兒茶酚抑素抑制血管鈣化的作用及機(jī)制

樊小容，譚小青，張旭升，黃戰(zhàn)軍，蔡博治

1.深圳市龍崗區(qū)人民醫(yī)院心血管內(nèi)科，廣東 深圳 518172；

2.汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院分子心臟病學(xué)實(shí)驗(yàn)室，廣東 汕頭 515041

血管鈣化為過量鈣鹽沉積于血管壁，是主動(dòng)的、多因素調(diào)節(jié)的過程[1]，多種活性因子參與調(diào)控血管鈣化的發(fā)生發(fā)展。血管鈣化作為導(dǎo)致臨床心血管事件的重要危險(xiǎn)因素已成為共識(shí)，防治血管鈣化顯得特別重要，因此，尋求新的活性因子不僅可作為血管鈣化機(jī)制的重要補(bǔ)充，也為防治血管鈣化提供新的策略。兒茶酚抑素 (catestatin，CST) 是由腎上腺嗜鉻細(xì)胞產(chǎn)生的嗜鉻顆粒蛋白A，由21個(gè)氨基酸組成的多肽結(jié)構(gòu)，通過抑制交感腎上腺系統(tǒng)兒茶酚胺的釋放，可調(diào)節(jié)心血管系統(tǒng)作用如舒張血管、調(diào)節(jié)血壓及心肌收縮力等[2]，然而對(duì)血管鈣化的影響尚未見國內(nèi)外學(xué)者報(bào)道，因此，本實(shí)驗(yàn)將探討CST 對(duì)大鼠血管鈣化的作用以及可能相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和相關(guān)試劑來源 SD大鼠24只，雄性，8周齡，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。CST購自Tocris生物科技有限公司；維生素D3由Sigma公司生產(chǎn)，尼古丁由Merck公司生產(chǎn)；鈣離子測試盒和ALP試劑盒購自南京建成生物工程研究所；MCP-1試劑盒和TNF-α試劑盒購自北京華英生物研究所。

1.2 動(dòng)物模型的制備與取材 按隨機(jī)數(shù)表法將24 只雄性SD 大鼠分為正常組、鈣化組和鈣化+CST組，每組8 只。正常組大鼠在造模當(dāng)天予生理鹽水肌注和花生油灌胃處理；鈣化組大鼠在實(shí)驗(yàn)當(dāng)天予維生素D3(300 000 U/Kg 在大腿肌肉注射1 次) ，并用尼古丁灌胃 (25 mg/kg，早晚各1次) ；鈣化+CST組大鼠在造模后第二天開始用CST 2 nmol/ (kg·d) 腹腔內(nèi)注射。然后三組大鼠常規(guī)飼養(yǎng)4周，麻醉后取材，分離主動(dòng)脈組織，其中一部分組織多聚甲醛固定后制作蠟塊，其余組織錫紙包裹并標(biāo)記，-80℃儲(chǔ)存。低溫離心分離血清，-80℃保存。

1.3 Von Kossa染色 取大鼠胸主動(dòng)脈做石蠟切片，1%硝酸銀溶液浸泡，紫外線照射后，5%硫代硫酸鈉溶液浸泡，堿性品紅染色。

1.4 ALP 活性及鈣離子含量測定 將大鼠主動(dòng)脈組織剪碎并勻漿后，取上清檢測，用甲基百里香酚藍(lán)比色法檢測鈣離子含量，用磷酸苯二鈉法檢測ALP活性，詳細(xì)步驟見試劑盒說明書。

1.5 血清單核細(xì)胞趨化蛋白-1 (MCP-1) 、腫瘤壞死因子-α (TNF-α) 含量測定 采用放射免疫法檢測大鼠血清MCP-1和TNF-α含量，具體步驟詳見試劑盒說明書。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用Graph Pad Prism 4 統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較用單因素方差分析，組間兩兩比較采用q 檢驗(yàn)，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組大鼠的血管鈣化指標(biāo)比較 與正常組大鼠比較，鈣化組大鼠主動(dòng)脈中膜可見較多黑色顆粒表達(dá) (Von Kossa 染色) ，提示鈣鹽沉積明顯，用CST 干預(yù)后，主動(dòng)脈組織鈣鹽沉積明顯減少，見圖1。與此同時(shí)，鈣化組大鼠主動(dòng)脈組織的鈣離子含量及ALP活性明顯升高，與正常組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05) ；經(jīng)CST干預(yù)后，鈣化+CST組大鼠的鈣離子含量及ALP活性較鈣化組明顯減輕，與鈣化組大鼠比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05) ，見表1。

圖1 大鼠主動(dòng)脈Von Kossa染色，黑色顆粒為鈣鹽沉積 (×100)

表1 三組大鼠主動(dòng)脈組織鈣含量與ALP活性比較

表1 三組大鼠主動(dòng)脈組織鈣含量與ALP活性比較

注：與正常組比較，aP＜0.05；與鈣化組比較，bP＜0.05。

組別正常組鈣化組鈣化+CST組F值P值只數(shù)8 8 8鈣含量 (mmol/g蛋白) 0.38±0.13 0.94±0.11a 0.78±0.09ab 108.46＜0.05 ALP活性 (U/g蛋白) 112.82±13.52 217.50±14.43a 179.88±12.75ab 217.84＜0.05

2.2 三組大鼠血清MCP-1和TNF-α濃度比較 鈣化組大鼠血清MCP-1 和TNF-α濃度明顯高于正常組大鼠，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05) ，經(jīng)CST 干預(yù)后，鈣化+CST 組大鼠的血清MCP-1 和TNF-α濃度較鈣化組大鼠明顯下降，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05) ，見表2。

表2 三組大鼠的血清MCP-1和TNF-α濃度比較

表2 三組大鼠的血清MCP-1和TNF-α濃度比較

注：與正常組比較，aP＜0.05；與鈣化組比較，bP＜0.05。

組別正常組鈣化組鈣化+CST組F值P值只數(shù)8 8 8 MCP-1 (pg/mL) 65.55±2.35 93.75±3.15a 79.13±2.23ab 512.20＜0.05 TNF-α (ng/mL) 0.91±0.05 1.42±0.09a 1.22±0.07ab 233.85＜0.05

3 討論

血管鈣化與骨組織的骨化過程類似，細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化是關(guān)鍵 (由收縮型血管平滑肌細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)槌晒羌?xì)胞型) ，同時(shí)合并局部骨相關(guān)蛋白和活性因子分泌增多，ALP 活性升高，促進(jìn)鈣鹽沉積；促進(jìn)鈣化因子與抑制鈣化因子在血管鈣化的發(fā)展過程中起著至關(guān)重要的調(diào)節(jié)作用。研究已證實(shí)，在病理情況下如氧化應(yīng)激、高血壓、高血糖、高脂血癥、高尿酸血癥以及炎癥反應(yīng)等可導(dǎo)致血管損傷，一些活性因子作為促鈣化因子協(xié)同促進(jìn)血管鈣化的發(fā)展；另一方面，一些活性因子如Ghrelin作為血管鈣化抑制因子可保護(hù)血管功能，從而減輕血管鈣化。其過程可能涉及多條信號(hào)通道包括TGF-β/BMPs/Smad 通路和MAPK 通路等[3-6]。本課題組的前期研究發(fā)現(xiàn)尿酸、醛固酮、salusin β和部分炎癥因子 (IL-6、MCP-1、CRP) 等活性因子的表達(dá)促進(jìn)血管鈣化過程[3，7-9]。LARIVIèRE等[10]也在慢性腎臟病大鼠模型觀察到，隨著血管平滑肌細(xì)胞分化為成骨樣細(xì)胞，不僅骨信號(hào)分子BMP-25 和骨鈣素表達(dá)增加，IL-6、TNF-α 等炎癥因子的表達(dá)也同步明顯增加。其他文獻(xiàn)也證實(shí)單核/巨噬細(xì)胞分泌的TNF-α、IL-6等炎癥因子可誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞向成骨樣表型轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致血管鈣化的發(fā)生與發(fā)展[11]。以上研究均表明炎癥因子在血管鈣化的發(fā)生與發(fā)展過程中起著關(guān)鍵的作用。除此，近來研究證實(shí)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和自噬的交互作用可影響血管鈣化的發(fā)展，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激激動(dòng)劑衣霉素和自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤干預(yù)，血管鈣化程度均有加重[12]。而另外一些研究表明抑制鈣化因子在血管鈣化中同樣起著重要作用：胎球蛋白A及焦磷酸鹽可通過抑制磷酸鈣的形成和沉積來抑制血管鈣化[13]。APE1/Ref-1可通過氧化還原來抑制成骨細(xì)胞分化和減少氧化應(yīng)激，對(duì)磷酸鹽誘導(dǎo)的血管鈣化起抑制作用[14]。

CST是一種新的內(nèi)源性多肽，在心血管疾病中的作用日益受到關(guān)注。臨床研究表明CST不僅可作為原發(fā)性高血壓、心力衰竭患者的血清標(biāo)志物，而且在急性冠脈綜合征患者中還可預(yù)測病情的嚴(yán)重程度[15-17]。最新的研究表明CST 可通過抑制炎癥反應(yīng)從而發(fā)揮血管保護(hù)作用。在糖尿病、結(jié)腸炎和動(dòng)脈粥樣硬化小鼠模型中，CST可減少免疫細(xì)胞在受累組織中的浸潤，體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)均證實(shí)其能將巨噬細(xì)胞的分化從促炎表型轉(zhuǎn)化為抗炎表型，從而有效發(fā)揮抑制炎癥作用[18]。在一項(xiàng)對(duì)冠心病患者血清CST 濃度與動(dòng)脈粥樣硬化程度的相關(guān)性的研究中，與健康受試者相比，冠心病患者中血清CST濃度明顯降低，且與疾病嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān)[19]。對(duì)于CST作用的信號(hào)傳導(dǎo)通路也有進(jìn)一步的研究證實(shí)，EISSA 等[20]在潰瘍性結(jié)腸炎患者發(fā)現(xiàn)CST 的蛋白和mRNA表達(dá)水平明顯下降，應(yīng)用CST治療可以使IL-8表達(dá)下調(diào)，用STAT-3 阻斷劑可以阻斷CST 的治療效應(yīng)，從而推測CST 可能通過STAT-3 依賴途徑而發(fā)揮調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的作用；國內(nèi)學(xué)者在間歇低氧高血壓大鼠實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，CST可以減輕間歇低氧導(dǎo)致大鼠高血壓的效應(yīng)，并且可使主動(dòng)脈組織胞漿中核因子E2相關(guān)因子2 (Nrf2) 蛋白表達(dá)顯著下調(diào)，而胞核中Nrf2 蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，推測CST 可能與通過Nrf2-ARE 信號(hào)通路作用有關(guān)[21]。

本研究結(jié)果顯示，應(yīng)用維生素D3聯(lián)合尼古丁成功誘導(dǎo)血管鈣化動(dòng)物模型，觀察到大鼠主動(dòng)脈鈣鹽明顯沉積，主動(dòng)脈組織中鈣含量增加，ALP 活性上調(diào)。各試驗(yàn)組中炎癥指標(biāo) (MCP-1、TNF-α) 明顯高于正常組，與國內(nèi)外學(xué)者實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，再次證實(shí)炎癥因子與血管鈣化密切相關(guān)。經(jīng)CST干預(yù)后，血管鈣化的程度明顯改善，且大鼠血清炎癥因子MCP-1、TNF-α表達(dá)明顯低于鈣化組，提示CST可能通過抑制炎癥因子表達(dá)改善血管鈣化的程度，從而發(fā)揮血管保護(hù)作用，但是否通過其他機(jī)制作用尚不清楚 (如抑制其他促鈣化因子的協(xié)同作用) 。

綜上所述，兒茶酚抑素能抑制血管鈣化的進(jìn)程，可作為臨床防治血管鈣化新的作用靶點(diǎn)，然而可能涉及的信號(hào)通路需進(jìn)一步研究證實(shí)。