基于金納米粒子及石墨烯量子點的四環(huán)素分子印跡電化學傳感器研究

于壯壯，康天放，魯理平

(北京工業(yè)大學 區(qū)域大氣復合污染防治北京市重點實驗室 環(huán)境與能源工程學院，北京 100124)

四環(huán)素(TC)是一類用于治療感染性疾病的抗生素，具有廣譜的抗菌性和較低的成本，已廣泛用于疾病預防、感染治療、畜牧業(yè)和水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)等。但四環(huán)素類藥物的濫用會在肉類、牛奶、蜂蜜、雞蛋等動物源食品中造成較高的殘留，過量攝入不僅會引起人體視力衰減、牙齒變色等問題，還會使某些過敏個體產(chǎn)生過敏性反應(yīng)和抗藥性等癥狀[1-2]。世界衛(wèi)生組織和歐盟將牛奶中四環(huán)素的最大殘留量(MRL)設(shè)定為100 mg/L，美國食品和藥物管理局(FDA)規(guī)定牛奶中四環(huán)素的MRL為80 mg/L[3]，我國規(guī)定無公害水產(chǎn)品中四環(huán)素、金霉素、土霉素的MRL均為100 μg/kg[4]。環(huán)境中四環(huán)素殘留問題已引起全球關(guān)注，因此建立一種可以實現(xiàn)對食品、藥物制劑和水中四環(huán)素選擇性富集和檢測的方法具有重要意義。目前，四環(huán)素的檢測方法主要有分光光度法[5]、高效液相色譜法[6]、化學發(fā)光法[7]、微生物法[8]、免疫法[9]、毛細管電泳法[10]等，然而這些方法存在樣品前處理過程復雜、所需時間長、儀器價格昂貴、靈敏度低、重現(xiàn)性差等缺點。

分子印跡是指在模板分子存在下功能單體聚合形成聚合物，使模板分子和功能單體之間通過非共價鍵、可逆的共價鍵等結(jié)合在一起，當聚合物中的模板分子被洗脫后，形成與模板分子大小、形狀及作用位點相匹配的空腔，該空腔可特異性識別模板分子。分子印跡聚合物(Molecular imprinting polymer，MIP)具有預定性、識別性和實用性，基于MIP的電化學傳感器具有選擇性高、響應(yīng)快速、操作簡便等優(yōu)勢[11]。近年來，關(guān)于四環(huán)素分子印跡傳感器的研究已有一些報道[12-13]。金納米粒子(AuNPs)具有比表面積大、電催化活性高和導電性優(yōu)異等性能，與MIP具有良好的共容性和穩(wěn)定性[14-15]。石墨烯量子點(GQDs)是尺寸小于100 nm的石墨烯片，具有顯著的量子限域和邊緣效應(yīng)、較大的比表面積、良好的電子遷移速率和化學穩(wěn)定性[16-17]，因此可以提高分子印跡膜對目標分子識別的靈敏度。

本研究將金納米粒子電化學沉積在裸玻碳電極表面，通過Au-S鍵結(jié)合的方式將4-氨基苯硫酚(4-ATP)自組裝到AuNPs/GCE電極表面，然后將石墨烯量子點(GQDs)修飾到電極表面。以4-氨基苯硫酚為功能單體，TC為模板分子，采用電化學聚合的方法制備了TC分子印跡膜，從而成功構(gòu)建了四環(huán)素分子印跡電化學傳感器(MIPs/GQDs-AuNPs/GCE)。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

電化學實驗在CHI 660E電化學分析儀(上海辰華公司)上進行，采用三電極系統(tǒng)：以玻碳電極或修飾電極為工作電極，飽和甘汞電極為參比電極，鉑絲電極為對電極。BS124S型電子天平(上海天平儀器廠)；KQ218型超聲波清洗儀、KQ400KDE型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；79-1型恒溫加熱磁力攪拌器(天津市工興電器廠)；SU-8010型掃描電子顯微鏡(日本日立公司)；JEM2011透射電子顯微鏡(日本JEOL公司)。

四環(huán)素、4-氨基苯硫酚、卡那霉素、氯霉素、硫酸鏈霉素、硫酸新霉素、土霉素均購于百靈威試劑有限公司；氯金酸固體(HAuCl4·4H2O，Au%>47%)購于北京化學試劑有限公司；無水乙醇、甲醇、磷酸二氫鈉購于北京化工廠；冰乙酸購于天津市光復科技發(fā)展有限公司；檸檬酸、氫氧化鈉、磷酸氫二鈉、氯化鈉、六水合鐵氰化鉀、亞鐵氰化鉀購于天津市福晨化學試劑廠。實驗中所用試劑均為分析純，實驗用水為Milli-Q Advantage A10超純水系統(tǒng)(法國Millipore公司)制備的超純水。

1.2 分子印跡傳感器的制備

1.2.1 石墨烯量子點的制備將2.0 g檸檬酸加入100 mL三口燒瓶中，油浴鍋中加熱至200 ℃，檸檬酸發(fā)生液化，通過熱解反應(yīng)使檸檬酸分子之間脫水縮合，顏色由無色逐漸變?yōu)闇\黃色，30 min后即形成橙色石墨烯量子點[18]，將其逐滴加入到100 mL 10 mg/mL的氫氧化鈉溶液中，攪拌均勻，調(diào)節(jié)其pH值至7.0，即制得20 mg/mL的石墨烯量子點溶液，保存于4 ℃冰箱中，備用。

1.2.2 GQDs-AuNPs/GCE的制備將玻碳電極分別用0.5 μm和50 nm的α-Al2O3粉末拋光成鏡面，再依次用超純水、無水乙醇、超純水各超聲清洗5 min，氮氣吹干后備用。將該電極置于含5.0 mmol/L K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6]的0.1 mol/L KCl溶液中，在-0.2～0.6 V電位范圍內(nèi)以100 mV/s的速率循環(huán)伏安掃描15圈。將預處理好的玻碳電極置于20 mL含0.5 g/L HAuCl4的0.1 mol/L H2SO4溶液中，在-1.5～0.5 V的電位范圍以50 mV/s的速率循環(huán)伏安掃描15圈，使金納米粒子電沉積于玻碳電極表面，制得AuNPs/GCE修飾電極。再移取10 μL 2 mg/mL GQDs溶液滴涂到AuNPs/GCE表面，于室溫下晾干，制得GQDs-AuNPs/GCE修飾電極。

1.2.3 MIPs/GQDs-AuNPs/GCE的制備四環(huán)素分子印跡電化學傳感器的制備過程見圖1A。將AuNPs/GCE電極放入含20 mmol/L 4-ATP的乙醇溶液中，浸泡12 h，進行自組裝，使AuNPs與4-ATP通過Au-S鍵結(jié)合(圖1B)[19]。再將10 μL 2 mg/mL GQDs溶液滴涂到該電極表面，自然晾干。以TC為模板，4-ATP為功能單體，將該修飾電極置于20 mL含20 mmol/L 4-ATP和10 mmol/L TC的磷酸鹽緩沖溶液(PBS,pH 7.0)中，于-0.4～ 0.6 V的電位范圍內(nèi)以50 mV/s的速率循環(huán)伏安掃描15圈，使其在電極表面電聚合形成分子印跡膜，超純水沖洗后，將該電極浸泡到甲醇-乙酸(體積比9∶1)洗脫液中，攪拌10 min，除去TC模板分子，即制得MIPs/GQDs-AuNPs/GCE傳感器。非分子印跡電極(NIPs/GQDs-AuNPs/GCE)制備過程中除不加模板分子TC外，其余步驟同上。

圖1 TC分子印跡電化學傳感器的制備過程(A)及4-ATP在AuNPs上的自組裝示意圖(B)

1.2.4 測定方法移取20 mL含有不同濃度TC的0.1 mol/L磷酸鹽緩沖溶液(PBS，pH 7.0)于電解池中，通氮除氧5 min，以MIPs/GQDs-AuNPs/GCE為工作電極，采用線性掃描伏安法(LSV)，在1.1～1.4 V電位范圍內(nèi)以50 mV/s的速率進行陽極掃描，記錄不同濃度TC的氧化峰電流。

2 結(jié)果與討論

2.1 納米材料及TC分子印跡膜(MIPs)的表征

由AuNPs在裸玻碳電極表面的掃描電鏡(SEM)圖(圖2A)可見，采用電沉積法制備的金納米粒子粒徑分布比較均勻，其平均粒徑約80 nm。GQDs懸濁液的透射電鏡(TEM)圖顯示，制備的石墨烯量子點較為分散，平均直徑約65 nm(圖2B)。在GQDs-AuNPs/GCE電極表面電聚合分子印跡聚合物后，其顆粒尺寸明顯增大，從MIPs/GQDs-AuNPs掃描電鏡圖可見其表面空隙較多(圖2C)，分布更為均勻，而非印跡膜NIPs/GQDs-AuNPs(圖2D)較為團聚，且表面空隙少。

圖2 修飾材料的掃描電鏡圖和透射電鏡圖

圖3 分子印跡膜電聚合的循環(huán)伏安曲線

在預組裝溶液中，功能單體4-ATP的—SH硫原子與電極表面修飾的AuNPs通過Au—S鍵結(jié)合，在電極表面形成4-ATP分子自組裝膜[20]，在含模板分子TC的電聚合溶液中，于-0.4～0.6 V電位范圍內(nèi)循環(huán)伏安掃描15圈，在修飾電極上電聚合生成TC分子印跡膜。由圖3可見，在0.53 V左右出現(xiàn)一個明顯的氧化峰，這與文獻報道基本一致[15]。之后隨著掃描圈數(shù)的增加，電流強度明顯減小且逐漸趨于穩(wěn)定，表明隨著電聚合的進行，電極表面逐漸形成了具有一定導電性的致密分子印跡膜。非分子印跡膜的電聚合循環(huán)伏安曲線與分子印跡膜的基本一致，4-ATP在0.53 V電位下發(fā)生氧化，出現(xiàn)一個明顯的氧化峰，之后隨著掃描圈數(shù)的增加，電流強度也明顯減小且逐漸趨于穩(wěn)定，這表明4-ATP的電聚合不會因TC的存在而受到干擾，且TC在該電位范圍內(nèi)沒有被氧化而出現(xiàn)其它明顯的氧化峰，與文獻報道結(jié)果一致[12-13]。

2.2 不同修飾電極的電化學特性

在含5.0 mmol/L K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6]的0.1 mol/L KCl溶液中，以玻碳電極或修飾電極為工作電極，在-0.2～0.6 V電位范圍內(nèi)進行循環(huán)伏安掃描(圖4A)。結(jié)果顯示，相對于裸玻碳電極(曲線a)的循環(huán)伏安圖，當在電極表面電沉積AuNPs后(曲線b)，氧化峰電流略有增大且峰電位負移，表明在電極表面電沉積AuNPs后，其優(yōu)異的導電性能和電催化作用降低了電化學反應(yīng)的活化能，從而促進了[Fe(CN)6]3-/[Fe(CN)6]4-電對在AuNPs/GCE表面的氧化還原反應(yīng)。當在裸玻碳電極表面修飾GQDs后(曲線c)，其峰電流值明顯減小，表明GQDs表面的羥基和羧基負電基團[18]與[Fe(CN)6]3-/[Fe(CN)6]4-電對之間存在靜電排斥作用，阻礙了該電對的氧化還原反應(yīng)。該電對在GQDs-AuNPs/GCE (曲線d)上的峰電流值明顯要比在AuNPs/GCE(曲線b)和裸GCE(曲線a)上的峰電流值大，這歸因于AuNPs良好的導電性和GQDs大的比表面積，為界面的電子轉(zhuǎn)移提供了良好的基底，并使得在電催化反應(yīng)中產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)，并使得電流明顯增大。當在GQDs-AuNPs/GCE電極表面電聚合分子印跡膜(MIPs)后，[Fe(CN)6]3-/[Fe(CN)6]4-電對在MIPs/GQDs-AuNPs/GCE電極上的循環(huán)伏安掃描曲線中未出現(xiàn)氧化還原峰(曲線e)，說明在電極表面成功電聚合了致密的分子印跡膜，阻礙了該電對在MIPs膜中的傳輸。將MIPs/GQDs-AuNPs/GCE電極置于甲醇-乙酸(體積比9∶1)溶液中洗脫后，再在K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6]溶液中進行循環(huán)伏安電位掃描，氧化還原峰電流明顯增加(曲線f)，表明模板分子TC已被成功洗脫，形成了與TC結(jié)構(gòu)相對應(yīng)的特異性分子印跡空穴，使電極表面有了更多的氧化還原位點和離子通道，從而使部分[Fe(CN)6]3-/[Fe(CN)6]4-離子探針可以擴散到電極表面發(fā)生氧化還原反應(yīng)。而NIPs/GQDs-AuNPs/GCE電極在洗脫前后的循環(huán)伏安曲線基本未發(fā)生變化(曲線g)，未出現(xiàn)氧化還原峰，說明功能單體4-ATP在電極表面形成了一層致密的不導電聚合物膜，阻礙了電子的傳遞。

在含5.0 mmol/L K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6]的0.1 mol/L KCl溶液中，采用交流阻抗法(EIS)進一步研究了不同修飾電極界面的電化學特性(圖4B)。圖中高頻率區(qū)半圓部分相當于有效電子轉(zhuǎn)移過程，其半圓直徑等于電子轉(zhuǎn)移阻抗(Ret)，低頻率區(qū)的直線部分代表擴散過程。由圖4B可見，裸玻碳電極的阻抗值為200 Ω(曲線a)，AuNPs修飾電極的阻抗為80 Ω(曲線b)，比裸玻碳電極的阻抗小很多；在電極上修飾GQDs后電極阻抗值為1 100 Ω(曲線c)，阻抗明顯增大，而同時修飾AuNPs和GQDs后電極阻抗值為125 Ω(曲線d)，說明二者的結(jié)合能夠促進電子的傳遞。印跡電極洗脫前的阻抗值為600 Ω(曲線e)，與GQDs-AuNPs/GCE相比，MIPs/GQDs-AuNPs/GCE的阻抗明顯增大，而印跡電極洗脫后阻抗值為240 Ω(曲線f)，其阻抗明顯減小。非印跡電極的阻抗值為1 500 Ω(曲線g)，要比印跡電極洗脫前的阻抗大很多，這表明4-ATP在電極表面形成了一層非常致密的非導電性聚合物膜。以上結(jié)果與循環(huán)伏安法的電流表征結(jié)果一致。

2.3 TC在不同電極上的電化學行為

已有研究顯示[21]，四環(huán)素在強酸和堿性介質(zhì)中的穩(wěn)定性較差，會迅速發(fā)生同分異構(gòu)轉(zhuǎn)變，而金納米粒子在酸性介質(zhì)中的氧化還原反應(yīng)會影響對四環(huán)素氧化峰位置的判斷，因此，本文采用循環(huán)伏安法在含10.0 mmol/L TC的磷酸鹽緩沖溶液(PBS，pH 7.0)中研究其在不同修飾電極上的電化學行為(圖5A)。結(jié)果顯示，在裸玻碳電極(曲線a)和AuNPs/GCE電極(曲線b)上未出現(xiàn)氧化峰，表明裸玻碳電極和AuNPs/GCE對TC無響應(yīng)；而在GQDs-AuNPs/GCE電極于1.12 V電位左右產(chǎn)生了一個較小的氧化峰(曲線c)，表明AuNPs與GQDs在電催化反應(yīng)中產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)，氧化了TC分子中10號位的酚羥基;在MIPs/GQDs-AuNPs/GCE電極上則于1.24 V產(chǎn)生了一個比較靈敏的氧化峰(曲線d)，這是由于分子印跡電極表面存在與TC相對應(yīng)的空穴，能夠特異性識別TC，促進其在電極表面的氧化反應(yīng);而對于非印跡電極(NIPs/GQDs-AuNPs/GCE)，因其表面存在致密的非導電性聚合物膜，抑制了電子的轉(zhuǎn)移，因此電流明顯降低且未出現(xiàn)任何氧化峰(曲線e)。由分子印跡電極(MIPs/GQDs-AuNPs/GCE)在0.1 mol/L PBS空白溶液和含有2.5 mmol/L TC的PBS溶液中的循環(huán)伏安曲線(圖5B)可見，分子印跡電極在空白溶液中于1.3 V附近未出現(xiàn)明顯的氧化峰，而在TC溶液中于1.3 V出現(xiàn)明顯的氧化峰，表明位于1.3 V的氧化峰確實是由TC的電化學氧化所產(chǎn)生。

圖5 不同電極(A)和MIPs/GQDs-AuNPs/GCE電極(B)在TC溶液中的循環(huán)伏安圖

TC的電化學氧化反應(yīng)機理如圖6所示[22]。在整個反應(yīng)過程中，一部分TC分子結(jié)構(gòu)中10號位上的酚羥基會先失去1個電子和1個質(zhì)子，變成不穩(wěn)定的自由基，而后在高陽極電位下，迅速失去另1個電子，變成較穩(wěn)定的醌式結(jié)構(gòu)。而另一部分TC則直接失去2個電子和1個質(zhì)子，變成穩(wěn)定的醌式結(jié)構(gòu)。

圖6 四環(huán)素的電化學氧化還原反應(yīng)機理圖

2.4 實驗條件的優(yōu)化

2.4.1 AuNPs負載量通過改變循環(huán)伏安掃描圈數(shù)來優(yōu)化電極表面AuNPs的修飾量。將裸玻碳電極置于含0.5 g/L HAuCl4的0.1 mol/L H2SO4溶液中，分別循環(huán)伏安掃描3、5、10、15、20、25圈，其余條件不變，制得不同AuNPs修飾量的分子印跡電極，于TC溶液中測定其氧化峰電流。結(jié)果顯示，隨著掃描次數(shù)的增加，TC氧化峰電流逐漸增大，當掃描圈數(shù)為15圈時，電流響應(yīng)值最大，此后氧化峰電流有所減小，因此本文選擇電沉積15圈為AuNPs最佳負載量。

2.4.2 GQDs修飾量石墨烯量子點具有較大的比表面積，可使分子印跡膜在電極表面形成更多的識別位點，本研究通過改變GQDs的修飾量(3、5、10、15、20、25、30、35、40 μL)來提高分子印跡傳感器的靈敏度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TC氧化峰電流隨GQDs修飾量的增大而增大，當GQDs修飾量為20 μL時，電流響應(yīng)值最大，之后電流值又逐漸降低。因此，本文選擇GQDs的最佳修飾量為20 μL。

2.4.3 分子印跡聚合物修飾量電極表面分子印跡膜的厚度會影響傳感器的靈敏度，實驗通過改變分子印跡膜電聚合的圈數(shù)(3、5、10、15、20、25圈)來優(yōu)化傳感器。結(jié)果顯示，隨著掃描圈數(shù)的增加，電流逐漸增大，當掃描圈數(shù)達到15圈時，TC氧化峰電流最大，之后電流又逐漸降低。表明當電聚合少于15圈時，分子印跡膜較薄，富集到印跡膜中的TC量較少，造成電流響應(yīng)不夠靈敏；而當電聚合圈數(shù)超過15圈后，分子印跡膜又過厚，TC在印跡膜中的傳輸阻力增大，既降低了傳感器對TC的響應(yīng)靈敏度，又增加了模板分子的洗脫難度。因此，本文選擇循環(huán)伏安掃描15圈為制備的電聚合分子印跡膜的最佳膜厚度。

2.4.4 模板分子化學洗脫時間將分子印跡電極浸泡到甲醇-乙酸(體積比9∶1)溶液中，考察不同攪拌洗脫時間(2、4、6、8、10、12、15 min)的影響。結(jié)果顯示，在分子印跡膜洗脫過程中，若洗脫時間過短會使洗脫掉的模板分子過少，從而增大分子印跡電極的空白電流；隨著洗脫時間的延長，傳感器對TC的響應(yīng)電流靈敏度相應(yīng)增大，當洗脫時間為8 min時，TC氧化峰電流最大，再進一步延長洗脫時間，峰電流不再增大，說明當洗脫時間達到8 min時，印跡膜中的模板分子已被完全洗脫。故本文選擇最佳模板洗脫時間為8 min。

圖7 MIPs/GQDs-AuNPs/GCE傳感器的LSV圖

2.5 工作曲線、重現(xiàn)性、穩(wěn)定性及選擇性

在最優(yōu)實驗條件下，采用線性掃描伏安法(LSV)考察了該分子印跡傳感器對TC的檢測性能。以含有不同濃度TC的0.1 mol/L磷酸鹽緩沖溶液(pH 7.0)為底液，在1.1～1.4 V電位范圍內(nèi)以50 mV/s的速率掃描(圖7)，結(jié)果顯示，隨著TC濃度的增加，其氧化峰電流逐漸增大。氧化峰電流值(Ip,μA)與TC濃度(c,μmol/L)在2.0×10-8～3.0×10-5mol/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，線性方程為Ip(μA)=2.981 0c(μmol/L)+25.485 3，相關(guān)系數(shù)(r)為0.999 4，檢出限為1.5×10-9mol/L(S/N=3)。將本文制備的分子印跡電化學傳感器與近些年相關(guān)文獻報道的TC檢測方法進行比較，發(fā)現(xiàn)本文制備的分子印跡傳感器線性范圍更寬，對TC的檢出限更低(表1)。

表1 不同方法檢測TC的比較

采用相同方法制備6支分子印跡電化學傳感器，在2.5 μmol/L TC的PBS溶液(pH 7.0)中分別記錄LSV曲線，測得6支傳感器對TC響應(yīng)峰電流的相對標準偏差(RSD)為3.5%，說明該分子印跡電化學傳感器具有良好的重現(xiàn)性。

將電極存放在冰箱中，于4 ℃環(huán)境下保存15 d后檢測5.0×10-6mol/L 四環(huán)素的氧化峰電流值為36.35 μA，保持了原初始電流的95.6%(初始電流38.02 μA)，表明該分子印跡傳感器具有較高的穩(wěn)定性。

選擇卡那霉素(KA)、氯霉素(CAP)、硫酸鏈霉素(ST)、硫酸新霉素(NE)以及與四環(huán)素具有相似結(jié)構(gòu)的土霉素(OTC)為干擾物質(zhì)來研究分子印跡電極的選擇性。將制備好的分子印跡電極分別置于含有1.0×10-6mol/L上述干擾物的0.1 mol/L PBS溶液(pH 7.0)中，采用線性掃描伏安法測定各物質(zhì)的氧化峰電流值，結(jié)果顯示，TC的峰電流值要遠大于其他各干擾物質(zhì)，表明該分子印跡電化學傳感器對四環(huán)素具有良好的選擇性。

2.6 實際樣品的檢測

采用本文制備的分子印跡傳感器檢測牛奶和河水中的四環(huán)素。取5.0 mL牛奶(市售某品牌)與10.0 mL無水乙醇混合超聲處理20 min，然后將混合物離心10 min，過濾后收集濾液，用超純水定容至30 mL，于4 ℃冰箱中保存。水樣采自于北京市豐臺區(qū)涼水河，過0.45 μm濾膜后保存。將印跡電極置于含樣品溶液的0.1 mol/L PBS溶液(pH 7.0)中，測定TC的電流響應(yīng)值。采用相同方法制備各樣品的加標溶液(牛奶加標濃度為0.02、0.04、0.07 μmol/L，河水加標濃度為1.0、2.0、3.0 μmol/L)進行回收率實驗，每個濃度平行測定3次，分別計算回收率和相對標準偏差(RSD)。結(jié)果在牛奶和河水樣品中均未檢出TC，3個不同濃度下TC的回收率為97.9%～106%，RSD為1.8%～4.7%。

3 結(jié) 論

本文基于金納米粒子和石墨烯量子點成功構(gòu)建了用于TC檢測的分子印跡電化學傳感器(MIPs/GQDs-AuNPs/GCE)，并將其應(yīng)用于實際樣品(牛奶和河水)的測定。由于AuNPs和GQDs具有導電性好、比表面積大、生物相容性好等優(yōu)異特性，在電催化反應(yīng)中產(chǎn)生的協(xié)同作用提高了傳感器的靈敏度，并提供了更多的TC分子識別位點。該方法選擇性和穩(wěn)定性好，線性范圍寬，操作簡便，成本低，對于食品和水環(huán)境中TC檢測具有良好的應(yīng)用前景。