管脫出。

2.2 CRT形成情況 對(duì)照組和假手術(shù)組在實(shí)驗(yàn)期間均未見血栓形成；模型組32只大鼠發(fā)生CRT，CRT發(fā)生率為82.1%(32/39)，其中建模后1 d組、建模后4 d組和建模后7 d組分別有6只、5只、5只大鼠發(fā)生血栓，血栓發(fā)生率為75.0%(6/8)、62.5%(5/8)和71.4%(5/7)，建模后10 d和14 d組大鼠均發(fā)生血栓，血栓發(fā)生率為100.0%(8/8)。

2.3 各組大鼠右頸外靜脈組織病理學(xué)結(jié)果 顯微鏡下可見對(duì)照組和假手術(shù)組右頸外靜脈內(nèi)皮結(jié)構(gòu)光滑、完整，管腔無血栓形成(圖 2A、圖 2B)。顯微鏡下可見模型組右頸外靜脈有CRT形成(圖2C)；建模后1 d、4 d和7 d時(shí)主要為混合血栓，血管腔有淡粉色無結(jié)構(gòu)血小板小梁，小梁間充滿紅細(xì)胞、白細(xì)胞；建模后10 d和14 d時(shí)主要為血栓機(jī)化血管內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞及炎癥細(xì)胞形成肉芽組織并開始長入血栓內(nèi)。

圖1 右頸外靜脈置入導(dǎo)管過程

注：A為頸部消毒鋪巾；B為暴露右頸外靜脈；C為右頸外靜脈下方穿過兩條3-0絲線；D為導(dǎo)管插入右頸外靜脈；E為導(dǎo)管固定結(jié)束。

圖2 各組大鼠頸外靜脈組織病理學(xué)變化(蘇木精-伊紅染色，20)

注：A為對(duì)照組；B為假手術(shù)組；C模型組(為血栓；▲為肉芽)。

3 討 論

CRT是指由于穿刺或?qū)Ч苤苯訐p傷血管內(nèi)膜，以及患者自身狀態(tài)等多因素作用，使導(dǎo)管所在的血管內(nèi)壁及導(dǎo)管附壁形成血凝塊，導(dǎo)致導(dǎo)管部分或完全堵塞，伴或不伴臨床癥狀[6-7]。臨床上CRT患者大多數(shù)無癥狀，在因置管發(fā)生血栓的患者中，超過90%的患者通過超聲檢查才發(fā)現(xiàn)有血栓形成[8]。CRT的主要癥狀有手臂發(fā)紅、腫脹或疼痛，頸、臂、胸可見靜脈擴(kuò)張等[9]。CRT可引起肺栓塞、再發(fā)性深靜脈血栓、血栓后綜合征等并發(fā)癥，其中肺栓塞和深靜脈血栓統(tǒng)稱為靜脈血栓栓塞，靜脈血栓栓塞的高發(fā)生率和病死率使其成為全球疾病的主要負(fù)擔(dān)[10]。CRT不僅會(huì)導(dǎo)致患者治療的中斷，增加患者住院時(shí)間和醫(yī)療費(fèi)用，還會(huì)影響患者預(yù)后，增加病死率，加重社會(huì)醫(yī)療負(fù)擔(dān)[11]。早期診斷及有效預(yù)防CRT對(duì)改善患者的療效及預(yù)后有積極的意義。

CRT的發(fā)生涉及多因素和多系統(tǒng)，傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為，血管內(nèi)皮損傷、血流速度減慢、血液高凝狀態(tài)的共同作用促使血栓的形成。本研究通過手術(shù)暴露大鼠右側(cè)頸外靜脈，從靜脈置入導(dǎo)管并留置于血管內(nèi)制作CRT大鼠模型。導(dǎo)管置入后內(nèi)皮細(xì)胞受損，內(nèi)皮下膠原暴露引起血小板黏附聚集，激活凝血因子Ⅻ，損傷的內(nèi)皮釋放組織因子，激活凝血因子Ⅶ，啟動(dòng)了內(nèi)、外源性凝血過程[12]。靜脈管腔內(nèi)導(dǎo)管的置入使血液流通空間變窄，血流速度減慢，當(dāng)血流緩慢或有旋渦時(shí)血小板進(jìn)入邊流，極大增加了與內(nèi)膜接觸的機(jī)會(huì)以及黏附內(nèi)膜的可能性，有利于血栓的形成。本研究結(jié)果顯示，建模后7 d時(shí)血栓發(fā)生率為71.4%，建模后10 d、14 d血栓發(fā)生率均為100%，提示該建模方法CRT成功率高，且導(dǎo)管留置10 d以后CRT的發(fā)生率最高，筆者認(rèn)為血栓的形成可能與導(dǎo)管留置的時(shí)間有關(guān)。本研究中，大鼠置管1 d即可發(fā)現(xiàn)有血栓形成，置管1周內(nèi)，置管的靜脈腔內(nèi)形成許多血小板梁，其間纖維蛋白網(wǎng)羅大量紅細(xì)胞及部分白細(xì)胞，從而形成血小板梁與紅細(xì)胞交替的混合血栓；建模后10 d和14 d時(shí)，肉芽組織開始深入血栓組織，逐漸代替血栓，血栓開始機(jī)化。血栓形成后會(huì)發(fā)生機(jī)化、鈣化等現(xiàn)象，但本研究未在顯微鏡下觀察到血栓鈣化，可能與導(dǎo)管留置時(shí)間較短有關(guān)。

有關(guān)CRT動(dòng)物模型建立的研究報(bào)告多以兔子為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，如鄧婷[13]通過兔頸外靜脈留置靜脈留置針的方法構(gòu)建CRT模型，觀察不同留置時(shí)間CRT的發(fā)生情況及置管周圍組織的病理變化，在顯微鏡下觀察到靜脈腔內(nèi)有不同程度的血栓。艾熙等[14]于家兔右頸外靜脈插入CVAD建立CRT模型，在置管第7天15只家兔全部發(fā)生CRT。但兔子體積較大，需單籠飼養(yǎng)，經(jīng)濟(jì)消耗大。本研究采用大鼠作為模型具有動(dòng)物體積小、可操作性高、可重復(fù)性強(qiáng)，價(jià)格低廉、適合開展大樣本量研究的優(yōu)點(diǎn)。大鼠的頸外靜脈較家兔細(xì)，靜脈被刺激后會(huì)收縮甚至痙攣，導(dǎo)致頸外靜脈置入CVAD難度較大。但本研究中大鼠CVAD的置管成功率為100%(39/39)，提示用大鼠建立CRT模型可行性高。然而本研究尚未通過導(dǎo)管對(duì)大鼠進(jìn)行輸液治療，未能說明藥物對(duì)CRT的形成是否有促進(jìn)作用，今后將深入研究。

綜上所述，經(jīng)右頸外靜脈留置CVAD可以成功建立大鼠CRT模型，且該模型形成的血栓穩(wěn)定，血栓病理符合人體血栓的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，可為今后深入研究CRT及導(dǎo)管相關(guān)疾病提供模型參考。