高效液相色譜手性流動(dòng)相添加劑法拆分愈創(chuàng)甘油醚對(duì)映體

翟明翚 韓 爽 王 穎 陳志偉 蘇立強(qiáng)*

(齊齊哈爾大學(xué)化學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院黑龍江齊齊哈爾 161006)

手性藥物已廣泛應(yīng)用于心腦血管疾病、抗腫瘤、抗病毒及基因工程方面，因此手性藥物是現(xiàn)在國(guó)際新藥市場(chǎng)研究與開發(fā)的一個(gè)重要的方向。但是手性藥物因其對(duì)映異構(gòu)體與相應(yīng)受體的相互作用能力不同，使手性藥物表現(xiàn)出不同的生物活性，可能會(huì)給藥物的療效帶來(lái)不利的影響。為了減少手性藥物對(duì)人體產(chǎn)生的代謝負(fù)擔(dān)或可能產(chǎn)生的毒副作用，對(duì)手性藥物進(jìn)行拆分研究是現(xiàn)在手性藥物研究的重大課題和關(guān)注熱點(diǎn)[1]。

圖1 愈創(chuàng)甘油醚化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structure of guaifenesin

愈創(chuàng)甘油醚(Guaifenesin)，化學(xué)名稱為3-(2-甲氧基苯氧基)丙烷-1,2-二醇，該藥能祛痰鎮(zhèn)咳，是多種止咳藥的主要有效成分[2]，可治療急性呼吸道感染[3]、支氣管炎、支氣管哮喘、肺氣腫、矽肺等病[4]。愈創(chuàng)甘油醚是一種手性藥物，其結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1。臨床上該藥以消旋體形式給藥，關(guān)于此藥的拆分方法僅見(jiàn)毛細(xì)管電色譜法[5-7]。

毛細(xì)管電色譜法拆分效果好，但是所使用電泳儀價(jià)格昂貴，不易普及。高效液相色譜手性流動(dòng)相添加劑法，使用普通液相色譜儀和常規(guī)色譜柱，更容易普及。本文選用沒(méi)有毒性的羧甲基-β-環(huán)糊精(CM-β-CD)作為手性添加劑，使用C18色譜柱，采用高效液相色譜法(HPLC)對(duì)愈創(chuàng)甘油醚對(duì)映體進(jìn)行了拆分研究，在優(yōu)化色譜條件下，對(duì)映體達(dá)到基線分離。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

P200Ⅱ高效液相色譜儀(大連依利特分析儀器有限公司)，附Echrom98色譜工作站、UV200Ⅱ紫外檢測(cè)器、P200Ⅱ高壓恒流泵；SK1200超聲波清洗器(上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司)；HI 98128便攜式酸度計(jì)(上海加惠儀器儀表有限公司)。

色譜純甲醇、乙腈(天津市科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心)；β-環(huán)糊精(β-CD)(中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司)；羧甲基-β-環(huán)糊精(CM-β-CD)實(shí)驗(yàn)室制備；超純水由GWB-2超純水器(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)制備。

愈創(chuàng)甘油醚(武漢祥和化工有限公司)。

1.2 樣品溶液的配制

準(zhǔn)確稱取愈創(chuàng)甘油醚0.0050 g，加水溶解后，轉(zhuǎn)入10 mL容量瓶中并定容至刻度，經(jīng)0.45 μm針筒過(guò)濾器過(guò)濾后備用，使用前超聲脫氣。

1.3 色譜條件

色譜柱：Hypersil ODS柱(200 mm×4.6 mm,5 μm)；流動(dòng)相：甲醇-乙腈-水(體積比為15∶70∶15)。CM-β-CD的濃度為0.5 g/L，pH=4.26；流速為0.2 mL/min；三乙胺濃度為0.1%(V/V)；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)：226 nm；進(jìn)樣量：4 μL。

2 結(jié)果與討論

2.1 手性添加劑的選擇

環(huán)糊精類添加劑具有內(nèi)腔疏水、外腔親水的特性，體積大小合適的藥物對(duì)映體可進(jìn)入空腔與其發(fā)生包合作用，又因其內(nèi)部的手性識(shí)別能力[8]，以及空腔邊緣的極性基團(tuán)的作用[9]，藥物對(duì)映體與其形成穩(wěn)定性不同的非對(duì)映體包合物，產(chǎn)生的色譜行為差異使藥物對(duì)映體得到分離。本文分別考察了添加劑為β-CD和CM-β-CD時(shí)愈創(chuàng)甘油醚對(duì)映體的拆分情況，結(jié)果見(jiàn)圖2。從色譜圖中可以看出：添加劑為CM-β-CD(圖2(A))時(shí)，愈創(chuàng)甘油醚對(duì)映體沒(méi)有分離，而添加劑為CM-β-CD(圖2(B))時(shí)，愈創(chuàng)甘油醚對(duì)映體達(dá)到了基線分離。

圖2 愈創(chuàng)甘油醚對(duì)映體在添加劑β-CD(A)和CM-β-CD(B)中分離色譜圖Fig.2 Guaifenesin separated by β-CD(A) and CM-β-CD(B) as mobile phase additivesdetection wavelength:226 nm;mobile phase:methanol∶acetonitrile∶water=15∶70∶15;pH=4.26;rate:0.2 mL/min.

2.2 流動(dòng)相中CM-β -CD濃度對(duì)拆分的影響

圖3 CM-β-CD濃度對(duì)分離的影響Fig.3 Effect of concentrations of CM-β-CD on the resolution

一方面，藥物對(duì)映體與吸附在固定相上的CM-β-CD發(fā)生包合作用；另一方面，藥物對(duì)映體與游離的CM-β-CD發(fā)生包合作用，兩方面作用均形成非對(duì)映體包合物，從而產(chǎn)生色譜行為差異使藥物對(duì)映體得到拆分[10]。藥物對(duì)映體與CM-β-CD的主-客體作用是立體選擇性的，而且是可逆的。包合物的形成和擴(kuò)散存在一種平衡，CM-β-CD的濃度可影響這種平衡，進(jìn)而影響包合物穩(wěn)定常數(shù)的差異及其在固定相表面作用的差異，影響對(duì)映體的拆分效果，從圖3中可以看出CM-β-CD濃度的變化對(duì)分離度的影響。CM-β-CD濃度較低時(shí)，形成的對(duì)映體包合物的穩(wěn)定性差，吸附作用弱，分離效果差；CM-β-CD濃度的增加，主客體之間的相互作用的機(jī)會(huì)增多，有利于增強(qiáng)它們之間的相互作用，立體選擇性增強(qiáng)，形成的對(duì)映體包合物穩(wěn)定性的差異及吸附作用的差異擴(kuò)大，分離度Rs增大；當(dāng)CM-β-CD的濃度過(guò)高時(shí)，游離的CM-β-CD吸附在固定相表面，與對(duì)映體包合物競(jìng)爭(zhēng)作用位點(diǎn)，降低了包合物在固定相上的吸附作用，分離度下降。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，CM-β-CD的最佳濃度為0.5 g/L。

2.3 有機(jī)修飾劑對(duì)分離的影響

有機(jī)修飾劑的極性影響CM-β-CD與對(duì)映體的包絡(luò)平衡[11]，因此可以通過(guò)添加合適的有機(jī)修飾劑改變包合物的形成常數(shù)，以改善分離。本實(shí)驗(yàn)選用甲醇和乙腈作為有機(jī)修飾劑，考察了不同配比的有機(jī)修飾劑對(duì)藥物對(duì)映體的拆分情況，結(jié)果見(jiàn)表1。相同的條件下，在不同的有機(jī)修飾劑中的分離效果不同，可能的原因是：乙腈對(duì)愈創(chuàng)甘油醚的洗脫能力較弱，CM-β-CD與藥物對(duì)映體形成的包合物的穩(wěn)定性增強(qiáng)，色譜行為差異擴(kuò)大，藥物對(duì)映體分離效果好，但是CM-β-CD在乙腈含量較高的乙腈-水體系中的溶解度低，影響分離；甲醇的極性較強(qiáng)，在乙腈-水體系中加入適量的甲醇，可以增加CM-β-CD在體系中的溶解度，藥物對(duì)映體與CM-β-CD發(fā)生包合作用的機(jī)會(huì)增多，并且保持流動(dòng)相的極性，改變了流動(dòng)相的洗脫能力[12]，生成的非對(duì)映體絡(luò)合物保留值差異增大，分離度提高；在甲醇含量較多時(shí)，甲醇進(jìn)入CM-β-CD空腔降低了疏水作用，使愈創(chuàng)甘油醚對(duì)映體被置換到水相中，不能形成穩(wěn)定的包合物，所以分離度較低；當(dāng)甲醇、乙腈、水的體積比分別為15∶70∶15和20∶70∶10時(shí)，分離度Rs>1.5，拆分對(duì)映體藥物效果良好。但當(dāng)流動(dòng)相比例為20∶70∶10時(shí)，對(duì)映體色譜峰出現(xiàn)嚴(yán)重的拖尾現(xiàn)象。綜合考慮峰形和分離度，選擇流動(dòng)相中甲醇∶乙腈∶水=15∶70∶15進(jìn)行拆分。

表1 流動(dòng)相中有機(jī)修飾劑對(duì)分離的影響Table 1 Effect of organic modifier on the resolution

2.4 流動(dòng)相pH值對(duì)分離的影響

pH值較低時(shí)，CM-β-CD帶負(fù)電荷，愈創(chuàng)甘油醚含有可電離的羥基帶正電荷，pH值的變化影響它們的電離狀態(tài)。但是考慮到色譜柱的使用范圍，考察pH值范圍為3.50～4.50(圖4)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)pH值為4.26時(shí)，CM-β-CD的羧甲基發(fā)生電離作用帶負(fù)電荷，愈創(chuàng)甘油醚的羥基帶正電荷，兩者產(chǎn)生強(qiáng)烈的靜電作用，手性識(shí)別能力最強(qiáng)，形成的非對(duì)映體包合物的色譜行為差異最大，分離效果最好。

2.5 三乙胺對(duì)分離的影響

本實(shí)驗(yàn)使用三乙胺和冰HAc形成緩沖體系，調(diào)節(jié)流動(dòng)相的pH值，以達(dá)到提高分離度的目的。同時(shí)，愈創(chuàng)甘油醚的醚鍵與C18柱上的硅羥基產(chǎn)生氫鍵，三乙胺作為改性劑，與C18柱上的硅羥基結(jié)合，可減少其拖尾[13]，改善峰形，進(jìn)而改善分離。但是三乙胺濃度的增加，又會(huì)降低對(duì)映體包合物在固定相上的吸附，使分離度下降。在優(yōu)化的pH值條件下，考察了流動(dòng)相中三乙胺體積濃度在0.04%～0.12%范圍對(duì)于分離的影響(圖5)，結(jié)果表明當(dāng)三乙胺含量為0.10%時(shí)，分離度Rs最大。

圖4 pH值對(duì)分離度的影響Fig.4 Effect of pH on the resolution

圖5 三乙胺體積濃度對(duì)分離的影響Fig.5 Effect of volume concentrations of triethylamine on the resolution

2.6 流速對(duì)分離的影響

藥物對(duì)映體與手性添加劑CM-β-CD動(dòng)態(tài)包合的過(guò)程相對(duì)較慢，當(dāng)流速較快時(shí)，游離的CM-β-CD和所形成的非對(duì)映體包合物在固定相上的吸附作用弱，愈創(chuàng)甘油醚與CM-β-CD形成的包合物穩(wěn)定性變差，導(dǎo)致分離效果不好；隨著流速的降低，保留時(shí)間延長(zhǎng)，穩(wěn)定性增強(qiáng)，吸附作用增強(qiáng)，分離度提高，但速度過(guò)慢，擴(kuò)散作用又會(huì)帶來(lái)不利影響，使分離度降低。本文考察了0.1 mL/min至0.5 mL/min流速對(duì)分離的影響，結(jié)果表明當(dāng)流速為0.2 mL/min時(shí)，分離效果最好。

2.7 方法的重現(xiàn)性

在優(yōu)化色譜條件下，重復(fù)進(jìn)樣5次，兩對(duì)映體保留時(shí)間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.25%和0.27%，重現(xiàn)性好。

3 結(jié)論

本文通過(guò)優(yōu)化色譜實(shí)驗(yàn)條件，實(shí)現(xiàn)了愈創(chuàng)甘油醚對(duì)映體基線分離，成功建立高效液相色譜手性流動(dòng)相添加劑法拆分愈創(chuàng)甘油醚對(duì)映體的方法，為該藥的進(jìn)一步研究，提供了一種有效的分離手段。該方法選擇性高，操作簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)，容易普及，可廣泛應(yīng)用于手性藥物的拆分研究中。