羅格列酮病灶區(qū)灌注對腦出血家兔繼發(fā)腦損傷的預防作用觀察及機制探討

李軍，葉飛，王麗琨，任思穎，伍國鋒

貴州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院，貴陽550004

腦出血是指非外傷性腦實質(zhì)血管破裂出血，腦出血后對腦組織的損害機制主要包括血腫的機械占位效應(yīng)和繼發(fā)性損害，繼發(fā)性腦損害是目前腦出血研究的熱點[1, 2]。繼發(fā)性損害涉及血腫局部的炎癥反應(yīng)[3]、血紅蛋白[4]、凝血酶[5]等多種作用機制，繼發(fā)性腦損害可導致病灶周圍腦組織水腫的加重，腦組織水腫的嚴重程度可以反映繼發(fā)性損害的嚴重程度[1]。水通道蛋白(AQP)-4是中樞神經(jīng)系統(tǒng)介導水分子跨膜轉(zhuǎn)運水通道的主要亞型，在維持血腦屏障完整性及通透性上起重要作用，且在缺血缺氧性腦病、腦外傷等腦損傷后腦水腫的病理生理過程中發(fā)揮重要作用。羅格列酮是噻唑烷二酮類藥物，是過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)激動劑。我們課題組前期研究結(jié)果表明羅格列酮顱內(nèi)病灶周圍灌注可以減輕腦出血后繼發(fā)性損害[6]，改善預后[7],但其具體機制尚不明確。2016年4月～2018年1月，本研究中，我們建立了腦出血家兔模型，觀察了羅格列酮病灶區(qū)灌注后腦出血家兔病灶周圍腦組織血腦屏障通透性、腦水腫及神經(jīng)功能損害情況，并觀察了病灶周圍腦組織AQP-4的表達變化。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、試劑及儀器 健康新西蘭大耳白兔45只，由貴州醫(yī)科大學實驗動物中心提供，體質(zhì)量2.8～3.4 kg，雌雄不分，動物均在光照充足，溫度在10 ℃～30 ℃的動物中心室內(nèi)由動物中心專門人員按照清潔級家兔要求飼養(yǎng)。本課題獲得貴州醫(yī)科大學倫理委員會批準后開展相關(guān)動物實驗。AQP-4單克隆抗體(武漢博士德公司)，AQP-4二抗(中山公司)，DAB顯色試劑盒(中山公司)，SABC免疫組化試劑盒(武漢博士德公司)。ZH-藍星B型兔腦立體定位儀(安徽淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司)，MIR-153干燥箱(日本三洋公司)，SynergyH4酶標儀(美國伯騰儀器有限公司)，全自動聚焦生物顯微鏡N-800D(蘇州南光電子科技有限公司)。

1.2 腦出血家兔模型制作及羅格列酮病灶區(qū)灌注方法 45只健康家兔隨機分為對照組、模型組及羅格列酮組，各15只。每組家兔均在模型制備前禁食禁飲。耳緣靜脈麻醉后，固定在立體定位儀上，沿著頭頂正中線切開頭皮，長度約2 cm,分離皮下筋膜至顱骨，充分暴露“十”字縫和“人”字縫。取“十”形交叉點為0點，調(diào)整立體定位儀穿刺針頭至0點左側(cè)6 mm(AP0/L6)為穿刺點，深度約12 mm為靶點，即基底節(jié)中心點，用穿刺針頭垂直鉆破顱骨。①對照組：采用7號針頭沿顱骨針道垂直刺入，深度12 mm，以500 μL/min以下速度均勻緩慢注入生理鹽水0.3 mL，留針10 min后緩慢拔出，6 h后再次連接7號針頭，以500 μL/min以下速度均勻緩慢注入生理鹽水0.1 mL，留針10 min后緩慢拔出。②模型組：家兔耳中央動脈采集自體動脈血0.8 mL,立即連接7號針頭沿顱骨針道垂直刺入,深度12 mm，以500 μL/min以下速度均勻緩慢注血0.3 mL，其余0.5 mL丟棄，留針10 min后緩慢拔出，6 h后再次連接7號針頭以500 μL/min以下速度均勻緩慢注入生理鹽水0.1 mL，留針10 min后緩慢拔出。③羅格列酮組：在模型組處理的基礎(chǔ)上，6 h后更換7號針頭以500 μL/min以下速度均勻緩慢注入含有羅格列酮0.2 mg/kg生理鹽水0.1 mL，留針10 min后緩慢拔出。各組均在模型制備完成后，徹底消毒，局部包扎，40萬U青霉素肌肉注射預防感染。分別在上述處理后的第1天、3天和7天評估三組神經(jīng)功能，然后將2%伊文思藍(2 mL/kg)經(jīng)耳緣靜脈注入。使用3%戊巴比妥鈉經(jīng)耳緣靜脈注射麻醉，灌洗后斷頭取腦，將針道中心直徑1.5 cm以外的腦組織切除，四分法將腦組織均勻分成4塊，一份立即蘸干后秤取濕重后盡快烘干測量腦組織含水量，一份加入配制好的甲酰胺溶液中待測伊文思藍含量，一份立即放入多聚甲醛溶液中固定用于HE染色及免疫組化法檢測AQP-4的表達，最后一份可-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆没蜃銎渌麢z測。

1.3 各組神經(jīng)功能、腦組織含水量、血腦屏障通透性檢測 采用Purdy評分評估神經(jīng)功能。采用干濕重法檢測腦組織含水量,腦組織含水量=(濕重-干重)/濕重×100%。血腦屏障通透性：通過腦組織伊文思藍含量評定，伊文思藍越高表明腦組織血腦屏障通透性越高。腦組織伊文思藍含量測定方法如下，先制作標準曲線后精確稱取腦組織濕重，3次取平均值并記錄。利用標準曲線線性回歸方程y=0.005 3x+0.060 8(R=0.989 9)計算出樣本的伊文思藍含量(B值)，腦組織伊文思藍含量=B×甲酰胺容積(mL)/濕重(g)。

1.4 病灶周圍腦組織神經(jīng)細胞、神經(jīng)膠質(zhì)細胞形態(tài)觀察 采用HE染色法。將標本放入蘇木素6 min.然后入1%鹽酸乙醇10 s，伊紅1 min，再依次入70%乙醇1.5 min、80%乙醇2 min、90%乙醇2 min、95%乙醇2 min、100%乙醇4 min、100%乙醇5 min，最后二甲苯透明2次、每次5 min，中性樹膠封片。在400 倍鏡下觀察腦組織中神經(jīng)細胞和膠質(zhì)細胞形態(tài)。

1.5 腦組織AQP-4的檢測 采用免疫組織化學法。將腦組織泡入4%多聚甲醛固定后，石蠟包埋，切片，PBS沖洗以及抗原修復。以小鼠AQP-4作為一抗，山羊抗兔或鼠IgG抗體為二抗，先后加入一抗、二抗后DAB染色液顯色，蘇木素復染，沖洗，梯度乙醇脫水，松節(jié)油透明、中性樹膠封片，光鏡下觀察。PBS作陰性對照。光鏡下觀察5個不同視野，計算AQP-4陽性表達的平均光密度值。

2 結(jié)果

共使用家兔48只，其中各有1只在制作模型過程中和制作模型后意外死亡，1只在處死后發(fā)現(xiàn)顱內(nèi)感染，45只按實驗設(shè)計成功制備模型。

2.1 各組不同時間Purdy評分、腦組織含水量、血腦屏障通透性比較 與對照組比較，模型組灌注后第3、7天Purdy評分均升高、病灶周圍腦組織含水量增加，且灌注后第3天達高峰，各時間點腦組織伊文思藍含量均高(P均<0.05)；與模型組比較，灌注后第3、7天羅格列酮組Purdy評分均低、病灶周圍腦組織含水量減少，各時點腦組織伊文思藍含量均低(P均<0.05)，見表1。

2.2 各組不同時間病灶周圍腦組織神經(jīng)細胞、神經(jīng)膠質(zhì)細胞形態(tài)觀察 對照組灌注后第1、3、7天病灶周圍腦組織中神經(jīng)細胞和膠質(zhì)細胞形態(tài)正常。模型組灌注后第1天病灶周圍腦組織中有明顯出血灶，病灶周圍組織水腫明顯，伴有大量炎細胞浸潤，神經(jīng)細胞、膠質(zhì)細胞腫脹，細胞周圍間隙變大，細胞深染或固縮；模型組灌注后第3天病灶周圍腦組織可見組織水腫和細胞間隙空泡化最為明顯，炎細胞浸潤，部分神經(jīng)細胞壞死、消失；模型組第7天病灶周圍腦組織可見炎癥細胞數(shù)增加，可見病灶周圍及血腫內(nèi)膠質(zhì)細胞增生，水腫帶逐漸消退，膠質(zhì)細胞增生明顯。與同一時間點的模型組比較，羅格列酮組灌注后第1、3、7天腦組織病灶周圍組織水腫范圍減小，程度減輕，腫脹細胞較少，神經(jīng)固縮細胞較少，細胞周圍間隙變小，并可見較多增生膠質(zhì)細胞，見圖1。

表1 各組不同時間點Purdy評分、腦組織含水量、腦組織伊文思蘭含量

注：a、b、c分別為對照組第1、3、7天神經(jīng)細胞、神經(jīng)膠質(zhì)細胞；d、e、f分別為模型組第1、3、7天神經(jīng)細胞、神經(jīng)膠質(zhì)細胞；g、h、i分別為羅格列酮組第1、3、7天神經(jīng)細胞、神經(jīng)膠質(zhì)細胞。正常形態(tài)神經(jīng)細胞和膠質(zhì)細胞形態(tài)正常(★箭頭)，出血灶(▲箭頭)，組織水腫空泡變性(◆箭頭)，炎細胞浸潤(●箭頭)，細胞深染或固縮(■箭頭)。

圖1 各組家兔不同時間病灶周圍腦組織神經(jīng)細胞、神經(jīng)膠質(zhì)細胞形態(tài)(×400)

2.3 各組不同時間病灶周圍腦組織AQP-4表達比較 灌注后第1、3、7天，羅格列酮組AQP-4表達量分別為0.207±0.006、0.236±0.007、0.157±0.007，模型組分別為0.228±0.063、0.285±0.008、0.198±0.004；對照組分別為0.125±0.100、0.118±0.009、0.119±0.005；各時間點，與對照組比較，模型組AQP-4表達量升高；與模型組比較，羅格列酮組AQP-4表達量降低(P均<0.05)。

2.4 腦出血家兔病灶周圍腦組織AQP-4表達與腦組織含水量、腦組織伊文思蘭含量及Purdy評分相關(guān)性 病灶周圍腦組織AQP-4表達水平與腦組織含水量(r=0.82，P<0.01)、腦組織伊文思蘭含量(r=0.93，P<0.01)及Purdy評分(r=0.94，P<0.01)均呈顯著正相關(guān)。

3 討論

PPARγ是位于細胞核膜上的轉(zhuǎn)錄因子，當其被激活后與視黃酸受體(RXR)形成異源二聚體調(diào)控目的基因的轉(zhuǎn)錄[8]。PPARγ激活后可以通過多種途徑減輕腦出血后繼發(fā)性損害。大量的動物實驗研究表明，PPARγ激動劑噻唑烷二酮類藥物在減輕腦出血后繼發(fā)性損害，改善預后上有良好的效果[8,9]。本研究結(jié)果顯示，家兔腦出血模型給予病灶區(qū)羅格列酮灌注治療后，病灶周圍腦組織血腦屏障通透性減低及腦水腫、神經(jīng)功能損害程度減輕，支持文獻報道，說明病灶區(qū)羅格列酮灌注對腦出血后繼發(fā)腦損傷有預防作用。

AQP-4是一種水通道蛋白，是大腦水通道的主要亞型，廣泛分布于軟膜下和室管膜下區(qū)及血管周圍星形膠質(zhì)細胞終足上，呈明顯的極性分布[10]。AQP-4的主要作用是介導中樞神經(jīng)系統(tǒng)水分子的跨膜轉(zhuǎn)運。在對體外培養(yǎng)的星型膠質(zhì)細胞的研究表明，不表達AQP-4的星型膠質(zhì)細胞水腫顯著減輕[11]。通過對原代培養(yǎng)的AQP-4基因敲除小鼠的星形膠質(zhì)細胞進行觀察，顯示其對水的通透性下降了7倍,表明AQP-4可能是星型膠質(zhì)細胞水轉(zhuǎn)運的主要途徑[12]。而且AQP-4對各種疾病導致的腦水腫形成和清除起重要作用，通過對AQP-4基因缺失轉(zhuǎn)基因小鼠的研究表明，AQP-4的表達加重細胞毒性腦水腫[13, 14]卻有利于血管源性腦水腫的清除[15]。AQP-4還參與維持血腦屏障通透性完整性和發(fā)育過程[16]。在對小鼠血管周圍星型膠質(zhì)細胞研究表明，AQP-4的缺失和分布異?？蓪е滦切湍z質(zhì)細胞終足腫脹，從而影響血腦屏障通透性結(jié)構(gòu)和功能[17]。AQP-4基因敲除小鼠改變了血腦屏障通透性完整性[18]，然而Saadoun等[19]研究卻表明，AQP-4基因敲除對小鼠的血腦屏障通透性完整性沒有影響。也有研究[17]觀察到遠離損傷部位腦組織有AQP-4的減少但血腦屏障通透性沒有改變，因此認為AQP-4對沒有機械和代謝應(yīng)激的正常腦組織血腦屏障通透性完整性不是關(guān)鍵因素。關(guān)于腦出血后AQP-4與腦水腫及血腦屏障通透性的關(guān)系的研究較少，且相關(guān)研究存在爭議。Chiu等[20]也認為，AQP-4表達下調(diào)導致腦出血后腦水腫加重和血腦屏障通透性增加；而Fang等[21]認為，在大鼠腦出血模型中，高壓氧治療通過降低AQP-4表達，從而減輕病灶周圍腦水腫發(fā)揮神經(jīng)保護作用。研究表明，腦出血后腦組織水腫既涉及到血管源性腦水腫，又涉及到細胞毒性腦水腫，在腦出血的不同階段兩種水腫形式所占優(yōu)勢不同[5]，因此AQP-4可能在不同階段發(fā)揮不同的作用。本研究發(fā)現(xiàn)家兔腦出血模型病灶周圍腦組織AQP-4表達顯著升高，且AQP-4表達水平與血腦屏障通透性、腦組織水腫及神經(jīng)功能損害程度呈明顯相關(guān)性。本研究發(fā)現(xiàn)家兔腦出血模型病灶周圍腦組織AQP-4表達顯著升高，且AQP-4表達水平與血腦屏障通透性、腦組織水腫及神經(jīng)功能損害程度呈明顯相關(guān)性。因此，我們推測腦出血后病灶周圍腦組織AQP-4表達增加，導致血腦屏障通透性增加，加重腦組織水腫，從而加重神經(jīng)功能損害。但其在腦出血后腦損傷中的具體作用仍待使用AQP-4受體拮抗劑及細胞實驗等方法進一步驗證。