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    嗜水氣單胞菌穿梭質(zhì)粒載體p BKPU01的構(gòu)建、表達(dá)和鑒定

    2020-03-18 16:34:08張小蒙
    江蘇科技信息 2020年1期
    關(guān)鍵詞:線性化水氣單胞菌

    張 莉,張小蒙

    (江蘇醫(yī)藥職業(yè)學(xué)院藥學(xué)院,江蘇鹽城 224005)

    0 引言

    嗜水氣單胞菌廣泛分布于自然界的各種水體,是多種水生動(dòng)物的原發(fā)性致病菌[1],為條件致病菌,是典型的人-獸-魚(yú)共患病病原菌[2],嗜水氣單胞菌的變異菌株較多,多數(shù)菌株對(duì)氟哌酸、菌必治敏感,嗜水氣單胞菌表現(xiàn)多種抗性[3],其中一個(gè)主要原因是含有多種質(zhì)粒[4]。本實(shí)驗(yàn)室從嗜水氣單胞菌中分離得到一種質(zhì)粒,命名為質(zhì)粒pBK760,該質(zhì)粒具有多種位點(diǎn)和抗性,具有良好的載體特征。

    pMD20是一種高效克隆PCR產(chǎn)物的專(zhuān)用載體[5]。該載體以pUC19載體為基礎(chǔ),在其多克隆位點(diǎn)處的Xba I和BamH I位點(diǎn)之間增加了Spe I,Nde I,EcoRV3種酶切位點(diǎn),經(jīng)EcoR V酶切后再在兩側(cè)的3’端添加“T”制備而成[6]。因大部分耐熱性DNA聚合酶進(jìn)行PCR反應(yīng)時(shí)都有在PCR產(chǎn)物的3’端添加一個(gè)“A”的特性,可以大大提高PCR產(chǎn)物的連接、克隆效率[7]。

    雖然質(zhì)粒pBK760和pMD20均可單獨(dú)作為載體來(lái)使用,但是如果可以將其優(yōu)點(diǎn)相結(jié)合,就可以發(fā)揮它們各自的優(yōu)勢(shì),本實(shí)驗(yàn)就結(jié)合質(zhì)粒pBK760和pMD20兩方面的優(yōu)點(diǎn),利用現(xiàn)代技術(shù)構(gòu)建了一種全新的穿梭質(zhì)粒載體(pBKPU01),便于開(kāi)展相關(guān)基因功能研究和遺傳育種工作。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 質(zhì)粒和載體

    質(zhì)粒pBK760由本實(shí)驗(yàn)室從嗜水氣單胞菌中分離并保存,pMD20購(gòu)自大連寶生物。

    1.1.2 主要試劑

    限制性?xún)?nèi)切酶、Taq DNA聚合酶、T4 DNA連接酶、DNA Marker均購(gòu)自大連寶生物;凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自上海生工;其他常規(guī)試劑為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純。

    1.2 引物設(shè)計(jì)與合成

    根據(jù)質(zhì)粒pBK760序列,采用Oligo 6.0軟件設(shè)計(jì)1對(duì)特異性引物P1、P2,上游引物P1序列為:ATCGTCGACCCTCTAGATGCAG,下游引物P2序列為:CTGACTCTAGCAGGTCGAGGAT。引物由上海生工合成。

    1.3 質(zhì)粒pBK760的提取

    挑取嗜水氣單胞菌單菌落,接種于5mL含50ug/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中,37℃培養(yǎng)12 h。菌液用質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒提取質(zhì)粒pBK760,-20℃儲(chǔ)存待用。

    1.4 質(zhì)粒pBK760線性化

    以質(zhì)粒pBK760為模板,通過(guò)設(shè)定引物(P1和P2)進(jìn)行PCR,使環(huán)狀質(zhì)粒pBK760線性化,PCR的具體反應(yīng)條件如表1所示。

    反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s,72℃ 4.5 min,32循環(huán);72℃延伸10 min;4℃保存。PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定,將檢驗(yàn)正確的片段純化回收。

    1.5 質(zhì)粒pBK760和載體pMD20的連接

    將線性化質(zhì)粒pBK760和載體pMD20進(jìn)行連接,反應(yīng)體系如表2所示。

    操作步驟如下:16℃連接過(guò)夜,取2.5μL連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化50μL E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞,取100μL菌液涂布含有100μg/mL氨芐青霉素的LB平板進(jìn)行藍(lán)白斑篩選。挑取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子,轉(zhuǎn)入5 mL含100μg/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基,37℃培養(yǎng)12 h,用質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒提取質(zhì)粒,獲得穿梭質(zhì)粒載體pBKPU01。

    表1 質(zhì)粒p BK760線性化PCR反應(yīng)具體條件

    表2 質(zhì)粒p BK760和載體p MD20連接體系

    1.6 轉(zhuǎn)化、酶切驗(yàn)證和分析

    制備嗜水氣單胞菌感受態(tài)細(xì)胞,用電轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞[8],用質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒提取質(zhì)粒,通過(guò)HindⅢ和EcoRⅠ進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證。結(jié)果證明的確是質(zhì)粒pBKPU01,說(shuō)明構(gòu)建的穿梭載體pBKPU01能夠在嗜水氣單胞菌中復(fù)制表達(dá)。確定重組質(zhì)粒后進(jìn)行測(cè)序分析(華大基因),序列分析結(jié)果和質(zhì)粒pBK760序列相同,驗(yàn)證正確。

    2 結(jié)果

    2.1 PCR擴(kuò)增結(jié)果

    以P1、P2為引物,以質(zhì)粒pBK760為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,凝膠電泳結(jié)果如圖1所示,成功擴(kuò)增出長(zhǎng)度為3 817 bp的質(zhì)粒pBK760,與預(yù)期結(jié)果一致,可進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

    2.2 pBKPU01單、雙酶切鑒定

    對(duì)轉(zhuǎn)化并提取的質(zhì)粒pBKPU01通過(guò)HindⅢ和EcoRⅠ進(jìn)行單、雙酶切驗(yàn)證,酶切后均得到6 000 bp左右的片段,其他片段過(guò)小未能顯示,與預(yù)期結(jié)果一致,凝膠電泳結(jié)果如圖2所示。

    2.3 pBKPU01圖譜構(gòu)建

    以DNAMAN為工具[9],構(gòu)建pBKPU01圖譜,圖譜如圖3所示。該穿梭質(zhì)粒載體包括位于3 355~3 561的啟動(dòng)子位點(diǎn)、位于3 726~3 812的信號(hào)肽編碼基因、位于1 592~2 363的卡那霉素抗性基因、位于2531~2735的博來(lái)霉素抗性基因,位于347~676的lacZ基因以及位于1 833~2 693的氨芐青霉素抗性基因。

    3 討論

    圖1 質(zhì)粒p BK760經(jīng)PCR線性化后的凝膠電泳

    圖2 轉(zhuǎn)化E.coli DH5α后提取的穿梭質(zhì)粒載體p BKPU01單、雙酶切鑒定電泳

    圖3 穿梭質(zhì)粒載體p BKPU01圖譜

    嗜水氣單胞菌廣泛分布于自然界的各種水體,是多種水生動(dòng)物的原發(fā)性致病菌,為條件致病菌,是典型的人-獸-魚(yú)共患病病原菌,嗜水氣單胞菌的變異菌株較多,多數(shù)菌株對(duì)氟哌酸、菌必治敏感,嗜水氣單胞菌表現(xiàn)多種抗性,其中一個(gè)主要原因是含有多種質(zhì)粒,本實(shí)驗(yàn)室從嗜水氣單胞菌中分離得到一種質(zhì)粒,命名為質(zhì)粒pBK760,該質(zhì)粒具有多種位點(diǎn)和抗性,具有良好的載體特征。

    pMD20是一種高效克隆PCR產(chǎn)物的專(zhuān)用載體。該載體以pUC19載體為基礎(chǔ),在其多克隆位點(diǎn)處的Xba I和 BamH I位點(diǎn)之間增加了 Spe I,Nde I,EcoR V3種酶切位點(diǎn),經(jīng)EcoR V酶切后再在兩側(cè)的3’端添加“T”制備而成。因大部分耐熱性DNA聚合酶進(jìn)行PCR反應(yīng)時(shí)都有在PCR產(chǎn)物的3’端添加一個(gè)“A”的特性,可以大大提高PCR產(chǎn)物的連接、克隆效率[10-13]。

    雖然質(zhì)粒pBK760和pMD20均可單獨(dú)作為載體來(lái)使用,但是如果可以將其優(yōu)點(diǎn)相結(jié)合,就可以發(fā)揮它們各自的優(yōu)勢(shì),本研究就結(jié)合質(zhì)粒pBK760和pMD20兩方面的優(yōu)點(diǎn),利用現(xiàn)代技術(shù)構(gòu)建了一種全新的穿梭質(zhì)粒載體(pBKPU01),便于開(kāi)展相關(guān)基因功能研究和遺傳育種工作。

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