突發(fā)性耳聾患者血清T淋巴細(xì)胞亞群和Th1/Th2相關(guān)細(xì)胞因子水平及其臨床意義▲

臧 雯 周鯤鵬 張學(xué)梅

(河北省石家莊市第一醫(yī)院耳鼻咽喉科，石家莊市 050011，電子郵箱：zangwen3317@163.com)

突發(fā)性耳聾是臨床耳科常見的急癥疾病之一，表現(xiàn)為不明原因下突然出現(xiàn)的感音神經(jīng)性聽力下降，治療不及時(shí)易造成永久性聽力喪失，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量[1]。突發(fā)性耳聾常伴發(fā)耳鳴、眩暈等癥狀，多為單側(cè)發(fā)病，雙側(cè)發(fā)病較為少見，高發(fā)于40歲左右人群，無性別差異，兒童較少見[2]。有研究表明，突發(fā)性耳聾的發(fā)生與病毒感染、機(jī)體免疫功能相關(guān)，而Th細(xì)胞在免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，其中Th1/Th2及其分泌的細(xì)胞因子能減少或清除機(jī)體病原菌，維持機(jī)體處于免疫動態(tài)平衡狀態(tài)，此平衡一旦遭到破壞可導(dǎo)致機(jī)體發(fā)生一系列病理變化[3-4]。但目前關(guān)于突發(fā)性耳聾患者Th1/Th2細(xì)胞因子平衡狀態(tài)的研究較少。因此，本研究探討突發(fā)性耳聾患者T淋巴細(xì)胞亞群和Th1/Th2相關(guān)細(xì)胞因子水平及其臨床意義，為突發(fā)性耳聾的診斷和治療提供新思路。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2017年8月至2019年1月我院收治的60例突發(fā)性耳聾患者作為研究對象(研究組)。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合突發(fā)性耳聾的診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]；(2)首次發(fā)病。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)先天性聽力低下者；(2)有耳膜手術(shù)史者；(3)近3個(gè)月內(nèi)有免疫增強(qiáng)劑或抑制劑使用史者；(4)近3個(gè)月內(nèi)有激素使用史者；(5)合并自身免疫缺陷性疾病者；(6)合并嚴(yán)重肝、腎等功能代謝障礙者；(7)惡性腫瘤患者；(8)妊娠或哺乳期女性。研究組中男性27例、女性33例，年齡25～58(44.16±4.30)歲，病程2～45(13.37±2.86) d；聽力下降程度：中度耳聾17例，重度耳聾23例，極重度耳聾20例。另選取同期行體檢的健康者60例作為對照組，排除標(biāo)準(zhǔn)同研究組，其中男性29例、女性31例，年齡27～60(45.52±4.24)歲。研究組和對照組的性別、年齡比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)，有可比性。中度耳聾患者中男性9例、女性8例，年齡27～55(44.71±3.65)歲，病程3～43(12.92±2.61) d；重度耳聾患者中男性10例、女性13例，年齡25～58(44.38±4.68)歲，病程2～42(13.75±3.12) d；極重度耳聾患者中男性8例、女性12例，年齡25～57(43.82±3.82)歲，病程7～45(13.24±2.31) d。中度、重度、極重度耳聾患者的性別、年齡、病程比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)，有可比性。本研究經(jīng)石家莊市第一醫(yī)院倫理委員會審查批準(zhǔn)，所有研究對象對本研究知情并簽署知情同意書。

1.2 樣本采集 觀察組患者于入院后，對照組研究對象于體檢當(dāng)日，采集空腹靜脈血3 mL，置于離心管中，室溫靜止25 min，于4℃下2 800 r/min離心10 min，取上清，-80℃凍存用于待檢細(xì)胞因子；另取2 mL血漿于抗凝管中，用于檢測T淋巴細(xì)胞亞群。

1.3 檢測方法

1.3.1 T淋巴細(xì)胞亞群檢測：采用流式細(xì)胞術(shù)檢測T細(xì)胞亞群。CD3、CD4、CD8抗體購自瑞士羅氏公司(批號：CCM030)，流式細(xì)胞儀為美國BeckmanCoulter公司(CytoFLEX S型)。取待測血漿100 μL，加入藻紅蛋白-花青苷5/異硫氰酸熒光素/藻紅蛋白三色標(biāo)記單克隆抗體20 μL，37℃ 避光孵育15 min，加紅細(xì)胞溶解液(美國Beckman Coulter公司，批號：A09777)1 mL溶解10 min，4 ℃下以2 000 r/min離心5 min，棄上清，磷酸鹽緩沖液洗3次，5 min/次，樣品上流式細(xì)胞儀直接檢測。

1.3.2 Th1/Th2相關(guān)細(xì)胞因子的檢測：采用酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)檢測血清中白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-2、IL-4、IL-10、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)水平，ELISA試劑盒購自美國R&D Systems公司(批號：180616、180319、180223、180311)。(1)加樣。設(shè)置待檢樣品孔、標(biāo)準(zhǔn)品孔及空白孔，用磷酸鹽緩沖液將標(biāo)準(zhǔn)品稀釋為1.25、2.5、5、10、20、40 pg/mL濃度，分別取50 μL加入標(biāo)準(zhǔn)孔，在樣品孔直接加入50 μL待測樣品，于振蕩器上混勻，室溫孵育60 min。(2)洗板。棄液，磷酸鹽緩沖液重復(fù)清洗3～4次，30 s/次，吸水紙上拍干。(3)加一抗。各孔加一抗即用工作液，分別為生物素標(biāo)記的抗IL-2、IL-4、IL-10、TNF-α抗體(空白孔不加)，于振蕩器上混勻，37℃孵育30 min；棄液，磷酸鹽緩沖液重復(fù)清洗3～4次，30 s/次，吸水紙上拍干。(4)加二抗。每孔加50 μL酶標(biāo)二抗工作液(辣根過氧化物酶標(biāo)記的親和鏈霉素)，于振蕩器上混勻，37℃孵育15 min；棄液，磷酸鹽緩沖液重復(fù)清洗3～4次，30 s/次，吸水紙上拍干。(5)加底物。每孔加底物工作液3,3′,5,5′-四甲基聯(lián)苯胺100 μL，37℃避光孵育10 min。(6)終止反應(yīng)。各孔加終止液50 μL終止反應(yīng)，采用酶標(biāo)儀檢測(賽默飛公司，型號：Multiskan FC型)，在450 nm處檢測吸光度，計(jì)算IL-2、IL-4、IL-10、TNF-α濃度。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料用(x±s)表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，兩組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用例數(shù)或百分比表示，比較采用χ2檢驗(yàn)；采用Pearson檢驗(yàn)進(jìn)行相關(guān)性分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩組外周血T淋巴細(xì)胞亞群水平比較 研究組CD3+、CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞水平低于對照組(均P<0.05)，但兩組CD4+/CD8+比值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

表1 兩組外周血T淋巴細(xì)胞亞群水平比較(x±s)

2.2 兩組血清Th1/Th2相關(guān)細(xì)胞因子水平比較 研究組血清IL-4、IL-10水平低于對照組，IL-2水平高于對照組(均P<0.05)，但兩組TNF-α水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)，見表2。

表2 兩組受試者血清IL-2、IL-4、IL-10、TNF-α水平比較(x±s，pg/mL)

2.3 兩組血清Th1/Th2相關(guān)細(xì)胞因子平衡狀態(tài)比較 研究組IL-2/IL-4、TNF-α/IL-4比值高于對照組(均P<0.05)，但兩組IL-2/IL-10、TNF-α/IL-10比值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)，見表3。

表3 兩組受試者血清Th1/Th2細(xì)胞因子平衡狀態(tài)(x±s)

2.4 突發(fā)性耳聾患者血清Th1/Th2相關(guān)細(xì)胞因子之間的相關(guān)性 突發(fā)性耳聾患者血清IL-2、TNF-α水平與IL-4無明顯相關(guān)性(均P>0.05)，與IL-10呈負(fù)相關(guān)性(均P<0.05)，見表4。

表4 突發(fā)性耳聾血清IL-2、TNF-α與IL-4、IL-10相關(guān)性

2.5 突發(fā)性耳聾患者血清Th1/Th2相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)與聽力下降程度的關(guān)系 中度耳聾、重度耳聾、極重度耳聾患者IL-4、IL-10、TNF-α水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。其中，極重度耳聾患者血清IL-4水平低于重度耳聾患者，IL-10低于中度耳聾患者，TNF-α水平高于中度及重度耳聾患者(均P<0.05)。見表5。

表5 不同程度突發(fā)性耳聾患者血清Th1/Th2相關(guān)細(xì)胞因子水平及比值比較(x±s)

組別nIL-2/IL-4比值IL-2/IL-10比值TNF-α/IL-4比值TNF-α/IL-10比值中度耳聾171.64±0.321.18±0.264.81±0.653.45±0.74重度耳聾231.69±0.351.23±0.315.09±0.853.78±0.72極重度耳聾201.67±0.291.13±0.285.26±0.743.95±0.65 F值0.1180.6521.6212.373P值0.8890.5250.2070.102

注：與中度耳聾比較，*P<0.05；與重度耳聾比較，#P<0.05。

3 討 論

突發(fā)性耳聾可使患者的聽力在短時(shí)間內(nèi)降到最低點(diǎn)，因發(fā)病部位在內(nèi)耳，不可活檢，大多患者病因不明確。突發(fā)性耳聾患者除顱內(nèi)聽神經(jīng)外，無其他顱神經(jīng)損害癥狀，主要根據(jù)其內(nèi)耳功能障礙病理機(jī)制進(jìn)行治療，包括使用類固醇激素、抗氧化劑、抗凝劑等藥物以及高壓氧治療等，但治療效果個(gè)體差異較大，且療效與病程長短密切相關(guān)[6]。因此，尋找早期診斷手段及治療新方法對改善突發(fā)性耳聾預(yù)后極其重要。

過去內(nèi)耳被認(rèn)為是“免疫豁免”器官，但近年來已有研究表明內(nèi)耳并非“免疫豁免”器官，內(nèi)淋巴囊為其免疫應(yīng)答中心，內(nèi)耳受到病原刺激時(shí)，可明顯增加內(nèi)淋巴囊外免疫活性細(xì)胞數(shù)量，能與機(jī)體巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞及其亞群相互作用參與內(nèi)耳免疫應(yīng)答，而突發(fā)性耳聾的發(fā)生與免疫介導(dǎo)異常密切相關(guān)[7]。本研究結(jié)果顯示，研究組CD3+、CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞水平低于對照組(P<0.05)，但兩組CD4+/CD8+比值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，與Lee等[8]的研究結(jié)果相似，提示細(xì)胞免疫參與突發(fā)性耳聾的發(fā)病。

Th1/Th2屬于CD4+T淋巴細(xì)胞亞群，正常情況下，Th1/Th2之間相互調(diào)節(jié)、相互制約從而維持動態(tài)平衡狀態(tài)，是保障機(jī)體正常免疫功能的基礎(chǔ)，兩者比例一旦失衡將引起免疫功能紊亂，導(dǎo)致疾病發(fā)生[9]。Th1主要分泌IL-2、TNF-α等細(xì)胞因子，正常機(jī)體內(nèi)IL-2能促進(jìn)Th0分化成Th1，抑制Th2相關(guān)細(xì)胞因子分泌；Th2主要分泌IL-4、IL-10等細(xì)胞因子，能促進(jìn)Th0分化成Th2[10]。Th1/Th2平衡失調(diào)與多種疾病發(fā)生、發(fā)展相關(guān)，如施林林等[11]發(fā)現(xiàn)老年性皮膚瘙癢癥患者Th1細(xì)胞功能亢進(jìn)，Th2細(xì)胞功能衰退，這種功能改變與疾病嚴(yán)重程度相關(guān)，糾正Th1/Th2失衡可達(dá)到治療目的。本研究結(jié)果顯示，研究組血清IL-4、IL-10水平低于對照組，IL-2水平高于對照組(P<0.05)，但兩組TNF-α水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，與衡偉偉等[12]的研究結(jié)果相似，這提示突發(fā)性耳聾患者Th1功能亢進(jìn)，Th1相關(guān)細(xì)胞因子處于細(xì)胞免疫主導(dǎo)地位。此外，研究組IL-2/IL-4、TNF-α/IL-4比值高于對照組(P<0.05)，但兩組IL-2/IL-10、TNF-α/IL-10比值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，這進(jìn)一步提示突發(fā)性耳聾患者存在Th1/Th2失衡，且Th1占主導(dǎo)地位。IL-2、TNF-α為促炎因子，能趨化炎性細(xì)胞積聚于受累組織，釋放大量活性物質(zhì)，加重局部炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致局部損傷；而IL-4、IL-10為抑炎因子，當(dāng)機(jī)體受到細(xì)菌感染時(shí)IL-10分泌量增加，抑制IL-2、TNF-α分泌，以增強(qiáng)對機(jī)體的免疫保護(hù)[13-14]。在突發(fā)性耳聾中，IL-2、TNF-α分泌增加使Th2細(xì)胞分化減少，抑炎因子分泌量減少，出現(xiàn)Th1/Th2細(xì)胞失衡，并向Th1漂移。相關(guān)性分析顯示，突發(fā)性耳聾血清IL-2、TNF-α水平與IL-4無明顯相關(guān)性(P>0.05)，與IL-10呈負(fù)相關(guān)性(P<0.05)，提示IL-2、TNF-α與IL-10可能通過相互拮抗作用參與突發(fā)性耳聾的發(fā)生、發(fā)展。

極重度耳聾患者血清IL-4水平低于重度耳聾患者，IL-10低于中度耳聾患者，TNF-α水平高于中度、重度耳聾患者(均P<0.05)，提示Th1/Th2平衡失調(diào)可能與突發(fā)性耳聾聽力下降程度有關(guān)，臨床治療時(shí)加強(qiáng)免疫系統(tǒng)治療可能會取得較好的治療效果。有研究表明TNF-α能對糖皮質(zhì)激素受體發(fā)揮抑制作用，當(dāng)TNF-α處于高水平時(shí)糖皮質(zhì)激素類藥物治療效果不佳，這可能也是難治性突發(fā)性耳聾治療效果不理想的原因之一[15-16]。而其他Th1/Th2相關(guān)細(xì)胞因子是否也具有類似作用還未見報(bào)道，需進(jìn)一步研究。

綜上所述，突發(fā)性耳聾患者存在外周血Th1/Th2平衡失調(diào)，以Th1細(xì)胞免疫為主；Th1/Th2平衡失調(diào)可能還與患者聽力下降程度有關(guān)。因此，在突發(fā)性耳聾患者治療過程中應(yīng)注意維持Th1/Th2免疫平衡。