灌胃吡喹酮在中華草龜體內(nèi)的代謝動(dòng)力學(xué)研究

張曉雨,龐溦,潘連德、3*,鮑曉穎

(1.上海海洋大學(xué) 省部共建水產(chǎn)種質(zhì)資源發(fā)掘與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 上海 201306； 2.上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)科學(xué)國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心， 上海 201306; 3.上海海洋大學(xué) 國(guó)家水生動(dòng)物病原庫(kù)， 上海 201306 )

近年來(lái)，隨著人們對(duì)龜鱉自然資源保護(hù)的重視，以及其觀賞、藥用與食用價(jià)值的不斷提高，龜鱉健康和疾病問(wèn)題也越來(lái)越被重視，其臨床獸醫(yī)學(xué)研究亟待開(kāi)展。當(dāng)前研究工作中，常用抗菌類藥物恩諾沙星連續(xù)肌注對(duì)中華草龜Chinemysreevesiis的急性與慢性毒理[1]和強(qiáng)制口服在該龜體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)研究[2]，以及麻醉藥物舒泰50對(duì)中華草龜?shù)穆樽硇Чc體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)特征研究[3]，為抗菌藥物和麻醉藥在龜鱉臨床的使用提供了可靠的科學(xué)依據(jù)。

吡喹酮(Praziquantel)具有高效、廣譜、低毒、劑型多等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于哺乳動(dòng)物、爬行動(dòng)物[4]及水產(chǎn)動(dòng)物[5-6]等的臨床驅(qū)蟲(chóng)，防治龜鱉體內(nèi)外寄生蟲(chóng)病的驅(qū)蟲(chóng)效果已有不少研究，對(duì)治療綠海龜自發(fā)性心血管吸蟲(chóng)感染具有良好療效[7]。吡喹酮和艾默德斯(Emodepside)(Profender?，Bayer)的組合滴劑對(duì)俄羅斯陸龜、赫爾曼陸龜、穆?tīng)栁髋D陸龜和豹龜4種野生陸龜?shù)幕紫x(chóng)等寄生蟲(chóng)感染的驅(qū)蟲(chóng)效果顯著[8]。體表滴涂給藥操作相對(duì)簡(jiǎn)單，但藥物經(jīng)皮吸收緩慢，另外，針對(duì)紅耳巴西龜?shù)人锓N，吡喹酮經(jīng)體表滴涂后，水龜放入水中后吡喹酮會(huì)很快被稀釋，影響吸收效果，無(wú)法達(dá)到有效血藥濃度，并且相關(guān)試驗(yàn)僅測(cè)定了體表滴涂給藥前0 h與給藥后5、24、48 h時(shí)的吡喹酮血藥濃度，藥動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)較少，對(duì)藥動(dòng)力學(xué)的統(tǒng)計(jì)貢獻(xiàn)相對(duì)有限[9]。目前，針對(duì)吡喹酮在龜鱉體內(nèi)藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究，僅見(jiàn)單劑量和多劑量口服吡喹酮后測(cè)定海龜血漿內(nèi)吡喹酮濃度及藥代動(dòng)力學(xué)特征的初步研究[10]，但該試驗(yàn)過(guò)程與結(jié)果存在較大的缺陷。中華草龜是中國(guó)常見(jiàn)的本土龜類，由于其適應(yīng)力強(qiáng)、來(lái)源廣、用途多等原因已成為科學(xué)研究的模式試驗(yàn)龜[1-3]。本試驗(yàn)中，選取成年中華草龜為試驗(yàn)對(duì)象,探究不同性別、不同劑量、不同給藥次數(shù)對(duì)灌胃吡喹酮在中華草龜體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)規(guī)律和特征的影響，以補(bǔ)充和完善龜鱉體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)與不良反應(yīng)的研究，旨在為吡喹酮在臨床上治療龜鱉寄生蟲(chóng)性疾病提供數(shù)據(jù)資料。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)動(dòng)物：試驗(yàn)用人工養(yǎng)殖的中華草龜購(gòu)于安徽省阜陽(yáng)市界首市養(yǎng)龜場(chǎng), 雌性6只(7齡)，體質(zhì)量為(0.745±0.066) kg，雄性6只(8齡),體質(zhì)量為(0.361±0.066) kg。按性別分組暫養(yǎng)在兩只水族箱(100 cm×80 cm×80 cm)中,試驗(yàn)用水為充分曝氣的自來(lái)水,水溫控制在(27±2)℃,穩(wěn)定飼養(yǎng)約45 d。暫養(yǎng)期間每2 d換水1次,每天觀察并記錄攝食、排便、活動(dòng)及精神狀態(tài)。以攝食良好、排便成型、四肢活動(dòng)力強(qiáng)、精神佳、無(wú)明顯外傷與異常行為者，視為正常個(gè)體,用作試驗(yàn)動(dòng)物。

主要儀器：液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(離子阱)(Thermo Scientific LTQ-XL)、高速冷凍離心機(jī)(Eppendorf 5424R)、漩渦振蕩器(IKA Vortex-3)和氮吹儀(QGC-24T)等。

主要藥品與試劑：吡喹酮標(biāo)準(zhǔn)品(純度99.7%) 購(gòu)自河南普天同創(chuàng)生物科技有限公司;吡喹酮片(每片成分含量約200 mg)購(gòu)自華畜商貿(mào)有限公司;甲醇、乙酸乙酯、乙腈、超純水等均為色譜純，購(gòu)自上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 分組與給藥 精確稱取吡喹酮片研磨成細(xì)密粉末，根據(jù)各組給藥劑量設(shè)定，每只試驗(yàn)龜按體質(zhì)量計(jì)算所需藥量，并精確稱量藥粉置于10 mL離心管中，用2 mL葡萄糖生理鹽水溶解，旋渦振蕩1 min制成懸濁液。利用2.5 mL無(wú)菌注射器和輸液軟管制成灌胃工具，經(jīng)胃插管灌胃給藥，管內(nèi)殘留物加2 mL葡萄糖生理鹽水二次沖洗，振蕩1 min后灌胃。試驗(yàn)前禁食24 h，給藥后8 h開(kāi)始喂食。

參考吡喹酮片獸用說(shuō)明書(shū)和海龜體內(nèi)驅(qū)蟲(chóng)效果[7]和藥動(dòng)學(xué)[10]研究的報(bào)道，以及上海海洋大學(xué)攀世水族寵物健康中心臨床驅(qū)蟲(chóng)實(shí)踐選定用量，試驗(yàn)分4組，每組設(shè)3個(gè)平行，每個(gè)平行用1只龜，分組和用藥情況見(jiàn)表1，胃插管灌胃吡喹酮操作見(jiàn)圖1。試驗(yàn)Ⅳ組于0、3、6 h采血后立即進(jìn)行灌胃給藥，每次劑量為10 mg/kg(體質(zhì)量)，累計(jì)劑量為30 mg/kg。

表1 吡喹酮對(duì)中華草龜代謝學(xué)影響試驗(yàn)的分組及灌胃給藥劑量

Tab.1 TurtleChinemysreevesiisgrouping and oral administration dose of praziquantel during the metabolic experiment

組別group龜編號(hào)turtle No.體質(zhì)量/kgbody weight給藥量/mgdrug amount劑量/(mg·kg-1體質(zhì)量)dose試驗(yàn)Ⅰ組單次給藥雌龜組A10.66820.0430A20.70621.1830A30.70421.1230試驗(yàn)Ⅱ組單次給藥雄龜組B10.2848.5230B20.3029.0630B30.3309.9030試驗(yàn)Ⅲ組單次給藥雄龜組B40.4246.3615B50.4466.6915B60.3785.6715試驗(yàn)Ⅳ組3次給藥雌龜組A40.7427.42×310A50.8368.36×310A60.8128.12×310

1.2.2 采樣 采用背頸靜脈竇連續(xù)采血法，在給藥前0 h和給藥后0.5、1、3、6、12、24、48、72、96 h共10個(gè)采樣時(shí)間點(diǎn)，從每只龜?shù)谋愁i靜脈竇中連續(xù)采集血樣(圖2)，每次采血量為0.5～1 mL,置于含肝素鋰的2 mL抗凝管中，混勻，置于碎冰上，并在收集后15 min內(nèi)于4 ℃下以10 000 r/min高速離心5 min，分離取血漿置于2 mL離心管中，標(biāo)號(hào)，-40 ℃下凍存待測(cè)。

1.2.3 樣品前處理 樣品前處理方法參考文獻(xiàn)[10-11]并稍做修改。取-40 ℃下冷凍保存的血漿于室溫下自然解凍,用移液器準(zhǔn)確吸取500 μL于10 mL離心管中，加入5 mL 100%乙酸乙酯進(jìn)行萃取，漩渦混勻3 min，再以4500 r/min(4 ℃)離心10 min，吸取上清液于15 mL干凈離心管內(nèi)，向剩余殘?jiān)屑尤? mL乙酸乙酯二次萃取，漩渦振蕩3 min，以4500 r/min(4 ℃)離心10 min，吸取上清液合并到15 mL離心管中，混勻，將萃取液在(40±5)℃氮?dú)庀抡舭l(fā)至干。將殘余物復(fù)溶于500 μL乙腈中, 漩渦混勻3 min，并超聲處理5 min，再加超純水定容至1 mL，漩渦混勻3 min，以4500 r/min(4 ℃)離心5 min，用1 mL滅菌注射器吸取上清液過(guò)0.22 μm濾膜轉(zhuǎn)移至進(jìn)樣瓶中，上機(jī)測(cè)定或-40 ℃下保存待測(cè)。

1.2.4 測(cè)定條件 色譜條件：色譜柱Thermo Scientific Hypersil GOLD C18(2.1 mm×150 mm,5 μm)，柱溫為40 ℃，進(jìn)樣量為2 μL； 流動(dòng)相A為水(含0.1%甲酸),B為甲醇。梯度洗脫程序：0～0.5 min,30%B；0.5～2 min,30%B～98%B；2～5 min,98%B,保持3 min；流速為0.2 mL/min。

質(zhì)譜條件：采用大氣壓電噴霧離子源(ESI),噴霧電壓為3.5 kV,離子傳輸毛細(xì)管溫度為325 ℃,碰撞氣氬氣壓力為2.0 mTorr，鞘氣流量為10 L/min，輔助氣流量為30 L/min；采用選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(SRM),吡喹酮母離子為313 m/z,定量子離子為203 m/z,碰撞能量為13 eV。

1.2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線和回收率 稱取吡喹酮標(biāo)準(zhǔn)品10 mg溶于甲醇水溶液(體積比4∶1)中,配制成100 μg/mL吡喹酮標(biāo)準(zhǔn)品母液,4 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：將100 μg/mL吡喹酮標(biāo)準(zhǔn)品母液依次稀釋成1.0、0.5、0.2、0.1、0.05 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)工作液,過(guò)0.22 μm濾膜,利用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(LC-MS)進(jìn)行測(cè)定。用Xcalibur軟件統(tǒng)計(jì)得到吡喹酮標(biāo)準(zhǔn)工作曲線和回歸方程。

回收率、精密度的測(cè)定:取500 μL空白血漿,分別加入10.0、1.0、0.1 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)品工作液0.1 mL,按“1.2.3”節(jié)方法處理樣品,最終配制成1.0、0.1、0.01 μg/mL 3個(gè)高、中、低質(zhì)量濃度的加標(biāo)樣品，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)平行，使用LC-MS進(jìn)行測(cè)定,得到實(shí)測(cè)濃度并計(jì)算回收率，即相對(duì)回收率=樣品實(shí)測(cè)濃度/樣品理論濃度×100%。

將上述加標(biāo)樣品在1 d內(nèi)的3個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)分別上機(jī)重復(fù)檢測(cè),并連續(xù)3 d進(jìn)行測(cè)定,然后計(jì)算求得血漿樣品中吡喹酮的日內(nèi)和日間平均變異系數(shù),以衡量檢測(cè)方法和儀器的精密度。

變異系數(shù)(CV)=S/X×100%。

其中：S為標(biāo)準(zhǔn)偏差；X為平均值。

1.2.6 灌胃吡喹酮對(duì)中華草龜不良反應(yīng)的評(píng)價(jià) 試驗(yàn)動(dòng)物在給藥后會(huì)出現(xiàn)明顯的不良反應(yīng)，表現(xiàn)為攝食能力和運(yùn)動(dòng)能力下降，后肢拖行或踹尾等行為異常，精神狀態(tài)變差，嚴(yán)重者甚至死亡。按不良反應(yīng)嚴(yán)重程度劃分為5個(gè)評(píng)價(jià)等級(jí)(表2)。

表2 吡喹酮對(duì)中華草龜?shù)牟涣挤磻?yīng)評(píng)價(jià)等級(jí)和行為特征

Tab.2 Evaluation of adverse reactions and behavioral characteristics of each level of praziquantel against turtleChinemysreevesiis

等級(jí)degree行為特征behavioral characteristics4攝食不佳,運(yùn)動(dòng)障礙,精神沉郁,一個(gè)月內(nèi)死亡3攝食不佳,運(yùn)動(dòng)障礙,精神沉郁,一個(gè)月后死亡2攝食正常,后肢運(yùn)動(dòng)障礙且難以恢復(fù),精神尚可1攝食正常,后肢運(yùn)動(dòng)障礙但可恢復(fù),精神尚可0攝食良好,運(yùn)動(dòng)正常,精神佳

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010軟件繪制藥時(shí)曲線；采用 Kinetic 4.4藥代分析軟件進(jìn)行藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)的擬合和計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

2.1 吡喹酮標(biāo)準(zhǔn)工作曲線、回收率與精密度

本試驗(yàn)中采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測(cè)定中華草龜體內(nèi)吡喹酮的藥物濃度,在測(cè)定條件下吡喹酮約在4.40 min時(shí)出峰, 基線平穩(wěn)，峰形對(duì)稱,藥峰與雜峰分離良好(圖略), 在血液中的定量限為0.002 μg/mL,故該方法可作為本試驗(yàn)中檢測(cè)樣品的有效方法。

以藥物濃度為橫坐標(biāo)(x, μg/mL)、峰面積為縱坐標(biāo)[y,μg/(mL·h)]建立標(biāo)準(zhǔn)曲線圖(略)。標(biāo)準(zhǔn)工作曲線方程為y=113807+4.75727×106x，R2=0.9996,在濃度為0.01～1.00 μg/mL時(shí)線性關(guān)系良好。

通過(guò)測(cè)定1.0、0.1、0.01 μg/mL 3個(gè)高、中、低質(zhì)量濃度的加標(biāo)樣品,計(jì)算所得到的吡喹酮的平均回收率為(98.7±1.2)%，日內(nèi)和日間平均變異系數(shù)均小于10%。

2.2 吡喹酮在中華草龜體內(nèi)的藥時(shí)曲線和藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)

每個(gè)試驗(yàn)組分別有3個(gè)平行，計(jì)算每個(gè)采血點(diǎn)各試驗(yàn)組的平均血藥濃度和標(biāo)準(zhǔn)差，雙峰效應(yīng)的首峰位于0.5 h(試驗(yàn)Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ組)和3 h(試驗(yàn)Ⅲ組)，第二峰位于12 h(試驗(yàn)Ⅰ組和Ⅳ組)和72 h(試驗(yàn)Ⅱ組和Ⅲ組) (表3)，根據(jù)平均血藥濃度與時(shí)間的關(guān)系繪制吡喹酮的藥時(shí)曲線圖(圖3)。使用Kinetic 4.4藥代分析軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行模型擬合，得到主要的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)(表4)，灌胃吡喹酮在中華草龜體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)特征均適合用一室開(kāi)放模型來(lái)描述。

表3 中華草龜體內(nèi)吡喹酮的平均血藥濃度Tab.3 Average concentration of praziquantel in blood of turtle Chinemys reevesiis μg/mL

表4 中華草龜體內(nèi)吡喹酮的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)Tab.4 Pharmacokinetic parameters of praziquantel in turtle Chinemys reevesiis

注：同行中標(biāo)有不同字母者表示組間有顯著性差異(P<0.05)，標(biāo)有相同字母者表示組間無(wú)顯著性差異(P>0.05)

Note:The means with different letters within the same line are significantly different among the groups at the 0.05 probability level, and the means with the same letters within the same line are not significant differences

2.3 灌胃吡喹酮對(duì)中華草龜不良反應(yīng)的評(píng)價(jià)

2.3.1 30 mg/kg劑量組單次灌胃給藥試驗(yàn) 按該劑量單次灌胃給藥后，試驗(yàn)Ⅰ組的3只雌龜(A1、A2、A3)和試驗(yàn)Ⅱ組的3只雄龜(B1、B2、B3)，24 h內(nèi)出現(xiàn)了強(qiáng)烈的不良反應(yīng)，共同癥狀表現(xiàn)為精神狀態(tài)不佳，神情呆滯，頭腳及四肢蜷縮不動(dòng)，運(yùn)動(dòng)失調(diào)，后肢嚴(yán)重?zé)o力，幾乎失去運(yùn)動(dòng)能力，但后肢有反射和痛覺(jué)，拉伸可回縮，運(yùn)動(dòng)時(shí)前肢劃水，后肢或蜷縮或拖地，后肢踹尾巴等異常行為，病情嚴(yán)重者食欲廢絕。

在給藥后96 h時(shí)，試驗(yàn)Ⅰ組3只雌龜后肢開(kāi)始逐漸恢復(fù)運(yùn)動(dòng)能力，但食欲和運(yùn)動(dòng)力較試驗(yàn)前的健康狀態(tài)明顯下降。其中雌龜A1在給藥后第15天時(shí)死亡；A3于給藥后第35天時(shí)死亡，剖檢發(fā)現(xiàn)，A1、A3兩只龜?shù)母闻K、腎臟等均有明顯病變壞死；A2在康復(fù)期間病情不穩(wěn)定，出現(xiàn)呼吸困難、攝食無(wú)力等癥狀，于第20天時(shí)轉(zhuǎn)危為安，攝食運(yùn)動(dòng)能力正常，較試驗(yàn)前狀態(tài)活躍度變差。

試驗(yàn)Ⅱ組雄龜組對(duì)吡喹酮的不良反應(yīng)較試驗(yàn)Ⅰ組雌龜組癥狀更加明顯和嚴(yán)重，運(yùn)動(dòng)時(shí)后肢始終蜷縮或拖行，未見(jiàn)好轉(zhuǎn)。給藥后第28天時(shí)雄龜B1死亡，剖檢結(jié)果與試驗(yàn)Ⅰ組基本一致，主要病變?yōu)楦闻K變性，局部壞死，腎臟腫大，顏色呈淡黃色，結(jié)構(gòu)不規(guī)整，后肢分布大量黑色變性脂肪，肌肉萎縮；B3于第41天瀕死狀態(tài)下剖檢，癥狀基本相同；B2攝食正常，自主攝食龜糧，但是后肢運(yùn)動(dòng)功能始終未恢復(fù)。

2.3.2 15 mg/kg劑量組單次灌胃給藥試驗(yàn) 按該劑量單次灌胃給藥后，試驗(yàn)Ⅲ組試驗(yàn)龜(B4、B5、B6)24 h內(nèi)未見(jiàn)明顯異常。給藥后雄龜B5于25 h出現(xiàn)了類似2倍劑量組的不良反應(yīng)，后肢開(kāi)始拖行，拉伸無(wú)力，但仍有痛覺(jué)和反射，可回縮，攝食排便正常，精神尚可，但是后肢運(yùn)動(dòng)功能仍未恢復(fù)；B4于給藥后108 h出現(xiàn)與B5相同癥狀，給藥后第18天時(shí)翻缸溺水，剖檢發(fā)現(xiàn)其尚有氣息和心跳，其肝臟明顯腫大，表面分布大量沙粒大小的黃白色結(jié)節(jié)，腎臟腫大，膀胱尿充盈，有尿酸，肺臟和腸胃含有大量積水，確診是溺水，后肢基部脂肪變性呈黑色；B6拒食嗜睡，因疾病原因于第12天死亡。

2.3.3 總劑量30 mg/kg平分3次給藥試驗(yàn) 按每次10 mg/kg劑量灌胃給藥，給藥間隔3 h，試驗(yàn)Ⅳ組自第一次給藥后96 h內(nèi)，該組3只雌龜(A4、A5、A6)均無(wú)異常，攝食良好，攝食精準(zhǔn)，四肢運(yùn)動(dòng)正常。A4于第一次給藥后第8天時(shí)開(kāi)始出現(xiàn)呼吸困難，運(yùn)動(dòng)力下降，后肢運(yùn)動(dòng)力尚可，但明顯運(yùn)動(dòng)失衡，動(dòng)作笨拙，于第19天麻醉處死，剖檢發(fā)現(xiàn)其肝臟腫大，呈黃褐色，顏色分布不均上有白色條紋和結(jié)節(jié)，脾臟充血，四肢基部脂肪變性呈黑色；A5、A6雌龜行為表現(xiàn)正常。

綜上，各組中華草龜?shù)牟涣挤磻?yīng)評(píng)價(jià)等級(jí)如表5所示。

表5 吡喹酮對(duì)中華草龜?shù)牟涣挤磻?yīng)評(píng)價(jià)

Tab.5 Evaluation of adverse reactions of turtleChinemysreevesiisto praziquantel

組別group評(píng)價(jià)等級(jí)evaluation degree43210ⅠA1A3A2ⅡB1B3B2ⅢB4、B6B5ⅣA4(麻醉處死)A5、A6

3 討論

3.1 吡喹酮在中華草龜體內(nèi)的藥代動(dòng)力動(dòng)學(xué)特征和“雙峰效應(yīng)”

中華草龜灌胃吡喹酮，其藥代動(dòng)力學(xué)過(guò)程符合一室開(kāi)放模型，這與口服吡喹酮在絨山羊[12]、家兔[13]體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)特征模型基本相同。水牛按20 mg/kg(體質(zhì)量)單劑量?jī)?nèi)服吡喹酮片后，其血漿吡喹酮的Tmax、Cmax、AUC分別為(0.60±0.29)h、(0.57±0.37)μg/mL、(0.80±0.70)μg/(mL·h)[14]。草魚(yú)按10 mg/kg(體質(zhì)量) 單劑量口灌吡喹酮，其藥時(shí)數(shù)據(jù)符合二室開(kāi)放模型，Tmax、Cmax、AUC分別為1.0 h、0.41 μg/mL、46.39 μg/(mL·h)[15]。本試驗(yàn)中吡喹酮在中華草龜體內(nèi)的代謝有“雙峰效應(yīng)”，與透皮給藥吡喹酮在小鼠肝臟、脾和腎臟內(nèi)各出現(xiàn)兩個(gè)藥峰值的結(jié)果相似[16]。不同鹽酸氯苯胍(ROBH)口灌劑量在異育銀鯽血漿等組織中的藥時(shí)曲線也出現(xiàn)雙峰效應(yīng)[17]。本試驗(yàn)中第96 h各組試驗(yàn)龜血漿內(nèi)仍可檢測(cè)到吡喹酮(>LOQ)，其中，試驗(yàn)Ⅱ組、Ⅲ組雄性龜組的血藥濃度仍高于最低有效血藥濃度(0.20 μg/mL),說(shuō)明灌胃吡喹酮在中華草龜雄龜體內(nèi)代謝消除緩慢，藥物殘留時(shí)間長(zhǎng)。

3.2 中華草龜對(duì)吡喹酮的代謝和不良反應(yīng)因性別和給藥次數(shù)呈有明顯差異

本試驗(yàn)表明，中華草龜雌性相對(duì)于雄性對(duì)吡喹酮的吸收速率更快，但吸收程度相對(duì)較小，前者的機(jī)體清除率(CL)大于后者，滯留時(shí)間(MRT)小于后者，表明雌性龜對(duì)吡喹酮的消除速率更快，維持時(shí)間較短。兩組試驗(yàn)龜(試驗(yàn)Ⅰ、Ⅱ組)均出現(xiàn)了嚴(yán)重的不良反應(yīng)(100%)，臨床癥狀與剖檢結(jié)果基本吻合，說(shuō)明單次灌胃30 mg/kg吡喹酮對(duì)中華草龜是過(guò)量的，會(huì)造成組織器官嚴(yán)重病變。試驗(yàn)Ⅲ組劑量為試驗(yàn)Ⅱ組劑量的一半，即15 mg/kg，比較試驗(yàn)Ⅱ組和試驗(yàn)Ⅲ組的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，試驗(yàn)Ⅱ組的Cmax、AUC均明顯高于試驗(yàn)Ⅲ組,其他參數(shù)值相似，說(shuō)明灌胃吡喹酮在中華草龜體內(nèi)的Cmax、AUC隨劑量增加而增大，給藥濃度越大，則吸收水平越高，但達(dá)峰時(shí)間、吸收速率與消除速率基本不變。該組試驗(yàn)龜除B6(考慮自身疾病原因)外，其他兩只先后出現(xiàn)了后肢喪失運(yùn)動(dòng)能力的不良反應(yīng)，且幸存下來(lái)的B5目前仍沒(méi)有恢復(fù)后肢的運(yùn)動(dòng)力，瀕死龜剖檢結(jié)果與試驗(yàn)Ⅱ組基本一致，表明15 mg/kg吡喹酮單次灌胃對(duì)中華草龜仍屬過(guò)量。

試驗(yàn)Ⅳ組分3次灌胃與試驗(yàn)Ⅰ組進(jìn)行比較，總給藥量均為30 mg/kg時(shí)，達(dá)峰時(shí)間Tmax相近， 試驗(yàn)Ⅳ組的Cmax與AUC均小于試驗(yàn)Ⅰ組，但Ka、MRT較大，Kel較小，說(shuō)明吸收更快，消除較慢，機(jī)體內(nèi)滯留時(shí)間更長(zhǎng)，藥效更持久。該組僅一只試驗(yàn)龜出現(xiàn)不良反應(yīng)，由于試驗(yàn)需要麻醉處死，該龜死前后肢運(yùn)動(dòng)力下降但尚存，不排除自身恢復(fù)的可能性，其他兩只龜較為健康。芬苯達(dá)唑會(huì)造成赫爾曼陸龜短暫的低血糖、高尿酸血癥等病癥[18]，紅耳巴西龜注射0.3 mg/kg伊維菌素會(huì)產(chǎn)生中毒反應(yīng),36 h內(nèi)死亡[19]。小鼠口服吡喹酮片劑有時(shí)會(huì)出現(xiàn)心動(dòng)過(guò)緩、房顫等副作用[16]。本試驗(yàn)中，單劑量灌胃30、15 mg/kg吡喹酮對(duì)中華草龜均產(chǎn)生了明顯的不良反應(yīng)，組織器官明顯病變壞死，與大鼠口服1500 mg/kg吡喹酮的結(jié)果[20]相似。但海龜口服吡喹酮治療扁鉤蟲(chóng)時(shí)并未觀察到肝臟明顯病變[7]。

3.3 灌胃吡喹酮對(duì)中華草龜體內(nèi)驅(qū)蟲(chóng)劑量和臨床應(yīng)用建議

龜鱉臨床驅(qū)蟲(chóng)常用的驅(qū)蟲(chóng)藥主要包括吡喹酮[7-10]、甲硝唑[21]、芬苯達(dá)唑[22]、奧芬達(dá)唑[23]、伊維菌素、阿維菌素等,也有學(xué)者強(qiáng)烈推薦中草藥驅(qū)蟲(chóng)[24]。在本試驗(yàn)條件下，中華草龜按10 mg/kg(體質(zhì)量)劑量，雌龜每間隔3 h灌胃給藥吡喹酮3次, 累計(jì)給藥30 mg/kg，具有低毒性，且能夠較長(zhǎng)時(shí)間維持有效血藥濃度。龜鱉臨床上使用吡喹酮驅(qū)蟲(chóng)時(shí)，推薦中華草龜單次灌胃劑量為10 mg/kg以下，如果需要提高劑量，可以多次給藥，雌龜控制在連續(xù)3次以內(nèi)，也可供其他龜類用藥參考。