遵義地區(qū)莽椒細菌多樣性及PICRUSt基因功能預(yù)測分析

崔夢君，王玉榮，葛東穎，張振東，劉欣，郭壯

(湖北文理學(xué)院 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，鄂西北傳統(tǒng)發(fā)酵食品研究所，湖北 襄陽,441053)

作為我國華中和西南地區(qū)特色傳統(tǒng)發(fā)酵食品之一，莽椒(又稱莽海椒)的制作工藝相對粗放，通常將秈米和糯米按照一定的比例混合搗碎成粉，塞入切開去瓤的紅辣椒中入壇密封發(fā)酵一個星期即可。莽椒的制作環(huán)境相對開放且加工過程中無殺菌等工藝操作，這使得原料、加工器具和環(huán)境中的微生物得以保留，莽椒的制作方式為厭氧方法，為乳酸菌等厭氧細菌的生長提供了良好的條件。由此可見，莽椒的品質(zhì)形成與自然微生物的發(fā)酵密不可分，但是目前關(guān)于莽椒微生物多樣性的研究報道尚少。

與莽椒制作工藝相同，鲊廣椒亦是以秈米和辣椒為主要原料密封發(fā)酵而成，兩者不同點在于鲊廣椒制作工程中通常將辣椒切碎后與秈米混合發(fā)酵[1]。近年來，以Illumina MiSeq為代表的第二代高通量測序技術(shù)廣泛的應(yīng)用于傳統(tǒng)發(fā)酵食品微生物多樣性的解析中[2-3]，在快速和準確解析發(fā)酵基質(zhì)微生物多樣性的同時，實現(xiàn)了多樣本的平行比較[4-5]。采用該技術(shù)，王玉榮發(fā)現(xiàn)Lactobacillus為湖北省當陽地區(qū)鲊廣椒中的優(yōu)勢細菌[6]。相同的發(fā)酵基質(zhì)，略有差異的制作工藝，莽椒和鲊廣椒中微生物群系是否亦存在差異是值得探討的問題。

本研究從貴州省遵義地區(qū)采集了7 個莽椒樣品，使用Illumina MiSeq測序技術(shù)對其細菌多樣性進行了解析，同時從MG-RAST數(shù)據(jù)庫下載了8 個采集自湖北省當陽地區(qū)鲊廣椒樣品的測序數(shù)據(jù)[6]進行比較研究，并采用PICRUSt和BugBase軟件對兩者細菌種群的基因功能和表型進行了預(yù)測。通過本研究的開展以期為后續(xù)莽椒品質(zhì)改善和安全性提升提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

莽椒樣本采集自貴州省遵義市協(xié)臺壩菜市場和松桃菜市場(106°94′E，27°70′N)，共采集7 個，編號依次為MJ1～MJ7。

QIAGEN DNeasy mericon Food Kit DNA基因組提取試劑盒，德國QIAGEN公司；MRS培養(yǎng)基、石蕊牛乳培養(yǎng)基和LB培養(yǎng)基，青島海博生物技術(shù)有限公司；5×TransStartTM FastPfu 緩沖液、FastPfu Fly DNA Polymerase和dNTPs Mix，北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DG250型厭氧工作站，英國Don Whitley公司；CR21N型高速離心機，日本日立金屬株式會社；vetiri梯度基因擴增儀，美國AB公司；Illumina MiSeq高通量測序平臺，美國Illumina公司；ND-2000C微量紫外分光光度計，美國Nano Drop公司；R920機架式服務(wù)器：美國Dell公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 乳酸菌的分離鑒定

使用無菌手術(shù)剪將莽椒樣品剪碎，取10 g加入100 mL石蕊牛乳培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)36 h[7]。采用倍比稀釋法將培養(yǎng)物稀釋至10-3～10-6梯度后涂布于MRS培養(yǎng)基(含有1.0%(質(zhì)量分數(shù))CaCO3)中，37 ℃厭氧培養(yǎng)48 h[8]。從菌落數(shù)為30～300的平皿中挑選含有透明圈且形態(tài)不同的菌落純化3 次后，將過氧化氫酶實驗陰性、革蘭氏染色陽性的菌株暫定為疑似乳酸菌菌株。參照文獻[8]中方法，采用CTAB法對疑似乳酸菌菌株的DNA進行提取，并對其16S rRNA全序列進行擴增。對瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后的擴增產(chǎn)物進行清潔，并將其連接到T載體后轉(zhuǎn)化至Escherichiacolitop10 中，陽性克隆子寄往測序公司進行測序，反饋回的序列拼接后在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行比對并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.2 宏基因組DNA提取和Illumina MiSeq測序

使用QIAGEN DNeasy mericon Food Kit DNA基因組提取試劑盒對莽椒樣品進行宏基因組DNA提取，使用帶有7個堿基核苷酸標簽(barcode)的338F/806R引物，按照文獻[9]中的PCR擴增體系和擴增條件對細菌16S rRNA V3～V4區(qū)進行PCR擴增，檢測合格后的擴增產(chǎn)物使用Illumina MiSeq PE300高通量測序平臺進行高通量測序。

1.3.3 序列質(zhì)控和生物信息學(xué)分析

參照文獻[10]中的方法對下機數(shù)據(jù)拼接后進行質(zhì)控，將錯配率≥0.2、引物堿基錯配數(shù)≥2 bp或barcode堿基有錯配的予以剔除，進而篩選得到高質(zhì)量的序列集。以QIIME(v1.70)平臺為依托[11]，使用PyNAST軟件對序列進行標準比對和對齊[12]；選取100%和97%相似度進行兩步UCLUST劃分，構(gòu)建分類操作單元矩陣(operational taxonomic units，OTU)[13]；使用ChimeraSlayer軟件剔除含有嵌合體序列的OTU[14]；從OTU中選取一條代表性序列，使用GREENGENE、SILVA和RDP數(shù)據(jù)庫進行同源性比對[15]，進而在門、綱、目、科和屬水平上獲得各OTU的分類學(xué)地位；在使用FastTree軟件繪制系統(tǒng)發(fā)育進化樹的基礎(chǔ)上[16]，計算Chao1指數(shù)、發(fā)現(xiàn)物種數(shù)、Simpson指數(shù)和Shannon指數(shù)進而對菌群的多樣性和豐度進行評價；使用UniFrac距離進行主坐標分析，進而完成遵義地區(qū)莽椒和當陽地區(qū)鲊廣椒中細菌的β多樣性分析。

1.3.4 核酸登錄號

本研究中所有序列數(shù)據(jù)已提交至MG-RAST數(shù)據(jù)庫，登錄號為mgp90774。同時本研究下載湖北省當陽地區(qū)的鲊廣椒序列數(shù)據(jù)納入分析，該數(shù)據(jù)在MG-RAST數(shù)據(jù)庫的登錄號為mgp80896。

1.3.5 PICRUSt功能預(yù)測和BugBase表型預(yù)測

基于GREENGENE數(shù)據(jù)庫對質(zhì)控后的高質(zhì)量序列數(shù)據(jù)進行UCLUST劃分和注釋，使用PICRUSt軟件對莽椒和鲊廣椒樣品中微生物的基因功能進行預(yù)測[17]，并依照蛋白質(zhì)直系同源簇數(shù)據(jù)庫進行功能注釋[18]。將OTU矩陣與樣品的分類信息上傳至BugBase網(wǎng)站(https://bugbase.cs.umn.edu/)進行表型預(yù)測[19]。

1.3.6 多元統(tǒng)計學(xué)分析

使用Wilcoxon test對莽椒和鲊廣椒樣本的α多樣性、菌群結(jié)構(gòu)和功能類別進行顯著性分析；使用冗余分析對造成莽椒差異的功能類別進行甄別；使用Spearman秩相關(guān)性分析法對樣本中優(yōu)勢細菌屬與功能類別之間的相關(guān)性進行計算，選取相關(guān)系數(shù)>0.6，且校正后P<0.05菌群和指標，采用Cytoscape軟件進行相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)圖的繪制。使用R軟件進行分析和繪圖；使用Canoco 4.5軟件進行冗余分析和繪圖；使用Origin 2017軟件進行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 莽椒中乳酸菌的分離鑒定

本研究從7 個莽椒樣本中共分離出17 株疑似乳酸菌菌株；同時通過16S rRNA基因序列分析進一步將分離菌株鑒定到種水平，分離株與標準菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖1所示。

由圖1可知，本研究分離出的17 株乳酸菌分別鑒定為Weissellahellenica(希臘魏斯氏菌，1 株)、Lactobacillusbrevis(短乳桿菌，1 株)、L.pentosus(戊糖乳桿菌，10 株)、L.plantarum(植物乳桿菌，2 株)、L.alimentarius(消化乳桿菌，1 株)和L.fermentum(發(fā)酵乳桿菌，2 株)。值得注意的是，17 株分離菌中有16 株為乳酸桿菌。

2.2 基于門和屬水平的莽椒中細菌構(gòu)成分析

本研究使用Illumina MiSeq高通量測序技術(shù)對莽椒中細菌的多樣性進行了解析，共產(chǎn)生295 133 條高質(zhì)量序列，平均每個樣本產(chǎn)生42 162條。經(jīng)100%和97%劃分和去除嵌合體后共得到10 747個OTU。莽椒中優(yōu)勢門和屬相對含量的方格圖如圖2所示。

圖1 基于16S rRNA的17 株乳酸菌與標準菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree of 17 strains of lactic acid bacteria and standard strains based on 16S rRNA

a-細菌門；b-細菌屬圖2 莽椒樣品中主要細菌門和屬相對含量的方格圖Fig.2 The relative content of the main bacterial phylum and genus in the Mangjiao sample

由圖2可知，10 747個OTU共注釋到16個門，其中相對含量>0.1%的分別為硬壁菌門、變形菌門、Bacteroidetes(擬桿菌門)和Actinobacteria(放線菌門)，其平均相對含量分別為63.15%、36.24%、0.30%和0.12%。由此可知，莽椒中的細菌主要隸屬于硬壁菌門和變形菌門，而王玉榮的研究表明鲊廣椒中的細菌亦主要隸屬于硬壁菌門(62.36%)和變形菌門(25.97%)[6]。

由圖2亦可知，10 747個OTU共注釋到249個屬，其中相對含量大于1.0%的分別為乳桿菌屬(41.37%)、假單胞菌屬(16.64%)、魏斯氏菌屬(14.96%)、腸桿菌屬(5.04%)、片球菌屬(2.48%)、克雷伯氏菌屬(2.40%)和芽孢桿菌屬(1.33%)，而王玉榮的研究表明鲊廣椒中含量大于1.0%的細菌屬也有7個，分別為乳桿菌屬(77.33%)、魏斯氏菌屬(2.24%)、片球菌屬(2.18%)、葡萄球菌(1.27%)、Carnimonas(肉胞菌屬，5.66%)、腸桿菌屬(2.47%)和Prevotella(普氏菌屬，1.05%)[6]。

2.3 莽椒與鲊廣椒中細菌群落結(jié)構(gòu)的比較

為了進一步甄別莽椒和鲊廣椒中微生物類群的差異，本研究將王玉榮研究中涉及的序列從MG-RAST數(shù)據(jù)庫中進行了下載[6]，并將其與本研究獲取的序列進行了歸并，同時使用QIIME分析平臺對兩類樣品的α和β多樣性進行了解析，α多樣性指數(shù)的比較箱型圖如圖3所示。

a-Cheol指數(shù)；b-發(fā)現(xiàn)物種數(shù)；c-Simpson指數(shù)；d-Shannon指數(shù)圖3 莽椒和鲊廣椒樣品α多樣性指數(shù)的比較箱型圖Fig.3 Comparative boxplots of α diversity index of Mangjiao and Zhaguangjiao samples注：*代表P<0.05；ns代表差異不顯著，P>0.05(下同)

由圖3可知，莽椒中細菌在Chao1指數(shù)、發(fā)現(xiàn)物種數(shù)、Simpson指數(shù)和Shannon指數(shù)上均高于鲊廣椒樣本，經(jīng)Wilcoxon test檢驗發(fā)現(xiàn)，Chao1指數(shù)和發(fā)現(xiàn)物種數(shù)在兩者之間存在顯著性差異(P<0.05)。Chao1指數(shù)和發(fā)現(xiàn)物種數(shù)常用于對樣品中微生物的豐度進行評估，其值越大表明微生物豐度越高，由此可知，莽椒中細菌的豐度顯著高于鲊廣椒(P<0.05)?；诩訖?quán)和非加權(quán)UniFrac距離的兩類樣品細菌群落結(jié)構(gòu)的差異性分析如圖4所示。

由圖4-a可知，在基于加權(quán)UniFrac距離的主坐標分析圖中，兩類樣品的空間分布存在交疊現(xiàn)象，經(jīng)多元方差分析發(fā)現(xiàn)兩組樣品群落結(jié)構(gòu)差異不顯著(P>0.05)；由圖4-b可知，在基于非加權(quán)UniFrac距離的主坐標分析圖中，兩類樣品呈現(xiàn)出明顯的分離趨勢，多元方差分析表明其群落結(jié)構(gòu)差異極顯著(P<0.001)。由此可見，莽椒和鲊廣椒可能均各自含有一些含量較少但較為獨特的細菌類群。經(jīng)Wilcoxon test檢驗發(fā)現(xiàn)，變形菌門、假單胞菌屬和魏斯氏菌屬在莽椒樣品中顯著較高(P<0.05)，而放線菌門和乳桿菌屬顯著較低(P<0.05)。

a-加權(quán)；b-非加權(quán)圖4 基于加權(quán)和非加權(quán)的UniFrac距離的主坐標分析圖Fig.4 Principal coordinate analysis diagram of UniFrac distance based on weighted and unweighted

本研究使用BugBase對莽椒與鲊廣椒樣品中細菌的表型進行了預(yù)測分析，結(jié)果如圖5所示。

由圖5可知，移動原件含量、生物膜形成、革蘭氏陰性菌、致病潛力和氧化脅迫耐受在莽椒細菌中顯著偏高(Wilcoxon test發(fā)現(xiàn)，P<0.05)，而革蘭氏陽性菌呈現(xiàn)出相反的趨勢(P<0.05)。由此可見，莽椒與鲊廣椒中的細菌在預(yù)測表型上存在著較大的差異。

2.4 PICRUSt功能預(yù)測

本研究進一步使用PICRUSt軟件對莽椒與鲊廣椒中細菌菌群的基因功能進行了預(yù)測。在預(yù)測基因功能的同時，參考蛋白質(zhì)直系同源簇數(shù)據(jù)庫(clusters of orthologous groups of proteins，COG)對預(yù)測的功能類別進行了注釋。莽椒與鲊廣椒樣本中細菌功能類別的比較分析如圖6所示。

a-革蘭陰性菌；b-革蘭氏陽性菌；c-致病潛力；d-厭氧；e-好氧；f-兼性厭氧；g-氧化脅迫耐受；h-生物膜形成；i-移動原件含量圖5 莽椒與鲊廣椒樣品中細菌表型結(jié)果的比較分析Fig.5 Comparative analysis of bacterial phenotypic results in Mangjiao and Zhaguangjiao Samples

a-功能類別熱圖；b-功能類別冗余分析；c-顯著性差異功能類別；A-RNA的加工與修飾；B-染色質(zhì)結(jié)構(gòu)與動力學(xué)；C-能量生產(chǎn)和轉(zhuǎn)換；D-細胞周期控制、細胞分裂、染色體分割；E-氨基酸轉(zhuǎn)運與代謝；F-核苷轉(zhuǎn)運與代謝；G-碳水化合物運輸和代謝；H-輔酶轉(zhuǎn)運與代謝；I-脂質(zhì)轉(zhuǎn)運與代謝；J-翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)與生物發(fā)生；K-轉(zhuǎn)錄；L-復(fù)制-重組和修復(fù)；M-細胞壁/膜/包膜生物發(fā)生；N-細胞運動；O- 翻譯后修飾，蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)，伴侶；P-無機離子運輸與代謝；Q-次生代謝產(chǎn)物的合成-轉(zhuǎn)運和分解代謝；R-一般功能預(yù)測；S-未知功能；T，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制；U-細胞內(nèi)運輸，分泌和囊泡運輸；V-防御機制；W-真核細胞的細胞外結(jié)構(gòu)；Y-核外結(jié)構(gòu)；Z-細胞骨架(下同)圖6 莽椒與鲊廣椒中細菌功能類別的比較分析Fig.6 Comparative analysis of bacterial functional genes in mangjiao and zhaguangjiao samples

本研究從莽椒和鲊廣椒細菌中共注釋到4 792個COG，這些COG分別隸屬于23 個功能類別。由圖6-a可知，碳水化合物的運輸與代謝、氨基酸的轉(zhuǎn)運與代謝和轉(zhuǎn)錄在兩類樣品中均高表達，而細胞運動、RNA的加工與修飾、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)與動力學(xué)和細胞骨架的表達則相對較低。由圖6-b可知，通過冗余分析發(fā)現(xiàn)有12 個功能類別對莽椒和鲊廣椒細菌多樣性的區(qū)分有影響。由6-c所示，3 個功能類別在莽椒和鲊廣椒樣品中存在顯著性差異(P<0.05)，莽椒樣品中細菌的細胞內(nèi)運輸較強，而鲊廣椒中細菌的細胞周期控制、細胞分裂、染色體分割和翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)與生物發(fā)生的表達較強。兩類樣品中主要菌屬(平均相對含量大于0.1%)與功能類別之間的相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)圖如圖7所示。

圖7 主要菌屬與功能類別之間的相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)圖Fig.7 Correlation network diagram between dominant bacteria and functional classes注：實線表示顯著正相關(guān)，虛線表示顯著負相關(guān)；連線的粗細表示相關(guān)性的大小，線越粗相關(guān)性也大，反之越小

由圖7可知，乳桿菌屬、Salmonella(沙門氏菌屬)、腸桿菌屬、Lactococcus(乳球菌屬)和克雷伯菌屬與12 個功能類別之間具有顯著相關(guān)關(guān)系(P<0.05)，其中這12 個功能類別主要隸屬于碳水化合物代謝、核酸代謝和蛋白質(zhì)代謝相關(guān)的功能類別。值得注意的是，除乳桿菌屬與細胞運動、胞內(nèi)運輸和信號傳導(dǎo)呈顯著負相關(guān)外(P<0.05)，其他菌屬與功能類別之間呈顯著正相關(guān)(P<0.05)。由此可見，上述菌屬在莽椒品質(zhì)形成方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。

3 討論

在現(xiàn)代食品加工產(chǎn)業(yè)中，乳酸菌是生產(chǎn)發(fā)酵乳、泡菜和益生菌制劑等常用的菌種之一，具有應(yīng)用范圍廣、產(chǎn)品種類多和市場產(chǎn)值大的特點[20]。我國學(xué)者圍繞乳酸菌菌株的挖掘、收集、高密度發(fā)酵、功效評價和產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用開展了大量卓有成效的研究，極大地促進了我國乳酸菌及相關(guān)食品產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。目前我國開展乳酸菌研究的科研院所和高校多集中在東北三省、內(nèi)蒙古自治區(qū)、新疆維吾爾自治區(qū)、北京市、廣東省、四川省和江浙滬地區(qū)，而位于我國華中地區(qū)的湖北省及西南地區(qū)的貴州省開展乳酸菌相關(guān)研究的較少，且目前產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)中使用的乳酸菌菌株多來源自傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品、腸道和發(fā)酵蔬菜制品。以莽椒和鲊廣椒為代表的特色發(fā)酵食品在我國華中及西南地區(qū)較為流行，其發(fā)酵基質(zhì)和發(fā)酵條件與泡菜和乳制品均存在較大差異，通常以大米、玉米和辣椒為主要原料固態(tài)厭氧發(fā)酵而成，因而其中蘊含的乳酸菌資源可能較為獨特和多樣[21]。本研究從遵義地區(qū)莽椒中分離的絕大部分乳酸菌為戊糖乳桿菌，雖其在泡菜[22]和發(fā)酵乳[23]中亦有報道，但均為非優(yōu)勢乳酸菌。通過采用單分子實時測序技術(shù)，王玉榮等發(fā)現(xiàn)湖北省當陽地區(qū)鲊廣椒中的乳酸菌主要為破布子乳桿菌(L.pobuzihii)、食品乳桿菌(L.alimentarius)和費斯莫爾德乳桿菌(L.versmoldensis)，而這些細菌種在其他發(fā)酵食品中報道亦較少[24]。此外，ZHANG等亦從湖北省當陽地區(qū)的鲊廣椒中分離到1株乳酸菌新物種，并將其命名為鲊廣椒乳桿菌(L.zhachiliisp. nov)[25]。由此可見，我國華中及西南地區(qū)以莽椒和鲊廣椒為代表的淀粉基質(zhì)發(fā)酵食品中含有豐富且較為獨特的乳酸菌群系，因而在對發(fā)酵食品微生物多樣性進行解析的基礎(chǔ)上進一步進行乳酸菌菌株收集，對后續(xù)乳酸菌遺傳多樣性研究和產(chǎn)業(yè)化推動具有積極的意義。

MiSeq測序結(jié)果顯示，乳桿菌屬和魏斯氏菌屬是莽椒樣品中的優(yōu)勢菌屬，分別占到全部細菌含量的41.37%和14.96%。乳桿菌在莽椒的發(fā)酵過程中可以將糖類物質(zhì)轉(zhuǎn)化為乳酸，同時伴隨著乙醇、乙酸和NO2等各種副產(chǎn)物的生成，不僅使莽椒形成了特有的風(fēng)味，對雜菌和有害菌亦有一定的抑制作用。作為異型發(fā)酵乳酸菌，魏斯氏菌的主要代謝產(chǎn)物為乳酸和乙酸，有研究表明其可產(chǎn)生寡糖和胞外多糖(主要是葡聚糖)，而這些物質(zhì)可存在于發(fā)酵制品中為人類所利用[26]。本研究亦發(fā)現(xiàn)莽椒中存在大量的條件致病菌，腸桿菌屬和克雷伯氏菌屬細菌的占比達7.44%，通過基因功能預(yù)測亦發(fā)現(xiàn)莽椒中細菌具有較強的生物膜形成和致病潛力，究其原因在于莽椒的制作環(huán)境較為開放，發(fā)酵過程中極易受到家畜糞便和污水的污染。由此可見，在改善加工環(huán)境的同時，積極篩選具有優(yōu)良發(fā)酵特性的乳酸菌進行莽椒的純種發(fā)酵，對推動莽椒的產(chǎn)業(yè)化進程及提升食品安全性具有積極的意義[27]。

通過基因功能預(yù)測發(fā)現(xiàn)，莽椒和鲊廣椒中細菌的碳水化合物運輸與代謝功能均較強，究其原因可能在于兩者制作工藝較為相似，均以大米、玉米和辣椒為主要原料。雖然莽椒和鲊廣椒制作均為厭氧發(fā)酵，但基因預(yù)測發(fā)現(xiàn)莽椒和鲊廣椒中細菌均含有較多的兼性厭氧菌且其氧化脅迫耐受能力亦較強，導(dǎo)致這種現(xiàn)象的原因可能是居民開壇取食食材時破壞了罐內(nèi)的厭氧環(huán)境，氧氣的進入對細菌的多樣性產(chǎn)生了影響。本研究發(fā)現(xiàn)遵義地區(qū)莽椒和當陽地區(qū)鲊廣椒均各自含有一些含量較少但較為獨特的細菌類群，生產(chǎn)環(huán)境和制作工藝對發(fā)酵食品的細菌多樣性具有顯著影響，近年來越來越多的研究表明，不同地區(qū)的發(fā)酵食品不僅微生物群系存在較大差異[28]，同一乳酸菌種種內(nèi)的遺傳多樣性亦存在很大不同[29]。由此可見，在后續(xù)研究中進一步擴大莽椒和鲊廣椒的樣本采集范圍和數(shù)量，在采用宏基因組學(xué)策略對其微生物多樣性進行揭示的基礎(chǔ)上，使用多位點序列分型(multilocus sequence typing, MLST)和比較基因組學(xué)手段對乳酸菌分離株遺傳多樣性進行解析是極為必要的。