鳙魚(yú)和三文魚(yú)頭湯中不同粒徑膠粒的抗氧化活性

樂(lè)彩虹，蘇紅，陶寧萍, 2*

1(上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院，上海，201306)2(上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心，上海，201306)

鳙魚(yú)(Aristichthysnobilis)又名胖頭魚(yú)、花鰱、黑鰱，與鰱魚(yú)、草魚(yú)、青魚(yú)并稱我國(guó)四大家魚(yú)[1]，是中國(guó)特有的淡水經(jīng)濟(jì)魚(yú)類，有“水中清道夫”的雅稱[2]。鳙魚(yú)頭富含膠質(zhì)所以味道特別鮮美[3]，且其頭部腦髓和磷脂含量豐富，素有“鳙魚(yú)頭，肉饅頭”的說(shuō)法[1]。三文魚(yú)(SalmonSalar)，又名大馬哈魚(yú)、鮭魚(yú)、撒蒙魚(yú)，被國(guó)際美食界譽(yù)為“水中珍品”“冰海之皇”[4]，它的肉質(zhì)鮮美，營(yíng)養(yǎng)豐富，含有大量DHA和EPA等[5]。三文魚(yú)在加工過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生大量的副產(chǎn)物，如魚(yú)頭、魚(yú)皮和魚(yú)骨等，都有很高的利用價(jià)值，對(duì)三文魚(yú)副產(chǎn)物的再利用也越來(lái)越受到人們的重視[6]，但對(duì)魚(yú)頭的研究較少。

湯種類眾多、味道鮮美、制作便捷[7]。在熬煮過(guò)程中經(jīng)過(guò)一系列化學(xué)物理反應(yīng)，湯中的化學(xué)成分既有從食品中遷移的原始成分，也有原始成分通過(guò)相互作用形成的新成分，這些成分還可以通過(guò)分子間次級(jí)鍵相互作用形成新的超分子結(jié)構(gòu)[8]。湯中含有大量水溶性營(yíng)養(yǎng)成分，可以很容易被吸收，同時(shí)也具有各種生物活性。王莉嫦[9]以鯪魚(yú)下腳料為原料，熬煮得到的鯪魚(yú)湯營(yíng)養(yǎng)成分含量高，味道鮮美。徐紅梅[10]研究發(fā)現(xiàn)熬煮鳙魚(yú)湯2 h后組織中各營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的遷移總量達(dá)到最大值。蔣靜[11]研究發(fā)現(xiàn)在熬煮鯽魚(yú)湯過(guò)程中，粗蛋白、水溶性蛋白和氨基酸含量不斷增加。田沁等[12]利用電燉鍋熬制鰱魚(yú)頭湯，在一定條件下，熬制魚(yú)頭湯的營(yíng)養(yǎng)成分和風(fēng)味成分含量高。HONDA等[13]研究發(fā)現(xiàn)受試者攝取干鰹魚(yú)高湯4周后，視覺(jué)疲勞主觀癥狀能得到良好的改善。ISHIZAKI等[14]研究發(fā)現(xiàn)適量的干鰹魚(yú)高湯能有效改善受試者的不良情緒。黃國(guó)榕[15]和張勇[16]研究發(fā)現(xiàn)鯽魚(yú)湯具有治療肝硬化腹水作用和腎臟保護(hù)作用。ZHANG等[17]研究了鯽魚(yú)湯和黑魚(yú)湯的營(yíng)養(yǎng)成分和抗氧化能力，發(fā)現(xiàn)黑魚(yú)湯礦物質(zhì)含量高于鯽魚(yú)湯，但氨基酸總量和抗氧化能力低于鯽魚(yú)湯。

魚(yú)頭湯在熬煮的過(guò)程中會(huì)自組裝形成不同粒徑大小的微納膠粒，本文在前期優(yōu)化熬煮魚(yú)頭湯方式[18]的基礎(chǔ)上選取熬煮時(shí)間為150 min的鳙魚(yú)和三文魚(yú)頭湯，通過(guò)粗濾、離心、微濾和超濾不同方式處理得到不同粒徑大小膠粒的魚(yú)頭湯，采用馬爾文激光粒度分析儀測(cè)定其膠粒的粒徑分布，利用6種化學(xué)法研究魚(yú)頭湯中不同粒徑膠粒的體外抗氧化活性，以期為魚(yú)頭湯的精深加工提供理論依據(jù)，從而創(chuàng)造更大的經(jīng)濟(jì)效益。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本實(shí)驗(yàn)所用原料鳙魚(yú)頭、三文魚(yú)頭均購(gòu)自大連翔祥食品有限公司，捕撈于丹麥法羅群島。大豆油，市售。

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH)，無(wú)水乙醇，F(xiàn)eCl2，菲啰嗪(Ferrozine)，過(guò)硫酸鉀，磷酸鹽(PBS)緩沖液(pH=7.4，pH=6.6)，2,2′-二氮-雙(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)(2,2′-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS)，三羥甲基氨基甲烷(Tris)，HCl，鄰苯三酚，H2O2，水楊酸(CH3CH2OH-C7H6O3)，F(xiàn)eSO4，K4Fe(CN)6，F(xiàn)eCl3，三氯乙酸(TCA),均購(gòu)自上海麥克林生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

C21-WT2112T 美的電磁爐，廣東美的網(wǎng)絡(luò)科技有限公司；UV-2200 紫外分光光度計(jì)，美國(guó)Unico公司；SLFPTAD Synergy 多功能酶標(biāo)儀，美國(guó)伯騰儀器有限公司；MS2000 激光粒度分析儀，英國(guó)馬爾文儀器有限公司；TG16-WS 臺(tái)式高速離心機(jī)，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司；HWS-24 電熱恒溫水浴鍋，上海恒科學(xué)儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品生物學(xué)測(cè)量

抽取相近規(guī)格大小鳙魚(yú)、三文魚(yú)頭各25只，平均頭長(zhǎng)、頭寬、頭重見(jiàn)表1。置于-80 ℃冰箱中貯藏待用。

表1 鳙魚(yú)、三文魚(yú)頭的生物學(xué)測(cè)量(濕重, mean±SD,n=25)Table 1 The biochemical indicator of A.nobilis, SalmonSalar head

1.3.2 魚(yú)頭湯熬煮

參照QIAN等[19]的方法并稍作修改。鳙魚(yú)和三文魚(yú)頭流水解凍后去鰓，分別切成3 cm×3 cm×2 cm的小塊，洗凈備用。取(20±1)g市售大豆油倒入鍋中于電磁爐(120 ℃)上預(yù)熱30 s，加入魚(yú)頭塊(400±2)g，煎炸40 s。然后將煎炸魚(yú)頭塊與3.2 kg飲用水(魚(yú)水質(zhì)量比為1∶8)倒入不銹鋼鍋中大火熬煮((97±2)℃)至煮沸后，轉(zhuǎn)小火熬煮((90±2)℃)150 min后棄去魚(yú)頭塊即得鳙魚(yú)和三文魚(yú)頭湯。

1.3.3 魚(yú)頭湯膠粒粒徑分布

鳙魚(yú)和三文魚(yú)頭湯經(jīng)過(guò)濾紙粗濾除去不溶物即為原湯，原湯經(jīng)10 000 r/min離心15 min取上清液為離心樣品，離心樣品過(guò)0.45 μm水相濾膜為微濾樣品，微濾樣品經(jīng)100 kDa超濾膜得到超濾樣品，由此共制得4種不同粒徑大小的魚(yú)頭湯膠粒樣品。用MS2000激光粒度分析儀測(cè)定經(jīng)不同方式處理后的鳙魚(yú)和三文魚(yú)頭湯膠粒的平均粒徑。平均粒徑的分布主要通過(guò)表面積平均粒徑D(3,2)=(Σdi3/Σdi2)、體積平均粒徑D(4,3)=(Σdi4/Σdi3)、d(0.1)、d(0.5)和d(0.9)進(jìn)行評(píng)價(jià)(d(0.1)、d(0.5)和d(0.9)分別表示粒度范圍內(nèi)體積占顆?？傮w積的10%，50%和90%時(shí)的粒徑大小)。

1.3.4 魚(yú)頭湯膠粒DPPH·清除率測(cè)定

參照ABU BAKAR等[20]的方法并稍作修改。取不同粒徑的鳙魚(yú)和三文魚(yú)頭湯各1 mL，分別加入DPPH溶液(0.4 mg/mL)1 mL，混合均勻，室溫反應(yīng)30 min后，取200 μL于96孔板中，在酶標(biāo)儀517 nm處測(cè)其吸光值A(chǔ)1(此操作過(guò)程應(yīng)全程嚴(yán)密避光)。以等量的蒸餾水代替樣品溶液為空白組，測(cè)得吸光度A0，等量的蒸餾水代替DPPH溶液作為對(duì)照組，測(cè)得吸光度A2。DPPH·清除率計(jì)算如公式(1)：

(1)

1.3.5 魚(yú)頭湯膠粒Fe2+螯合能力測(cè)定

參照韓娜等[21]的方法并稍作修改。取不同粒徑的鳙魚(yú)和三文魚(yú)頭湯各1 mL，依次加入50 μL FeCl2(2 mmol/L)、200 μL Ferrozine(5 mmol/L)與2.75 mL蒸餾水混合搖勻，室溫下反應(yīng)10 min，562 nm處測(cè)得吸光值A(chǔ)1，以等量的蒸餾水代替樣品為空白組，測(cè)得吸光度A0，以等量的蒸餾水代替FeCl2為對(duì)照組，測(cè)得吸光度A2。Fe2+螯合能力的計(jì)算如公式(2)：

(2)

1.3.6 魚(yú)頭湯膠粒ABTS+·清除率測(cè)定

參照白海娜等[22]的方法并稍作修改。取5 mL ABTS溶液(7 mm)和88 μL過(guò)硫酸鉀溶液(140 mm)混合，并在室溫條件下避光放置12～16 h，作為ABTS+·儲(chǔ)備液，用蒸餾水稀釋ABTS+·儲(chǔ)備液至其在734 nm波長(zhǎng)的吸光度為0.700±0.005(大約稀釋50倍)，作為ABTS+·工作液。取ABTS自由基工作液4 mL，加入不同粒徑的鳙魚(yú)和三文魚(yú)頭湯各40 μL，室溫避光反應(yīng)10 min后在734 nm處測(cè)得吸光值A(chǔ)1，以等量的蒸餾水代替樣品為空白組，測(cè)得吸光度A0，以等量的蒸餾水代替ABTS工作液為對(duì)照組，測(cè)得吸光度A2。ABTS+·清除率的計(jì)算如公式(3)：

(3)

(4)

1.3.8 魚(yú)頭湯膠?！H清除率測(cè)定

參照LAI等[24]的方法并稍作修改。取不同粒徑的鳙魚(yú)和三文魚(yú)頭湯各1 mL，依次加入FeSO4、CH3CH2OH—C7H6O3、H2O2、H2O各1 mL，混勻啟動(dòng)反應(yīng)，在37 ℃培養(yǎng)箱中反應(yīng)30 min后取上清液在510 nm處測(cè)得吸光值A(chǔ)1，以等量的蒸餾水代替樣品為空白組，測(cè)得吸光度A0，以等量的蒸餾水代替H2O2溶液為對(duì)照組，測(cè)得吸光度A2，·OH清除率的計(jì)算如公式(5)：

(5)

1.3.9 魚(yú)頭湯膠粒總還原能力測(cè)定

參照陳靜等[25]的方法并稍作修改。取不同粒徑的鳙魚(yú)和三文魚(yú)頭湯各0.5 mL，加入2.5 mL PBS緩沖液(0.2 mol/L，pH=6.6)和2.5 mL K4Fe(CN)6(1%)混勻，在50 ℃的水浴中反應(yīng)20 min，迅速冷卻后加入2.5 mL TCA(10%)，混勻后在3 000 r/min下離心10 min，取上清液2 mL，加入2 mL H2O和1 mL FeCl3(0.1%)混勻，室溫放置10 min后于700 nm處測(cè)其吸光值。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(mean±SD)的形式表示。采用SPSS 16.0軟件，根據(jù)單因素方差(One-Way ANOVA)方法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性比較分析，P<0.05為數(shù)據(jù)之間存在顯著性差異。Origin 8.0(Origin Lab，USA)軟件用于處理和生成圖像。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同方式處理的魚(yú)頭湯膠粒粒徑分布

如果D(3,2)和D(4,3)的值接近，則顆粒的形狀將更加規(guī)則并且分布更加集中；如果值之間的差異很大，則分布將更寬。由表2可知，隨著處理方法的不同，鳙魚(yú)頭湯和三文魚(yú)頭湯形成膠粒的平均粒徑顯著變小，并且三文魚(yú)頭湯膠粒的平均粒徑大于鳙魚(yú)頭湯，可能與三文魚(yú)是海水魚(yú)，含有更高濃度的油脂有關(guān)。鳙魚(yú)和三文魚(yú)頭原湯膠粒的粒徑分布范圍比較大，10 000 r/min離心15 min后，鳙魚(yú)頭湯和三文魚(yú)頭湯膠粒的各粒徑參數(shù)都有顯著性變化(P<0.05)，說(shuō)明湯經(jīng)過(guò)離心之后平均粒徑顯著變小，在通過(guò)0.45 μm的濾膜微濾和100 kDa的超濾離心管超濾之后，較大的顆粒在膜過(guò)濾過(guò)程中被濾膜截留，而較小的顆粒則通過(guò)膜，平均粒徑變得非常小。所以，經(jīng)過(guò)不同方式處理后魚(yú)頭湯膠粒分布粒徑大小不同，這為之后研究魚(yú)頭湯中不同粒徑膠粒與其抗氧化活性之間的關(guān)系提供參考。

表2 不同方式處理的鳙魚(yú)和三文魚(yú)頭湯膠粒粒徑分布Table 2 Colloidal particle size distribution of A. nobilis and Salmon Salar head soup with different treatment methods

注：上標(biāo)小寫(xiě)字母表示不同處理方式之間具有顯著性差異，上標(biāo)大寫(xiě)字母表示不同魚(yú)湯之間具有顯著性差異，P<0.05

2.2 不同方式處理魚(yú)頭湯膠粒的抗氧化活性

DPPH·是一種穩(wěn)定的以氮原子為中心的自由基，它的穩(wěn)定性來(lái)源于空間障礙和3個(gè)苯環(huán)的共振穩(wěn)定作用，使夾在中間的氮原子上不成對(duì)的電子不能發(fā)揮電子成對(duì)作用[26]。DPPH的醇溶液為深紫色，在517 nm處有最大吸收峰，當(dāng)體系中存在自由基清除劑時(shí)，氮原子上的孤電子被配對(duì)，DPPH·便會(huì)被還原成黃色的DPPH-H非自由基的形式[27]。

圖1為不同處理方式的鳙魚(yú)和三文魚(yú)頭湯膠粒的DPPH·清除率。由圖1可知，處理方式不同，樣品的DPPH·清除率之間存在明顯差別。具體表現(xiàn)為鳙魚(yú)頭和三文魚(yú)頭原湯膠粒DPPH·清除率顯著高于離心、微濾和超濾魚(yú)頭湯(P<0.05)，并且經(jīng)過(guò)離心和微濾的魚(yú)頭湯膠粒DPPH·清除率顯著高于超濾后的魚(yú)頭湯(P<0.05)，這與分布的結(jié)果一致，表明在一系列處理過(guò)程中，大部分大顆粒物質(zhì)被截留，有效活性物質(zhì)也被截留，導(dǎo)致其DPPH·清除率減小。鳙魚(yú)頭和三文魚(yú)頭的原湯和微濾樣品膠粒DPPH·清除率不存在顯著性差別(P>0.05)，但離心和超濾樣品膠粒DPPH·清除率存在顯著性差別(P<0.05)，且2種魚(yú)頭湯膠粒DPPH·清除率均表現(xiàn)為原湯>離心>微濾>超濾。

圖1 不同處理方式的鳙魚(yú)和三文魚(yú)頭湯膠粒的DPPH·清除率Fig.1 DPPH free radical scavenging rate of A. nobilisand Salmon Salar head soup colloidal with differenttreatment methods注：上標(biāo)小寫(xiě)字母表示不同處理方式之間具有顯著性差異，上標(biāo)大寫(xiě)字母表示不同魚(yú)湯之間具有顯著性差異，P<0.05(下同)

圖2 不同處理方式的鳙魚(yú)和三文魚(yú)頭湯膠粒的清除率 scavenging rate of A. nobilis and Salmon Salarhead soup colloidal with different treatment methods

Fe2+能夠與抗氧化劑發(fā)生鰲合反應(yīng)[29]，避免了Fe2+與H2O2發(fā)生Fenton反應(yīng)而產(chǎn)生自由基，在反應(yīng)結(jié)束時(shí)，在反應(yīng)體系中加入Ferrozine試劑，沒(méi)有被螯合的Fe2+會(huì)與Ferrozine試劑反應(yīng)生成有色基團(tuán)，該有色基團(tuán)在563 nm處有強(qiáng)的吸收峰，從而能夠間接反映魚(yú)頭湯的抗氧化能力。

圖3為不同處理方式的鳙魚(yú)和三文魚(yú)頭湯膠粒的Fe2+螯合能力。由圖3可知，鳙魚(yú)頭原湯與離心魚(yú)頭湯膠粒Fe2+螯合能力不存在顯著性差異(P>0.05)，但都顯著性高于微濾與超濾魚(yú)頭湯(P<0.05)，微濾魚(yú)頭湯膠粒Fe2+螯合能力顯著性高于超濾魚(yú)頭湯(P<0.05)；不同粒徑的三文魚(yú)頭湯膠粒Fe2+螯合能力之間存在顯著性差異(P<0.05)。兩種魚(yú)頭湯膠粒Fe2+螯合能力均表現(xiàn)為原湯>離心>微濾>超濾。而且不同粒徑鳙魚(yú)頭湯膠粒Fe2+螯合能力均大于三文魚(yú)頭湯。ZHANG等[17]用同種方法測(cè)定了鯽魚(yú)湯和黑魚(yú)湯原湯經(jīng)過(guò)模擬體外消化后的抗氧化活性，經(jīng)對(duì)比可知，鳙魚(yú)頭湯Fe2+螯合率高于鯽魚(yú)湯(60.05%)和黑魚(yú)湯(43.48%)，但鯽魚(yú)湯和黑魚(yú)湯Fe2+螯合率高于三文魚(yú)頭湯。

圖3 不同處理方式的鳙魚(yú)和三文魚(yú)頭湯膠粒的Fe2+螯合率Fig.3 The Fe2+ chelation rate of A. nobilis and Salmon Salarhead soup colloidal with different treatment methods

ABTS+·是一種人工合成的自由基，其在氧化劑的作用下會(huì)生成綠色的陽(yáng)離子ABTS+·，該自由基在734 nm處有吸收峰[30]。若反應(yīng)體系中含有抗氧化劑，則會(huì)抑制ABTS+·的產(chǎn)生，從而間接反映樣品抗氧化能力的大小。

圖4為不同處理方式的鳙魚(yú)和三文魚(yú)頭湯膠粒的ABTS+·清除率。由圖4可知，鳙魚(yú)頭原湯膠粒ABTS+·清除率顯著性高于離心、微濾和超濾魚(yú)頭湯(P<0.05)，離心與微濾魚(yú)頭湯膠粒ABTS+·清除率無(wú)顯著性差異(P>0.05)，但都顯著高于超濾魚(yú)頭湯(P<0.05)；三文魚(yú)頭原湯、離心與微濾魚(yú)頭湯膠粒ABTS+·清除率不存在顯著差異(P>0.05)，但都顯著性高于超濾魚(yú)頭湯(P<0.05)。2種魚(yú)頭湯膠粒ABTS+·清除率均表現(xiàn)為原湯>離心>微濾>超濾，且不同粒徑鳙魚(yú)頭湯膠粒ABTS+·清除率均大于三文魚(yú)頭湯，這與鳙魚(yú)和三文魚(yú)頭湯膠粒的Fe2+螯合能力的結(jié)果一致。

圖4 不同處理方式的鳙魚(yú)和三文魚(yú)頭湯膠粒的ABTS+·清除率Fig.4 ABTS+· scavenging rate of A. nobilis and Salmon Salar head soup colloidal with different treatment methods

·OH能殺死紅細(xì)胞，降解DNA、細(xì)胞膜和多糖化合物[16]，它是迄今發(fā)現(xiàn)最活躍的自由基之一，可以快速有效的氧化幾乎所有化合物[32]。利用Fe2+與H2O2發(fā)生Fenton反應(yīng)而產(chǎn)生·OH[33]，它能夠與水楊酸反應(yīng)產(chǎn)生2,3-二羥基苯甲酸，其在510 nm處有最大吸收峰。

圖5為不同處理方式的鳙魚(yú)和三文魚(yú)頭湯膠粒的·OH清除率。由圖5可知，鳙魚(yú)頭原湯與離心魚(yú)頭湯膠粒·OH清除率不存在顯著性差異(P>0.05)，但都顯著高于微濾與超濾魚(yú)頭湯(P<0.05)，且微濾與超濾魚(yú)頭湯膠?！H清除率不存在顯著性差異(P>0.05)；三文魚(yú)頭原湯、離心與微濾魚(yú)頭湯膠?！H清除率不存在顯著性差異(P>0.05)，但都顯著性高于超濾魚(yú)頭湯(P<0.05)，且不同粒徑三文魚(yú)頭湯膠?！H清除率高于鳙魚(yú)頭湯。

圖5 不同處理方式的鳙魚(yú)和三文魚(yú)頭湯膠粒的·OH清除率Fig.5 The hydroxyl free radical scavenging rate of A. nobilis and Salmon Salar head soup colloidal with different treatment methods

樣品的抗氧化劑能使K4Fe(CN)6的Fe3+還原成Fe2+[KFe(CN)3]，F(xiàn)e2+進(jìn)一步和FeCl3反應(yīng)生成在700 nm處有最大吸光度的普魯士藍(lán)Fe4[Fe(CN)6]3，因此測(cè)定700 nm處的高低可以間接反映抗氧化劑的還原能力大小，吸光度越大，還原能力越強(qiáng)[34]。反應(yīng)式如下：

3K4Fe(CN)6+4FeCl3→Fe4[Fe(CN)6]3+12KCl

圖6為不同處理方式的鳙魚(yú)和三文魚(yú)頭湯膠粒的總還原能力。由圖6可知，鳙魚(yú)頭原湯與離心魚(yú)頭湯膠?？傔€原能力不存在顯著性差異(P>0.05)，但都顯著高于微濾與超濾魚(yú)頭湯(P<0.05)，且超濾魚(yú)頭湯膠粒顯著高于微濾魚(yú)頭湯(P<0.05)；三文魚(yú)頭原湯膠?？傔€原能力顯著性高于離心、微濾與超濾魚(yú)頭湯(P<0.05)，離心與微濾魚(yú)頭湯膠?？傔€原能力不存在顯著性差異(P>0.05)，但都顯著高于超濾魚(yú)頭湯(P<0.05)。而且不同粒徑三文魚(yú)頭湯膠粒的總還原能力均大于鳙魚(yú)頭湯，這與鳙魚(yú)和三文魚(yú)頭湯膠?！H清除率的結(jié)果一致。

圖6 不同處理方式的鳙魚(yú)和三文魚(yú)頭湯膠粒的總還原能力Fig.6 The total reducing power of A. nobilis and Salmon Salar head soup colloidal with different treatment methods

3 結(jié)論