氣調(diào)箱貯藏對鮮切黃瓜品質(zhì)的影響及對假單胞菌的抑制作用

魏亞博，鄭鄢燕，趙曉燕，馬越，張建，童軍茂*

1(新疆石河子大學 食品學院，新疆 石河子，832000)2(北京市農(nóng)林科學院蔬菜研究中心，北京市果蔬農(nóng)產(chǎn)品保鮮與加工重點實驗室，北京，100097)

我國是黃瓜的生產(chǎn)大國，約占世界黃瓜栽培面積的60%，規(guī)模和產(chǎn)量都位居世界第一。鮮切黃瓜食用方便，營養(yǎng)價值高，受到廣大消費者的喜愛。但鮮切黃瓜貨架期短，在低溫儲藏期間極易受微生物污染而引起腐敗變質(zhì)，這極大地限制了鮮切黃瓜的銷售范圍和銷售量。趙磊等[1]和MENG等[2]研究發(fā)現(xiàn)，鮮切黃瓜在4 ℃下最多可以貯藏6 d，6 d后微生物總數(shù)超標。目前，關于鮮切黃瓜的研究在國內(nèi)外已有較多報道，包括兩大方面：病原菌的檢測及防控和營養(yǎng)品質(zhì)的保持。SUN等[3]研究了常壓低溫等離子體對鮮切黃瓜中大腸桿菌的殺菌機理，SHARMA等[4]研究了噬菌體混合物對鮮切黃瓜中紐波特沙門菌存活率的影響，JOSHI等[5]和朱莉等[6]分別研究了電子束輻照和不同包裝材料對鮮切黃瓜品質(zhì)的影響。但關于腐敗微生物對鮮切黃瓜品質(zhì)的研究較少。

氣調(diào)保鮮包括氣調(diào)包裝(modified atmosphere packaging, MAP)和氣調(diào)貯藏(controlled atmosphere storage, CAS)。MAP是一種天然且非添加性的食品保鮮技術，廣泛用于鮮切產(chǎn)品貯藏保鮮，保持產(chǎn)品外觀，質(zhì)地，顏色，延長貨架期并抑制微生物的生長[7-8]。但是，由于采后果蔬仍存在呼吸和代謝活動，MAP中的氣體成分隨著貯藏期的延長而逐漸變化，O2濃度降低和CO2濃度增加，高濃度的CO2會導致醇、醛的積累，電解質(zhì)滲漏增加，從而對果蔬造成損害[9-10]。氣調(diào)貯藏能保持穩(wěn)定的低O2、高CO2和溫度、濕度的環(huán)境，抑制果蔬代謝活動，保持果蔬的營養(yǎng)和感官品質(zhì)，延緩果蔬腐爛。WAGHMARE等[11]研究表明，5%O2、10%CO2氣調(diào)包裝抑制了香菜中微生物的生長，維持了硬度和色澤，保持了感官品質(zhì)。SERRADILLA等[12]發(fā)現(xiàn)5% O2、10% CO2氣調(diào)包裝抑制了甜櫻桃中嗜冷菌、假單胞菌、酵母菌和霉菌等微生物的生長，延緩了由微生物引起的腐敗。HENRIQUE等[13]發(fā)現(xiàn)5% O2、20% CO2氣調(diào)箱貯藏可以保持芒果品質(zhì)超過30 d而不產(chǎn)生負面影響。但關于氣調(diào)箱貯藏對腐敗菌引起的品質(zhì)變化的研究較少。

變形假單胞菌(Pseudomonasplecoglossicida)在引起鮮切黃瓜腐敗變質(zhì)的微生物中占主導地位。關于變形假單胞菌對鮮切黃瓜品質(zhì)影響少有報道。本實驗采用3%O2、7%CO2氣調(diào)貯藏(先前實驗研究了不同氣調(diào)條件對鮮切黃瓜品質(zhì)的影響確定了最佳氣調(diào)貯藏條件，該氣調(diào)條件下鮮切黃瓜可貯藏至12 d)，研究其對變形假單胞菌增殖以及由變形假單胞菌導致的鮮切黃瓜細胞壁組成和結構變化的影響。研究可為鮮切果蔬企業(yè)的產(chǎn)品保鮮技術提供參考，為氣調(diào)貯藏在鮮切果蔬中的應用推廣提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 菌株、材料與試劑

變形假單胞菌(Pseudomonasplecoglossicida)，本實驗室保存。菌株分離自冷藏條件下腐爛的鮮切黃瓜。

黃瓜，購于北京當?shù)厥袌?。挑選具有相同的成熟度并去除畸形、腐爛、機械損傷的黃瓜。

三氯乙酸、硫代巴比妥酸等試劑，均為分析純；假單胞菌CFC(cephalothin-sodium fusidate cetrimide, CFC)選擇性培養(yǎng)基，青島海博生物技術有限公司；β-半乳糖苷酶(β-galactosidase, β-GAL)活性檢測試劑盒、纖維素酶(cellulase, CL)活性檢測試劑盒、原果膠含量檢測試劑盒、可溶性果膠含量檢測試劑盒，均購于北京索萊寶生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

A11基本型分析研磨機、T10基本型分散機，艾卡(廣州)儀器設備有限公司，IKA中國；GXH-3051便攜式CO2紅外線分析器，上海精密儀器儀表有限公司；UV-1800紫外分光光度儀，日本島津公司；CM-3700D臺式分光測色儀，日本柯尼卡-美能達公司；TA-XT Plus質(zhì)構儀，英國SMS公司；YS-XCAB/D602氣調(diào)保鮮試驗箱，杭州屺石科技有限公司；HITACHI SU-8010高分辨場發(fā)射掃描電鏡，日本日立高新技術公司。

1.3 樣品處理方法

1.3.1Pseudomonasplecoglossicida菌懸液制備

取凍存菌液100 μL，加至100 mL LB(luria-bertani)液體培養(yǎng)基中，220 r/min、28℃下培養(yǎng)24 h復活菌株，再取復活后的菌液100 μL加至100 mL LB液體培養(yǎng)基中，220 r/min、28℃下培養(yǎng)8 h，并調(diào)整濃度至10-8CFU/mL。

1.3.2 樣品及接種菌處理

黃瓜用流動水清洗干凈后，參考GB28233—2011次氯酸鈉發(fā)生器安全與衛(wèi)生標準，用含200 mg/L有效氯的次氯酸鈉溶液消毒2 min，減少黃瓜自身的微生物量，消毒后再用去離子水將殘余的消毒劑沖凈，晾干，在無菌臺上切成0.9 cm厚的薄片，放在保鮮盒中待接菌。

吸取100 μL、10-8CFU/mL菌懸液均勻接種至鮮切黃瓜片的一面。整個接種過程在無菌操作臺上進行。接種后的黃瓜片晾干15 min后貯藏。本實驗目的是研究氣調(diào)貯藏對變形假單胞菌及其導致的鮮切黃瓜細胞壁降解以及細胞壁降解引起的生理生化指標變化，因此處理組都接種了變形假單胞菌，處理分兩組,接菌空氣對照組(control, CK);接菌氣調(diào)貯藏組(control atmosphere storage, CAS), 3% O2, 7%CO2, 90%N2。在4℃，90%相對濕度下貯藏12 d，每2 d檢測相關指標。

1.4 指標測定

1.4.1 變形假單胞菌計數(shù)

取20 g樣品于30 mL 0.9%(質(zhì)量分數(shù))無菌鹽水溶液中，使用手持式打漿機打勻，然后9倍梯度稀釋到合適濃度，取最后2個稀釋梯度中100 μL液體進行平板涂布。用CFC選擇性瓊脂對變形假單胞菌計數(shù)。變形假單胞菌菌落總數(shù)以相對于接種時(0 d)的增加量表示。

1.4.2 掃描電鏡

在鮮切黃瓜接種面取樣，取出長、寬、厚度為0.5 cm × 0.2 cm × 0.1 cm的果肉，按1∶20完全浸入2.5%(質(zhì)量分數(shù))戊二醛中固定24 h，送至中國農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品加工所進行樣品后續(xù)處理和掃描電鏡觀察。

1.4.3 細胞壁降解酶和細胞壁成分測定

β-半乳糖苷酶活性、纖維素酶活性、原果膠含量和可溶性果膠含量，均采用試劑盒檢測。

1.4.4 色度

鮮切黃瓜片色度使用臺式色差儀測量，結果表示為L*(亮度)、a*(紅、綠色)、b*(黃、藍色)和ΔE值。

1.4.5 理化指標測定

鮮切黃瓜片硬度采用裝有5 mm探頭的質(zhì)構儀測定。硬度表示為探頭以10 mm/s的速度刺穿至5 mm深度所需的最大力。

相對電導率的測定參考NASEF[14]的方法，使用無菌不銹鋼穿孔器(直徑1.0 cm)從黃瓜片上切下1 g樣品，置于裝有50 mL去離子水的100 mL錐形燒瓶中，封口后在30℃下振蕩2 h，然后用電導率儀測量電導率值(R1)；將樣品加熱煮沸10 min，冷卻至室溫后測量電導率值(R2)。相對電導率按公式(11)計算：

(1)

丙二醛(malondialdehyde, MDA)測定采用錢磊等[15]方法，略作改動。稱取3 g樣品，加3 mL磷酸鹽緩沖液冰浴研磨，研磨后轉入10 mL離心管中，并用1 mL磷酸鹽緩沖液沖洗研缽，一并轉入離心管中，用分散機充分勻漿，再加入2 mL磷酸鹽緩沖液，4℃，13 000×g離心20 min。取1.5 mL上清液加入2.5 mL 0.5%(質(zhì)量分數(shù))硫代巴比妥酸溶液，沸水浴15 min，取出冷卻至室溫后，4℃，8 000×g離心10 min，取上清液，在450、532和600 nm波長下測定吸光值MDA計算如公式(2)所示：

(2)

式中：A450、A532和A600分別是450、532和600 nm處上清液的吸光度；V反是反應液體積；M是所測樣品質(zhì)量；V提是提取液體積；MDA含量，nmol/g。

1.5 數(shù)據(jù)分析

實驗設計為完全隨機設計。采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，組間均值比較使用單因素方差分析(one-way ANOVA)，數(shù)據(jù)表示為平均值±標準差，實驗重復3次，P<0.05表示差異具有顯著性。

2 結果與分析

2.1 變形假單胞菌在貯藏期間的生長變化

如圖1所示，氣調(diào)貯藏抑制了鮮切黃瓜中變形假單胞菌的生長。在2和4 d時，CAS處理組中變形假單胞菌出現(xiàn)了負增長，說明氣調(diào)貯藏對腐敗菌有抑制作用；而對照組中變形假單胞菌的增長顯著高于CAS處理組。隨著貯藏時間的延長，兩個處理組中的變形假單胞菌都出現(xiàn)了不同程度的增加，對照組在第6天比第2天增加了1.46 lg CFU/g，而CAS處理組僅增加了0.48 lg CFU/g。在貯藏至第12天時，對照組和CAS處理組分別增加了2.77 lgCFU/g和2.29 lgCFU/g。在貯藏期間由于變形假單胞菌的生長，導致對照組鮮切黃瓜在貯藏至第6天時，表面明顯出現(xiàn)了變形假單胞菌菌落，但主要分布在鮮切黃瓜片的中心位置，在貯藏結束時(第12天)，鮮切黃瓜表面長滿了變形假單胞菌，并且產(chǎn)生了異味；而CAS處理組在整個貯藏期間都沒有出現(xiàn)明顯的菌落生長，有效地保持了鮮切黃瓜的外觀，僅在第12天時表面變暗?？傮w來說，在整個貯藏期間CAS處理對鮮切黃瓜中的變形假單胞菌的生長都有抑制作用。

圖1 CAS對變形假單胞菌生長的影響Fig.1 Effect of CAS on the growth of Pseudomonas plecoglossicida

2.2 接種變形假單胞菌后鮮切黃瓜細胞微觀結構的變化

如圖2-a所示，在第0天接種變形假單胞菌時，變形假單胞菌并沒有立即進入到鮮切黃瓜的組織細胞中，并且此時的細胞結構完整。在氣調(diào)貯藏至12 d時(圖2-b)，在鮮切黃瓜細胞內(nèi)部發(fā)現(xiàn)了少量變形假單胞菌，細胞的結構仍較為完整，沒有明顯的損傷。但對照組貯藏至12 d時(圖2-c)，鮮切黃瓜組織細胞內(nèi)長滿變形假單胞菌，細胞壁損害嚴重，無法分清相鄰的細胞，組織完全塌陷。

a-0 d接種；b-12 d氣調(diào)組；c-12 d CK組圖2 CAS對接種變形假單胞菌的鮮切黃瓜細胞微觀結構的影響Fig.2 Effect of CAS on the microstructure of fresh-cut cucumber cells inoculated with Pseudomonas plecoglossicida

2.3 接種變形假單胞菌后鮮切黃瓜細胞壁降解酶和細胞壁成分的變化

如圖3-a所示，β-半乳糖苷酶活性在貯藏期間不斷增加。與對照組相比，CAS處理顯著地抑制了鮮切黃瓜中β-半乳糖苷酶活性的增加。第6天和等12天時，CAS處理組中的β-半乳糖苷酶活性僅為對照組的72.69%和65.57%。

纖維素酶活性在貯藏期前4 d快速降低，隨后稍有增加，但均低于第0天(圖3-b)。在貯藏期內(nèi)，對照組的纖維素酶活性顯著高于CAS處理組，10 d和12 d時，對照組纖維素酶活是CAS處理組的1.95和3.18倍。

如圖3-c所示，隨著貯藏天數(shù)的增加，2個處理組中的原果膠含量都不斷下降，CAS處理延緩了原果膠含量的下降。貯藏結束時，與0 d相比，對照組和CAS處理組中原果膠含量分別下降了78.5%和67.87%。

鮮切黃瓜中可溶性果膠含量與原果膠含量的變化趨勢相反，在貯藏期內(nèi)不斷上升(圖3-d)。對照組在貯藏期間可溶性果膠含量始終高于CAS處理組。對照組在0～6 d增加較為緩慢，6 d后，對照組中可溶性果膠含量迅速增加，到貯藏結束時比0 d增加了0.74 μmol/g FW；CAS處理組可溶性果膠含量在前10 d都緩慢增加，在第12天時增加稍快，貯藏結束時與0 d相比，僅增加了0.36 μmol/g FW。

2.4 接種變形假單胞菌后鮮切黃瓜色澤的變化

如圖4-a所示，貯藏期間鮮切黃瓜的亮度不斷下降。對照組在貯藏后期快速下降，在貯藏前期的變化較為平穩(wěn)，與0 d相比，12 d時對照組亮度降低了10.3%。而CAS處理組在12 d內(nèi)的下降趨勢都較為緩慢，在貯藏結束時，CAS處理組僅比0 d時的亮度值下降了3.1%。

由圖4-b可知，貯藏期內(nèi)2個處理條件下的a*值呈增加趨勢。CAS處理組a*值緩慢增加，保持了鮮切黃瓜的綠度。對照組中的a*值在0～4 d和6～10 d增加緩慢，在4～6 d和10～12 d增加較快。在貯藏結束時與0 d相比，CAS處理組和對照組a*值分別下降了36.08%、117.19%。

由圖4-c可知對照組b*值呈波動式增加。從4～6 d增加最快，增加了11.56%。CAS處理組在10～12 d增加較快，增加了5.49%。貯藏期內(nèi)，CAS處理組b值均低于對照組。

如圖4-d所示，鮮切黃瓜的總色差值隨貯藏時間的增加而上升。貯藏期間對照組中總色差迅速增加，第12天時的總色差值比第0天增加了13.25；CAS處理組總色差值的增加較為緩慢，第12天時的總色差值比第0天增加了4.48。

a-β-GAL；b-CL活性；c-原果膠含量；d-可溶性果膠含量圖3 CAS對接種變形假單胞菌的鮮切黃瓜細胞壁降解酶和細胞壁成分的影響Fig.3 Effect of CAS on cell wall degrading enzyme and cell wall components of fresh-cut cucumber inoculated withPseudomonas plecoglossicida

a-L*；b-a*；c-b*；d-ΔE圖4 CAS對接種變形假單胞菌的鮮切黃瓜色澤的影響Fig.4 Effect of CAS on the color of fresh-cut cucumber inoculated with Pseudomonas plecoglossicida

2.5 接種變形假單胞菌后鮮切黃瓜理化品質(zhì)的變化

由圖5-a可知鮮切黃瓜的硬度不斷降低。在整個貯藏期內(nèi)，CAS處理組硬度均高于對照組。貯藏后期對照組硬度下降較快。貯藏結束時，CAS處理組硬度是對照組的1.06倍。

貯藏期間，鮮切黃瓜的相對電導率和MDA含量的變化趨勢相似，均不斷增加(圖5-b和圖5-c)。與對照組相比，CAS處理顯著抑制了相對電導率的增加。對照組相對電導率在前6 d增加相對較慢，6 d后迅速增加；CAS處理組中相對電導率在前8 d緩慢增加，在8～12 d增加較快。貯藏結束時，對照組相對電導率是CAS處理組的1.08倍。在整個貯藏期間，對照組MDA含量迅速增加，而CAS處理組中MDA含量緩慢增加；在貯藏結束時，對照組MDA含量從0 d的0.12 nmol/g增加到了0.26 nmol/g，增加了116.67%，CAS處理組MDA含量從0 d的0.12 nmol/g增加到了0.19 nmol/g，僅增加了58.33%。

3 結論

鮮切黃瓜由于機械損傷導致自身的防衛(wèi)能力下降，易受微生物侵染而引起腐敗變質(zhì)。研究鮮切黃瓜冷藏期間腐敗菌的氣調(diào)防控具有重要意義。CAS處理顯著抑制了變形假單胞菌的生長速率以及變形桿

a-硬度；b-相對電導率；c-MDA圖5 CAS對接種變形假單胞菌的鮮切黃瓜硬度、相對電導率和MDA的影響Fig.5 Effect of CAS on firmness, relative conductivity and MDA of fresh-cut cucumber inoculated with Pseudomonas plecoglossicida

菌導致的黃瓜細胞結構的降解。掃描電鏡結果顯示，12 d時，對照組的組織細胞中長滿變形假單胞菌，組織結構受損嚴重，完全塌陷，而CAS處理組細胞壁較為完整，只是略有松散。ANASTASIA等[16]發(fā)現(xiàn)5% O2和15%CO2的氣調(diào)包裝可以有效地抑制鮮切沙拉中乳酸菌和假單胞菌的生長。PAN等[17]研究發(fā)現(xiàn)4%O2和5%CO2的氣調(diào)包裝下鮮切菠蘿中好氧菌比對照組低2 lg CFU/g。劉程慧[18]用掃描電鏡觀察腐敗霉菌侵染鮮切蘋果的過程發(fā)現(xiàn)侵入后蘋果組織細胞結構完全瓦解、腐爛。由此可見，氣調(diào)處理可抑制微生物生長及微生物導致的組織結構的破壞。

色澤和外觀直接影響鮮切果蔬產(chǎn)品的接受度和商品價值[19]。貯藏至6 d時，對照組表面由于變形假單胞菌的生長色澤明顯發(fā)生變化，12 d時表面變黃且失去光澤。氣調(diào)貯藏延緩了鮮切黃瓜中L＊值的下降、以及a＊、b＊和ΔE值的增加，維持了鮮切黃瓜的色澤和外觀。SHEN等[20]在鮮切土豆中的研究發(fā)現(xiàn)，4%O2和10%CO2的氣調(diào)包裝抑制了微生物生長，從而維持了色澤。WAGHMARE等[21]研究表明，4%O2和10%CO2的氣調(diào)包裝對鮮切瓜兒豆的色澤影響最小。MASHABELA等[22]研究表明，0.38%O2和28.53%CO2的氣調(diào)包裝可以減少貯藏期間鮮切花椰菜的顏色變化，保持較低的ΔE值，具有較高的商品接受度。

細胞壁的完整性與果蔬品質(zhì)密切相關。微生物會產(chǎn)生胞外纖維素酶、β-半乳糖苷酶等細胞壁降解酶，降解纖維素、含半乳糖苷的胞壁多糖，還會促使原果膠轉變?yōu)榭扇苄怨z，從而使組織軟化、塌陷，進一步促進微生物侵入細胞內(nèi)并利用細胞內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)快速增殖，最終導致果蔬腐爛[23-25]。CAS處理抑制了纖維素酶和β-半乳糖苷酶活性的增加，延緩了原果膠的降解和可溶性果膠含量的增加，這可能是因為氣調(diào)貯藏抑制了微生物的生長，減少了細胞壁降解酶的產(chǎn)生，保持了細胞壁的完整性。由于氣調(diào)貯藏保持了細胞壁成分，從而延緩了硬度的下降，抑制了相對電導率和MDA含量的增加速率。FAN等[26]發(fā)現(xiàn)氣調(diào)包裝抑制了鮮切黃瓜中微生物的生長并保持了細胞壁的完整。LI等[27]研究發(fā)現(xiàn)氣調(diào)貯藏抑制了梨中細胞壁降解酶酶活，維持了硬度。

綜上，CAS處理顯著抑制了變形假單胞菌的生長，維持了細胞壁完整性，降低了纖維素酶活性、抑制了β-半乳糖苷酶活性的增加和可溶性果膠的產(chǎn)生，并延緩了原果膠的降解，從而保持了鮮切黃瓜的硬度，抑制了MDA的產(chǎn)生和相對電導率的增加，同時維持了鮮切黃瓜的外觀和色澤。可見，CAS處理通過抑制腐敗微生物的生長以及微生物導致的細胞壁降解從而保持鮮切黃瓜的品質(zhì)。實驗結果可以為鮮切黃瓜的貯藏保鮮提供參考。