三氧化硫吡啶法酯化修飾海參巖藻聚糖硫酸酯的研究

王瑞芳,陳發(fā)河,吳光斌,謝遠(yuǎn)紅

(集美大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，福建省食品微生物與酶工程重點實驗室，福建 廈門， 361021)

海地瓜是我國大宗低值海參品種，雖食用品質(zhì)較差，但營養(yǎng)價值與刺參、梅花參等高品質(zhì)海參相似，生理活性物質(zhì)含量豐富[1]。目前海參加工產(chǎn)業(yè)增長速度雖快，但發(fā)展水平低，低值海參資源利用不充分、精深加工產(chǎn)品較少。對低值海參活性物質(zhì)的深入研究，是充分利用海參資源、實現(xiàn)海參精深加工的關(guān)鍵科學(xué)問題。海參巖藻聚糖硫酸酯 (acaudina fucoidan，AFuc)是海地瓜體壁主要活性物質(zhì)之一，具有抗輻射、增強免疫、抗氧化、增殖巨噬細(xì)胞等多種功能[2-4]。AFuc是一類主要由巖藻糖及硫酸基團組成的多糖，單糖組成及硫酸基團含量的不同會導(dǎo)致其抗凝血活性有較大差異[5]。張殉等[6]研究發(fā)現(xiàn)冰島刺參AFuc的硫酸酯化程度比海地瓜AFuc稍高一些，冰島刺參AFuc抑制腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的作用也優(yōu)于海地瓜AFuc，由此推測AFuc的抗腫瘤作用可能與高硫酸酯化程度有關(guān)。朱玉婕等[7]研究發(fā)現(xiàn)AFuc改善胰島素抵抗的效果與硫酸酯化位點、支鏈結(jié)構(gòu)等分子特征密切相關(guān)，硫酸酯化位點多且無支鏈的AFuc的改善效果顯著。多糖的硫酸酯化修飾可提高其水溶性、增強負(fù)電荷、改變多糖的空間立體結(jié)構(gòu)，從而使其生物學(xué)活性明顯改變[8-9]。選擇適宜的硫酸酯化劑對AFuc進(jìn)行酯化處理以增強其生理活性，成為提高海地瓜AFuc物質(zhì)經(jīng)濟價值、促進(jìn)低值海參資源高值化利用的有效途徑。

目前人們對不含硫酸基的多糖的酯化修飾做了大量研究工作[10-11]，而對含硫酸基的多糖的酯化修飾研究鮮見報道。海地瓜AFuc雖結(jié)構(gòu)本身含硫酸基團，但硫酸酯化反應(yīng)不僅增加硫酸基的含量，也可改變多糖分子結(jié)構(gòu)，從而提高原有的生物活性，甚至增加新的功能[12]。故AFuc的硫酸酯化研究可為揭示AFuc的構(gòu)效關(guān)系、研發(fā)高活性AFuc產(chǎn)品提供理論指導(dǎo)，進(jìn)而拓寬其產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用范圍。目前多糖硫酸酯化常用的酯化劑有氯磺酸、濃硫酸和三氧化硫吡啶復(fù)合物，通過酯化可使單糖殘基上的羥基連接上硫酸基團[13-14]。氯磺酸法操作困難、反應(yīng)劇烈、危險性大，濃硫酸法易導(dǎo)致多糖碳化，三氧化硫吡啶復(fù)合物法反應(yīng)溫和、易于操作，且效果較好。硫酸酯化常用的溶劑有N,N- 二甲基甲酰胺(DMF)、吡啶和二甲基亞砜(DMSO)，但有研究發(fā)現(xiàn)DMSO不適宜用作多糖硫酸酯化溶劑[15]。本文擬以海地瓜AFuc為原料，采用三氧化硫吡啶復(fù)合物法對其進(jìn)行硫酸酯化，以硫酸基取代度為指標(biāo)設(shè)計正交試驗，確定DMF和吡啶兩種不同溶劑下的最佳酯化工藝參數(shù)，并對酯化產(chǎn)品進(jìn)行紅外光譜分析和抗氧化活性的測定。

1 材料與方法

1.1 試劑材料

AFuc粗品(純度為56.12%，硫酸基取代度為0.83)，為本實驗室自制[16]；N,N-二甲基甲酰胺、吡啶、三氧化硫吡啶復(fù)合物(C5H5N·SO3)、明膠、NaOH、K2SO4、乙醇等試劑，均為分析純。

1.2 儀器設(shè)備

WCT-200型磁力加熱攪拌器，常州國華電器有限公司；RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；KDC-1044型低速離心機，科大創(chuàng)新股份有限公司；FT/IR-480型傅里葉紅外光譜儀，日本島津公司；Cary50型紫外可見分光光度計，美國Varian公司；JDG-0.2B型真空冷凍干燥機，蘭州科近真空凍干技術(shù)有限公司。

1.3 海參巖藻聚糖硫酸酯的酯化

1.3.1 三氧化硫吡啶復(fù)合物/N,N-二甲基甲酰胺法(C5H5N·SO3/DMF法)

將15 mL吡啶加入錐形瓶中，磁力攪拌下加入一定量的C5H5N·SO3，熱水浴加熱至反應(yīng)溫度，再加入AFuc產(chǎn)品0.2 g，保溫反應(yīng)。反應(yīng)完畢后冷卻至室溫，用2 mol/L的NaOH溶液調(diào)至中性，蒸餾水透析72 h，旋蒸濃縮10倍后加入3倍體積95%的乙醇，4 ℃下靜置過夜，收集沉淀冷凍干燥，得硫酸酯化海參巖藻聚糖硫酸酯(sulfated acaudina fucoidan，SAFuc)產(chǎn)品。

在單因素試驗基礎(chǔ)上，選定反應(yīng)溫度、酯化劑用量、反應(yīng)時間3個參數(shù)為影響因素，每個因素取3個水平，設(shè)計正交試驗L9(33)。

1.3.2 三氧化硫吡啶復(fù)合物/吡啶法(C5H5N·SO3/C5H5N法)

將15 mL吡啶加入錐形瓶中，磁力攪拌下加入一定量的C5H5N·SO3，熱水浴加熱至反應(yīng)溫度，再加入AFuc產(chǎn)品0.2 g，保溫反應(yīng)。反應(yīng)完畢后冷卻至室溫，用2 mol/L的NaOH溶液調(diào)至中性，蒸餾水透析72 h，旋蒸濃縮10倍后加入3倍體積95%的乙醇，4 ℃下靜置過夜，收集沉淀冷凍干燥，得SAFuc產(chǎn)品。

在單因素試驗基礎(chǔ)上，選定反應(yīng)溫度、酯化劑用量、反應(yīng)時間3個參數(shù)為影響因素，每個因素取3個水平，設(shè)計正交試驗L9(33)。

1.4 產(chǎn)品分析鑒定

采用明膠-比濁法[17-18]測定硫酸基的質(zhì)量百分?jǐn)?shù)S%，然后按公式(1)計算硫酸基取代度(degree of substitution，DS)。

(1)

紅外光譜分析：稱取1 mg干燥產(chǎn)品與適量溴化鉀成均勻粉末，然后用壓片機壓片，形成透明薄片，在500～4 000cm-1進(jìn)行紅外掃描，測定其紅外光譜圖。

1.5 產(chǎn)品抗氧化活性的測定

DPPH體系法[18-19]測定清除1,1-二苯基-苦肼基自由基(DPPH·)的能力；

Fenton反應(yīng)體系法[20-21]測定清除羥基自由基(·OH)的能力。

2 結(jié)果與分析

2.1 C5H5N·SO3/DMF法反應(yīng)結(jié)果

2.1.1 單因素試驗結(jié)果

C5H5N·SO3在DMF中的溶解性較好，常溫下可溶解，反應(yīng)過程可常溫操作?？疾炝薉MF為溶劑時反應(yīng)溫度、酯化劑用量、反應(yīng)時間對硫酸酯化效果的影響，結(jié)果如圖1所示。

A-反應(yīng)溫度；B-CSH5N·SO3用量；c-反應(yīng)時間圖1 DMF為溶劑時反應(yīng)溫度(A)、C5H5N·SO3用量(B)和反應(yīng)時間(C)對產(chǎn)物取代度的影響 Fig.1 Effects of reaction temperature, C5H5N·SO3 dosage and time on DS of DMF as solvent

圖1-A顯示，溫度低于50 ℃時，隨著反應(yīng)溫度的增加，產(chǎn)物取代度逐漸升高；60 ℃時，取代度略有下降。在一定溫度范圍內(nèi)，隨反應(yīng)溫度的上升，分子運動加快，取代反應(yīng)的幾率增加。但溫度過高也會導(dǎo)致多糖的降解及結(jié)構(gòu)的破壞，所以取代度先上升后下降；圖1-B表明，30 ℃下反應(yīng)1 h，取代度隨著酯化劑用量的增加而上升，說明隨著硫酸鹽濃度的升高，硫酸基團和多糖間的結(jié)合逐漸增多[22]，故酯化劑用量越高越利于酯化反應(yīng)的進(jìn)行，但酯化劑用量越高成本越高；圖1-C顯示，反應(yīng)溫度30 ℃下，在2 h內(nèi)取代度隨反應(yīng)時間的增加而增加，超過2 h取代度呈下降趨勢，過長的反應(yīng)時間不利于酯化，這說明過長的反應(yīng)時間會導(dǎo)致多糖的降解及結(jié)構(gòu)的破壞。同時酯化時間過長也會增加經(jīng)濟成本，故反應(yīng)時間以2 h為宜。

2.1.2 正交試驗結(jié)果

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用正交試驗法確定C5H5N·SO3/DMF法的最適條件，各因素水平及實驗結(jié)果列于表1。

由表1可以看出，運用C5H5N·SO3/DMF法進(jìn)行AFuc的酯化修飾，影響酯化反應(yīng)因素的主次順序為B>A>C，即酯化劑用量對酯化度影響最大，其次是反應(yīng)溫度和反應(yīng)時間。最佳工藝組合為A1B3C3，即反應(yīng)溫度為40 ℃、酯化劑用量1.2 g、反應(yīng)時間為3 h時酯化效果最好，產(chǎn)品取代度可達(dá)15.63(該產(chǎn)品編號為SAFuc-1)。為進(jìn)一步考察優(yōu)化工藝的可靠性和穩(wěn)定性，稱取3批各0.2 g AFuc產(chǎn)品按上述最佳工藝條件進(jìn)行驗證試驗，結(jié)果產(chǎn)品取代度為14.87±1.13，說明該工藝條件下，產(chǎn)品取代度較高。驗證試驗結(jié)果表明，該優(yōu)選工藝穩(wěn)定可靠。

表1 DMF為溶劑時正交試驗設(shè)計及結(jié)果Table 1 Orthogonal experiment design and results of DMF as solvent

2.2 C5H5N·SO3/C5H5N法酯化反應(yīng)結(jié)果

2.2.1 單因素試驗結(jié)果

C5H5N·SO3在吡啶中溶解性較差，常溫下酯化劑不溶解，必須加熱至60 ℃才可溶解。同樣考察了吡啶為溶劑時反應(yīng)溫度、酯化劑用量、反應(yīng)時間對硫酸酯化效果的影響，結(jié)果如圖2所示。

A-反應(yīng)溫度；B-C5H5N·SO3用量；C-反應(yīng)時間圖2 吡啶為溶劑時反應(yīng)溫度、C5H5N·SO3用量和反應(yīng)時間對產(chǎn)物取代度的影響Fig.2 Effects of reaction temperature, C5H5N·SO3 dosage and time on the degree of substitution of pyridine as solvent

圖2-A顯示，隨溫度的上升，取代度逐漸增加，高溫利于酯化?？赡茉蛟谟?，隨反應(yīng)溫度的上升，C5H5N·SO3在吡啶中的溶解性越好，分子運動也越快，更利于取代反應(yīng)；圖2-B顯示，90 ℃下反應(yīng)1 h，取代度隨著酯化劑用量的增加而顯著增加，同樣是因為隨著硫酸鹽濃度的升高，硫酸基團和多糖間的結(jié)合逐漸增多從而使取代度增大，但高溫條件下，酯化劑用量過高也會使多糖結(jié)構(gòu)發(fā)生破壞[22]。圖2-C表明，反應(yīng)溫度90 ℃下，隨著反應(yīng)時間的增加，硫酸基取代度先升高后有所下降。在3 h內(nèi)，酯化時間增加，有助于酯化反應(yīng)的進(jìn)行；但在高溫條件下，酯化時間過長，也會引起多糖的部分降解，導(dǎo)致取代度有所下降。

2.2.2 正交試驗結(jié)果

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用正交試驗法確定C5H5N·SO3/C5H5N法的最適條件，各因素水平及實驗結(jié)果列于表2。

表2 吡啶為溶劑時正交試驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Orthogonal experiment design and results of Py as solvent

表2顯示，運用C5H5N·SO3/C5H5N法進(jìn)行AFuc的酯化修飾，影響酯化反應(yīng)因素的主次順序為B>A>C，即酯化劑用量對酯化度影響最大，其次是反應(yīng)溫度和反應(yīng)時間。最佳工藝組合為A3B3C2，即反應(yīng)溫度為90 ℃、酯化劑用量1.2 g、反應(yīng)時間為3 h時酯化效果最好，產(chǎn)品取代度可達(dá)13.31(該產(chǎn)品編號為SAFuc-2)。為進(jìn)一步考察優(yōu)化工藝的可靠性和穩(wěn)定性，稱取3批各0.2 g AFuc產(chǎn)品按上述最佳工藝條件進(jìn)行驗證試驗，結(jié)果產(chǎn)品取代度為13.11±1.25，說明該工藝條件明顯優(yōu)于正交試驗的其他組。驗證試驗結(jié)果表明，該優(yōu)化工藝也是穩(wěn)定可靠的。

2.3 紅外光譜分析

圖3 AFuc、SAFuc-1及SAFuc-2的紅外光譜圖Fig.3 Infrared spectra of AFuc, SAFuc-1 and SAFuc-2

2.4 AFuc和SAFuc的抗氧化活性

測定質(zhì)量濃度為2 mg/mL的AFuc和SAFuc溶液對DPPH·及·OH的清除效果，結(jié)果如圖4所示。圖4顯示AFuc、SAFuc-1及SAFuc-2溶液對DPPH·的清除效果高于·OH； AFuc酯化修飾后對DPPH·和·OH的清除效果均顯著增強，且SAFuc-1(取代度15.63)對DPPH·和·OH的清除效果均優(yōu)于SAFuc-2(取代度13.31)，說明硫酸基團的增加利于AFuc抗氧化活性的提高。該結(jié)論與不含硫酸基的多糖(如魚腥草多糖[25]、懷山藥多糖[26]等)硫酸酯化修飾后抗氧化活性測定結(jié)果一致。謝明勇等[27]分析了硫酸酯化改變抗氧化活性的原因在于：硫酸基團的引入使得多糖的構(gòu)象變得更為伸展，改變了多糖在溶液中的構(gòu)象，從而利于其活性的表達(dá)。與氯磺酸吡啶法相比，C5H5N·SO3為酯化劑所得產(chǎn)品的硫酸基含量雖低，但抗氧化活性卻更高[17-18]，可能原因在于：酯化反應(yīng)條件不同，對多糖空間構(gòu)象的改變影響不同。

圖4 AFuc、SAFuc-1及SAFuc-2對DPPH·和·OH的清除效果Fig.4 Scavenging effect on DPPH· and ·OH of AFuc,SAFuc-1 and SAFuc-2

3 結(jié)論

采用C5H5N·SO3為酯化劑可有效對AFuc進(jìn)行酯化改性，且在DMF和吡啶兩種不同溶劑下，影響酯化效果的諸因素主次順序均為：酯化劑用量影響最大，其次是反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間。DMF為溶劑時最佳酯化工藝條件為：反應(yīng)溫度為40 ℃、酯化劑用量1.2 g、反應(yīng)時間為3 h，硫酸基的取代度由0.83提高至15.63；吡啶為溶劑時最佳酯化工藝條件為：反應(yīng)溫度為90 ℃、酯化劑用量1.2 g、反應(yīng)時間為3 h，產(chǎn)品取代度提高至13.31。紅外光譜檢測表明，SAFuc在硫酸酯處的特征吸收峰明顯加強；抗氧化活性測定顯示，酯化反應(yīng)后，產(chǎn)品抗氧化活性提高?？傮w而言，DMF為溶劑時，酯化反應(yīng)條件溫和、硫酸基取代度較高，且產(chǎn)品抗氧化活性更優(yōu)，故C5H5N·SO3/DMF法更適于AFuc的酯化反應(yīng)，是一種很有應(yīng)用前景的硫酸酯化多糖的方法。本試驗為低值海參的高值化開發(fā)應(yīng)用提供了科學(xué)依據(jù)，為豐富多糖構(gòu)效關(guān)系、拓寬多糖的應(yīng)用領(lǐng)域研究提供了理論基礎(chǔ)。