高效液相色譜-電感耦合等離子體質譜法測定人尿中硒形態(tài)

劉 源，陳紹占，陳 鎮(zhèn)，姚曉慧，周天慧，劉麗萍*

(1.首都醫(yī)科大學 公共衛(wèi)生學院，北京 100069；2.北京市疾病預防控制中心 食物中毒診斷溯源技術北京市重點實驗室，北京 100013；3.北京市預防醫(yī)學研究中心，北京 100013)

硒作為人和動物必需的微量元素，在人類健康中起著非常重要的作用，硒攝入不足或過量均可導致疾病。世界衛(wèi)生組織公布的數據顯示，全球40多個國家存在低硒或缺硒的情況[1]。適量補充硒可對某些癌癥起到預防作用[2-5]。目前，膳食補硒是最為直接便捷的硒補充途徑[6]。硒化物存在不同形態(tài)，無機形態(tài)的硒化物中，單質硒無毒，亞硒酸鈉的毒性大于硒酸鈉，H2Se的毒性比SeO2大5倍[7]；而硒代胱氨酸(SeCys2)、甲基硒代半胱氨酸(MeSeCys)、硒代蛋氨酸(SeMet)等有機硒富有營養(yǎng)，便于動物體吸收利用。因此，建立人尿中硒形態(tài)的測定方法，探究硒在人體中的代謝轉化規(guī)律，對于硒在生物體中的利用、代謝過程研究及其營養(yǎng)作用評估具有重要意義。

硒形態(tài)的分離檢測技術主要有體積排阻色譜(SEC-HPLC)、反相離子對色譜(RP-IP-HPLC)、液相色譜-原子熒光光譜(LC-AFS)、高效液相色譜-電感耦合等離子體質譜(HPLC-ICP/MS)等。其中，HPLC-ICP/MS憑借其靈敏度高、分離效果好、線性范圍寬等優(yōu)點，廣泛應用于食品與生物樣本中硒形態(tài)的分析研究。曹玉嬪等[8]采用HPLC-ICP/MS測定牛蒡和三七中的硒形態(tài)，但只能分離4種硒形態(tài)。王丙濤等[9]利用HPLC-ICP/MS測定食品中SeCys2、亞硒酸鹽Se(Ⅳ)、SeMet、硒代乙硫氨酸(SeEt)、硒酸鹽Se(Ⅵ)5種硒形態(tài)，但分析時間長達21 min。張碩等[10]使用RP-8反相色譜整體柱和自制的高靈敏度原子熒光光譜系統(tǒng)，分離了SeCys2、Se(Ⅳ)、SeMet、Se(Ⅵ)4種硒形態(tài)。喻宏偉等[11]使用HPLC-ICP/MS在RP18反相色譜柱上分離了人尿中的5種硒形態(tài)，但部分質子化組分在主峰后形成干擾峰，給定量分析帶來誤差。Chatterjee等[12]使用GS-220色譜柱分離了人尿中Se(Ⅳ)、Se(Ⅵ)和三甲基硒離子(TMSe+)3種硒形態(tài)，但其實用性受到限制。Moreno等[13]使用Phenomenex Luna C18色譜柱分析人尿中硒形態(tài)，但MeSeCys與Se(Ⅳ)未完全分離。目前，使用陰離子交換色譜進行硒形態(tài)分離的文獻報道最多[14-15]。為更好地探究硒在人體中的吸收代謝情況，本文采用直接稀釋/HPLC-ICP/MS法對人尿中SeCys2、MeSeCys、Se(Ⅳ)、SeMet、Se(Ⅵ)5種硒形態(tài)進行分析，可為進一步研究硒與人體健康的關系提供技術支持。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

1260 型高效液相色譜儀及7700x型電感耦合等離子體質譜儀(美國Agilent公司)；Hamilton PRP-X100陰離子交換柱(250 mm×4 mm，10 μm)及其保護柱(美國哈密爾頓公司)；Milliplus 2150超純水處理系統(tǒng)(美國密理博公司)；數控超聲清洗器(可控溫20～80 ℃，昆山市超聲儀器有限公司)。超純水：電阻率18.2 MΩ·cm；磷酸氫二銨((NH4)2HPO4，國藥集團化學試劑有限公司)為優(yōu)級純；甲醇(美國Sigma公司)、甲酸(ROE Scientific公司)為色譜純；蛋白酶XIV(美國Sigma公司)；SeCys2、MeSeCys、Se(Ⅳ)、SeMet、Se(Ⅵ)溶液標準物質均購于中國計量科學研究院。

1.2 樣品前處理方法

直接稀釋法：取1 mL尿樣于15 mL離心管中，加入2 mL超純水稀釋，渦旋30 s，9 000 r/min離心10 min，取上清液過0.22 μm水系濾膜，同時做空白對照。

超聲酶解法：取1 mL尿樣于15 mL離心管中，加入2 mL超純水稀釋，渦旋30 s，分別加入10、20 mg的蛋白酶XIV并于37 ℃下加熱超聲1 h，9 000 r/min離心10 min，取上清液過0.22 μm水系濾膜，同時做空白對照。

1.3 測定方法

色譜條件：色譜柱：Hamilton PRP-X100陰離子交換柱(250 mm×4 mm，10 μm)；流動相：40 mmol/L(NH4)2HPO4(含1%甲醇，pH 5)；流速：1.2 mL/min，數據采集時間：13 min；進樣量：100 μL。

ICP/MS條件：RF入射功率：1 550 W，載氣：高純氬氣，載氣流速：0.70 L/min，輔助氣流速：0.45 L/min，射頻電壓：1.80 V，采樣深度：8.0 mm，泵速：0.3 r/s。

圖1 5種硒形態(tài)的色譜圖(25 μg/L)

2 結果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

選擇40 mmol/L(NH4)2HPO4作為流動相，考察了流動相pH值對5種目標硒形態(tài)分離度的影響。結果顯示，當pH<5時，MeSeCys與Se(Ⅳ)的分離度較差；當pH=5時，5種硒形態(tài)的分離度最好；當pH>5時，5種硒形態(tài)的分析時間明顯縮短，但分離度變差；當pH>7時，部分硒形態(tài)不能出峰。實驗發(fā)現(xiàn)，在流動相中加入1%甲醇可以增強信號強度，且不影響硒形態(tài)的分離度，因此最終選擇40 mmol/L(NH4)2HPO4(含1%甲醇，pH 5)作為流動相。本方法為等度洗脫，為縮短分析時間，調節(jié)流動相流速為1.2 mL/min，可在13 min內完成樣品測定(見圖1)。

2.2 前處理方法的優(yōu)化

分別采用直接稀釋法和超聲酶解法對新鮮尿樣進行分析，結果見表1。結果表明，新鮮尿樣經超聲酶解法預處理后，隨著加酶量的增加，測得SeCys2及Se(Ⅳ)的質量濃度減少，SeMet及Se(Ⅵ)增加，而總硒形態(tài)減少。由此可見，超聲酶解法會改變尿中硒形態(tài)，不適用于尿中硒形態(tài)的預處理。因此，本實驗采用直接稀釋法進行前處理，可以滿足分析要求。

表1 兩種預處理方法對尿中硒形態(tài)分析結果的比較

Table 1 Comparison of analysis results for selenium speciations in urine by two pretreatment methodsρ/(μg·L-1)

Sample SeCys2MeSeCysSe(Ⅳ)SeMetSe(Ⅵ)Total selenium speciationSample 1 direct dilution(尿樣1直接稀釋)14.3-?3.73--18.1Sample 1+10 mg enzyme(尿樣1+10 mg酶)4.20-2.152.101.8410.3Sample 1+20 mg enzyme(尿樣1+20 mg酶)1.22-1.602.931.897.64Sample 2 direct dilution(尿樣2直接稀釋)7.06-2.17--9.24Sample 2+10 mg enzyme(尿樣2+10 mg酶)4.18-1.431.721.208.53Sample 2+20 mg enzyme(尿樣2+20 mg酶)2.24-1.082.191.827.34

*not detected

2.3 線性范圍與檢出限

在最佳實驗條件下，分別配制0.5、1.0、5.0、10.0、25.0、50.0、100.0、200.0、300.0 μg/L的SeCys2、MeSeCys、Se(Ⅳ)、SeMet、Se(Ⅵ)混合標準溶液，采用本方法進行測定，以各形態(tài)的色譜峰面積(y)與對應質量濃度(x，μg/L)繪制標準曲線。結果表明，5種硒形態(tài)在0～300.0 μg/L質量濃度范圍內線性較好，相關系數(r)均大于0.999(見表2)。

檢出限采用逐級稀釋法測定，以3倍基線噪聲(S/N=3)時硒形態(tài)的質量濃度為檢出限，SeCys2、MeSeCys、Se(Ⅳ)、SeMet、Se(Ⅵ)的檢出限分別為0.2、0.2、0.2、0.5、0.3 μg/L(見表2)。

表2 方法的線性關系及檢出限

2.4 方法準確性

采用加標回收實驗考察方法準確性。選取1個尿樣，分別添加10.0、30.0、70.0 μg/L 3個濃度水平的5種硒形態(tài)混合標準溶液，平行制備6個樣品進行測定，結果見表3。結果顯示，SeCys2的加標回收率為37.7%～70.4%，其余4種硒形態(tài)的回收率為80.0%～123%。

針對SeCys2加標回收率較低的情況，選擇上述同一尿樣進行了SeCys2單標加標實驗，加標濃度為20 μg/L,SeCys2的回收率僅為37.0%和35.2%。綜合加標回收實驗的結果，發(fā)現(xiàn)尿液基質對SeCys2測定有影響，具體影響機理有待進一步研究。

表3 5種硒形態(tài)的加標回收率與相對標準偏差(n=6)

*not detected

2.5 方法精密度

2.5.1 實際樣品的精密度以相對標準偏差(RSD)表示精密度。選取1個尿樣，制備6個平行樣品，采用本方法測定其硒形態(tài)的含量，分別計算RSD。結果表明，5種硒形態(tài)的RSD均不大于7.8%。

2.5.2 模擬樣品的精密度向實際尿樣中加入3個濃度水平的5種硒形態(tài)混合標準溶液，制備成模擬樣品，采用本方法測定硒形態(tài)的含量，分別計算RSD。由表3可知，5種硒形態(tài)的RSD均不大于4.7%。

2.6 實際樣品的測定

采用本方法對6名志愿者的隨機尿樣與40份送檢隨機尿樣進行硒形態(tài)測定。結果顯示，6名志愿者的尿樣中主要硒形態(tài)為SeCys2，質量濃度為1.88～11.4 μg/L，占測得總硒形態(tài)的57.2%～82.6%，另有少量的MeSeCys、Se(Ⅳ)、SeMet和Se(Ⅵ)；同時發(fā)現(xiàn)1份志愿者尿樣在Se(Ⅵ)峰后出現(xiàn)未知形態(tài)1(U1)，見圖2A；1份志愿者尿樣在SeCys2峰前出現(xiàn)未知形態(tài)2(U2)，見圖2B。40份送檢尿樣中主要硒形態(tài)為SeCys2，質量濃度為0.77～3.16 μg/L，占測得總硒形態(tài)的41.9%～88.0%，另有少量的MeSeCys、Se(Ⅳ)、SeMet和Se(Ⅵ)，在部分送檢尿樣中發(fā)現(xiàn)SeCys2峰前出現(xiàn)未知形態(tài)3(U3)，見圖2C，其保留時間與U2相近。對于未知形態(tài)的具體成分有待進一步分析。

圖2 尿樣1(A)、尿樣2(B)與尿樣3(C)的硒形態(tài)色譜圖

3 結 論

本研究建立了尿液中5種硒形態(tài)的高效液相色譜-電感耦合等離子體質譜分析方法，比較了超聲酶解法與直接稀釋法的提取效果，并優(yōu)化了測定條件，可在13 min內完成5種硒形態(tài)分析。采用該方法對實際樣品進行測定，發(fā)現(xiàn)人體尿液中硒形態(tài)主要以SeCys2為主，同時含有少量MeSeCys、SeMet、無機硒及未知含硒化合物。該方法具有樣品前處理簡便、靈敏度高、精密度好、準確可靠等優(yōu)點，除了SeCys2的加標回收率較低外，其余4種硒形態(tài)的回收率可以滿足分析要求。研究結果可為探究硒在人體中的吸收代謝情況和進一步研究硒與健康的關系提供技術支持。