直鏈淀粉晶種對(duì)淀粉回生的影響機(jī)制

朱碧驊，麻榮榮，田耀旗*

1(江南大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫，214122)2(江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無錫，214122)

糊化淀粉在冷卻和貯藏中，直鏈淀粉和支鏈淀粉通過氫鍵重新排列成有序微晶的過程，稱為淀粉回生(老化)，其實(shí)質(zhì)是淀粉分子鏈在氫鍵等分子間作用力的驅(qū)動(dòng)下從無序到有序的排列[1-2]。淀粉老化是導(dǎo)致市場上面包、蛋糕、米糕等米面制品風(fēng)味劣變，口感變差，貨架期縮短的主要原因[3]。目前對(duì)于回生的研究多集中于外源調(diào)控方面，缺乏回生不同階段間關(guān)系的解析[4-5]。直鏈淀粉主導(dǎo)的短期回生和支鏈淀粉主導(dǎo)的長期回生階段之間的關(guān)系問題，是米面制品抗回生技術(shù)調(diào)控的共性理論基礎(chǔ)。研究認(rèn)為短期回生為長期回生提供了“啟動(dòng)子”，但是由于回生體系復(fù)雜及研究手段局限，該理論尚未得到系統(tǒng)闡述。聚合物結(jié)晶的經(jīng)典動(dòng)力學(xué)模型指出，結(jié)晶包括成核、生長和形成完美晶體3個(gè)過程。在淀粉的重結(jié)晶體系中，回生的本質(zhì)也是成核和晶體生長的過程。因此，晶核是淀粉回生研究的切入點(diǎn)與重要因子，是回生共性理論突破的關(guān)鍵。

基于此，本文在大米淀粉回生過程中，添加短期回生階段形成的晶種，簡化回生研究體系，誘導(dǎo)淀粉長期回生。通過FTIR和13C CP/MAS NMR來探究其對(duì)淀粉長期回生的影響，以期揭示淀粉短期回生與長期回生階段之間的關(guān)聯(lián)性，豐富淀粉回生共性理論。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大米淀粉，江西金農(nóng)發(fā)展有限公司；正丁醇(分析純)，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；異戊醇(分析純)，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；濃H2SO4(分析純)，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；KBr(分析純)，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Nano Brook Omni型多角度粒度與高靈敏度Zeta電位分析儀，美國布魯克海文儀器公司；IS10傅里葉紅外光譜儀，美國Nicolet公司；AVIII 400 MHZ WB光譜儀，德國Bruker公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 直鏈淀粉晶種的制備及粒度測定

參考程科等[6]的方法并加以優(yōu)化，從大米淀粉(直鏈淀粉含量為12.2%)中提取直鏈淀粉。用去離子水配制200 g/L的淀粉乳，攪拌均勻后置于沸水浴中預(yù)糊化30 min，然后于121 ℃的高壓滅菌鍋中繼續(xù)糊化20 min。糊化完成后立即取出，分別在-80、-18、4和25 ℃環(huán)境中以不同的平均降溫速率(依次為6.71、3.00、1.78和0.75 ℃ /min)冷卻，降溫至25 ℃之后，轉(zhuǎn)移至25 ℃下保溫回生，冷卻和保溫回生過程持續(xù)12 h，制備獲得的樣品依次命名為RA-80、RA-18、RA4和RA25。上述4種樣品回生完成后干燥，研磨后過篩，用3.16 mol/L濃H2SO4配制固形物含量為10%的晶種酸解液，在45 ℃下攪拌水解7 d，離心洗滌至中性，將產(chǎn)物配成30 g/L的懸濁液保存得到直鏈淀粉晶種，依次命名為ACS-80、ACS-18、ACS4和ACS25。

將30 g/L直鏈淀粉晶種懸濁液稀釋至1 g/L，超聲10 min以破除顆粒團(tuán)聚。超聲完成后，立即轉(zhuǎn)到電位儀的樣品池中，進(jìn)行粒度測定。

1.3.2 無定形淀粉、回生淀粉的制備

將原淀粉配成100 g/L的淀粉乳，在沸水浴中加熱糊化30 min，然后立即轉(zhuǎn)移至60 ℃烘箱中烘干，研磨，過篩，得到無定形淀粉(AS)。

配制100 g/L的淀粉乳，置于沸水浴中糊化30 min，然后冷卻至60 ℃時(shí)，按7%的晶種添加量加入直鏈淀粉晶種并攪拌均勻。未添加晶種的原淀粉體系為空白對(duì)照組(kb)。所有的樣品貯藏在4 ℃下回生21 d后取出，烘箱烘干，研磨，過篩，置于密封袋中備用。空白對(duì)照組樣品命名為kb-21，添加ACS-80, ACS-18, ACS4和ACS25的回生淀粉依次命名為ACS-80-21, ACS-18-21, ACS4-21和ACS25-21。

1.3.3 直鏈淀粉干預(yù)下的回生淀粉的短程有序度及雙螺旋含量測定

采用FTIR測定回生淀粉的短程有序度。在紅外燈照射環(huán)境下，將回生淀粉樣品和預(yù)先磨細(xì)的溴化鉀以1∶20(質(zhì)量比)混合，用瑪瑙研缽研磨至合適粒度后，壓成厚薄適中的壓片。實(shí)驗(yàn)參數(shù)如下：掃描波長為4 000～ 400 cm-1，分辨率為4 cm-1，掃描次數(shù)為16，純KBr壓片為空白背景。使用OMNIC軟件對(duì)紅外光譜進(jìn)行去卷積處理。

利用13C CP/MAS NMR測定回生淀粉中雙螺旋含量。實(shí)驗(yàn)參數(shù)如下所示：儀器工作頻率為100.62 MHz，配有4 mm的雙共振探頭，以六甲基苯作校準(zhǔn)液，樣品采集時(shí)間為0.016 s，接觸時(shí)間1.6 ms，掃描次數(shù)1 600次。延遲時(shí)間2 s，轉(zhuǎn)速6 kHz。使用Excel、Origin和Peakfit軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 直鏈淀粉晶種粒度分析

動(dòng)態(tài)光散射(dynamiclight scattering,DLS)法根據(jù)激光照射溶液體系中做布朗運(yùn)動(dòng)的顆粒產(chǎn)生的動(dòng)態(tài)散射光來獲取粒徑信息。當(dāng)激光照射懸浮液時(shí)，其中的顆粒會(huì)使激光發(fā)生散射，顆粒受周圍分子的碰撞而發(fā)生布朗運(yùn)動(dòng)[7]。根據(jù)多普勒效應(yīng)，散射光頻率受入射光頻率影響，以其為中心隨機(jī)波動(dòng)，從而影響散射光強(qiáng)。一般來說，顆粒粒徑小，布朗運(yùn)動(dòng)速度快，散射光頻率變化快，散射光強(qiáng)波動(dòng)也快；反之，則慢。進(jìn)行相關(guān)函數(shù)運(yùn)算可得粒徑信息。

由DLS法得到的直鏈淀粉晶種的粒度結(jié)果如表1所示，ACS-80、ACS-18、ACS4及ACS25的平均粒度分別為438.61、303.78、246.42及279.43 nm，粒徑均為納米級(jí)。大米淀粉在已知谷物里顆粒最小，粒徑為4～9 μm，形狀為不規(guī)則多邊形。在加熱糊化過程中，淀粉分子鏈吸熱膨脹，變成無規(guī)則團(tuán)狀。在回生前加入的納米級(jí)的直鏈淀粉晶種，可以順利進(jìn)入其內(nèi)部，與淀粉分子鏈充分接觸，起到誘導(dǎo)作用。

表1 直鏈淀粉晶種的粒度參數(shù)Table 1 The particle size parameters of amylose crystal seeds

注：ACS-80、ACS-18、ACS4、ACS25：依次為在前期降溫環(huán)境溫度-80、-18、4、25 ℃下冷卻后經(jīng)處理制備得的直鏈淀粉晶種。同一行中具有不同小寫字母之間存在顯著差異(P<0.05)

2.2 直鏈淀粉晶種干預(yù)下的回生淀粉短程有序度分析

淀粉回生過程中形成的雙螺旋結(jié)構(gòu)構(gòu)成回生淀粉的短程有序結(jié)構(gòu)。本實(shí)驗(yàn)通過FTIR研究回生淀粉的短程有序結(jié)構(gòu)。由圖1-a可以看出，加入晶種后回生淀粉特征吸收峰沒有發(fā)生變化，說明在原淀粉中加入直鏈淀粉晶種不會(huì)改變回生淀粉的官能團(tuán)。

a-紅外光譜圖；b-去卷積圖；kb-21-未添加直鏈淀粉晶種的回生21d淀粉；ACS-80-21、ACS-18-21、ACS4-21、ACS25-21-依次為添加ACS-80、ACS-18、ACS4、ACS25的回生21d淀粉，下同圖1 直鏈淀粉晶種干預(yù)下的回生淀粉的傅里葉紅外光譜圖及去卷積圖Fig.1 The Fourier transform infrared spectroscopy and deconvolution graph of retrograded starch under the intervention of amylose crystal seeds

對(duì)回生淀粉的紅外光譜圖進(jìn)行去卷積處理，得到結(jié)果如圖1-b所示。1 047和1 022 cm-1分別代表淀粉的結(jié)晶區(qū)和無定形區(qū)，995 cm-1處的吸收峰則對(duì)應(yīng)羥基的彎曲振動(dòng)[8-9]。淀粉研究中常用1 047和1 022 cm-1的吸光度之比(1 047 cm-1/1 022 cm-1)及1 022 cm-1和995 cm-1的吸光度之比(1 022 cm-1/995 cm-1)表征淀粉的短程有序度。樣品紅外光譜去卷積之后的比值結(jié)果如表2所示。直鏈淀粉晶種干預(yù)下回生淀粉1 047/1 022 cm-1升高，1 022/995 cm-1降低。表明在回生過程中，直鏈淀粉晶種的添加提高了回生淀粉的短程有序度，促進(jìn)了淀粉的長期回生。此外，ACS4干預(yù)下的回生淀粉的短程有序度最高，促進(jìn)長期回生效果最顯著。原因可能是降溫速率快時(shí)，分子鏈遷移受阻礙，影響直鏈淀粉有序重排進(jìn)而影響晶種的結(jié)晶效果。但在單一貯藏溫度環(huán)境中，B-型淀粉的重結(jié)晶過程受到成核的強(qiáng)烈限制，在最適合成核溫度附近大米淀粉重結(jié)晶程度最高[10]，而其最適成核溫度為4℃，所以ACS4的結(jié)晶效果最好，其后依次為ACS25、ACS-18和ACS-80。結(jié)晶效果好的晶種在干預(yù)淀粉回生時(shí)可以起到更好的誘導(dǎo)作用，促進(jìn)淀粉長期回生。

表2 直鏈淀粉晶種干預(yù)下的回生淀粉的短程有序參數(shù)Table 2 The short-range ordered parameters of retrogradedstarch under the intervention of amylose crystal seeds

注：kb-21: 未添加直鏈淀粉晶種的回生21d淀粉；ACS-80-21、ACS-18-21、ACS4-21、ACS25-21：依次為加入ACS-80、ACS-18、ACS4、ACS25的回生21d淀粉;同一列中具有不同小寫字母之間表示存在顯著差異(P<0.05)

2.3 直鏈淀粉晶種干預(yù)下的回生淀粉雙螺旋含量分析

相較于X射線衍射所得的具有較大范圍(結(jié)晶度)的結(jié)構(gòu)信息，固態(tài)13C-核磁共振技術(shù)(13C-NMR)是對(duì)淀粉分子序列短距離范圍的探測，檢測范圍較窄。各種淀粉的核磁共振光譜圖相似，按化學(xué)位移分主要分為C1、C4、C2,C3,C5和C6四個(gè)區(qū)域。B-型淀粉雙螺旋結(jié)構(gòu)中具有兩個(gè)葡萄糖殘基，在C1區(qū)域中為雙重峰，如圖2所示。由于C1～C5信號(hào)的相對(duì)強(qiáng)度對(duì)施加的交叉極化接觸時(shí)間的持續(xù)時(shí)間不敏感，因此可以通過計(jì)算結(jié)晶區(qū)的峰面積與回生淀粉的峰面積之比得出樣品中結(jié)晶結(jié)構(gòu)的相對(duì)含量。

C4-PPA法中淀粉的核磁圖譜分成由雙螺旋結(jié)構(gòu)組成的結(jié)晶區(qū)和無定形區(qū)兩部分，而忽略了其中單螺旋結(jié)構(gòu)的存在，具有局限性。因此在本實(shí)驗(yàn)中，運(yùn)用差減法去除由于C1共振而在有序環(huán)境中產(chǎn)生的重疊的非晶信號(hào)，將回生淀粉的核磁共振光譜圖分解為無定形亞譜和結(jié)晶亞譜。由于C4區(qū)的峰較獨(dú)立，與其他峰不重疊，故差減法中常選擇其附近的點(diǎn)作為校準(zhǔn)參考點(diǎn)[11]。分別選取82，83，84和85 ppm為參考點(diǎn)，差減法得到的結(jié)晶亞譜如圖3所示。以85 ppm為參考點(diǎn)得到的結(jié)晶亞譜在一定區(qū)域中峰值強(qiáng)度比其他3個(gè)參考點(diǎn)得到的結(jié)晶亞譜強(qiáng)度高，所以選定85 ppm為參考點(diǎn)處理回生淀粉的核磁圖譜。

AS-無定形淀粉；kb-21-未添加直鏈淀粉晶種的回生21d淀粉；ACS-80-21、ACS-18-21、ACS4-21、ACS25-21-依次為添加ACS-80、ACS-18、ACS4、ACS25的回生21d淀粉圖2 回生淀粉樣品及無定形淀粉的原始13C CP/MAS圖譜Fig.2 Original 13C CP/MAS mapping of retrograded starch samples and amorphous starch

a-添加ACS-80的回生21d淀粉；b-添加ACS-18的回生21d淀粉；c-添加ACS4的回生21d淀粉；d-添加ACS25的回生21d淀粉；e-未添加直鏈淀粉晶種的回生21d淀粉圖3 分別以82、83、84和85 ppm為參考點(diǎn)用差減法得到的回生淀粉的結(jié)晶區(qū)亞譜Fig.3 The crystalline sub-spectra of retrograded starch was obtained by using spectral subtraction using 82，83，84 and 85 ppm as reference point, respectively

C1區(qū)域(94～ 105 ppm)中沒有來自其他碳位的重疊信號(hào)，鏈構(gòu)象和糖苷扭轉(zhuǎn)角之間關(guān)系更直觀，所以選擇C1區(qū)來計(jì)算淀粉樣品中的雙螺旋含量。C1區(qū)中結(jié)晶亞譜又分為單螺旋和雙螺旋兩部分，其中103 ppm處的峰為V-型結(jié)晶構(gòu)象峰，通過峰面積之比來求出單螺旋和雙螺旋相對(duì)比例。參考TAN等[11]的方法計(jì)算雙螺旋含量，結(jié)果見表3。由表3可以看出，與空白對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組的雙螺旋含量有所提高，表明直鏈淀粉晶種的干預(yù)可以促進(jìn)回生淀粉雙螺旋的形成。其原因是酸解法制備直鏈淀粉晶種過程中去除大部分無定形區(qū)，從而暴露出更多的結(jié)晶區(qū)，在加至原淀粉中干預(yù)回生的過程中，可以與原淀粉中支鏈淀粉外支鏈間快速重排，從而形成更多的雙螺旋結(jié)構(gòu)。其中添加ACS4的回生淀粉雙螺旋含量最高，其次是添加ACS25和ACS-18，最低的則為添加ACS-80的回生淀粉。這也說明ACS4結(jié)晶效果更好，其與支鏈淀粉外支鏈間重排阻力小，促進(jìn)雙螺旋形成效果更好。

表3 13C CP/MAS-NMR中各樣品C1峰面積及雙螺旋含量Table 3 The C1 peak area and double-helix content of samples in 13C CP/MAS-NMR

注：#kb-21未添加直鏈淀粉晶種的回生21d淀粉；ACS-80-21、ACS-18-21、ACS4-21、ACS25-21依次為加入ACS-80、ACS-18、ACS4、ACS25的回生21d淀粉

3 結(jié)論

通過酸解法制備的直鏈淀粉晶種，粒徑在200～450 nm。直鏈淀粉晶種導(dǎo)致大米淀粉長期回生過程中，回生淀粉的短程有序度提高、雙螺旋含量增加，表明短期回生中形成的晶核對(duì)長期回生起促進(jìn)作用。此外，淀粉短期回生階段降溫速率也會(huì)對(duì)回生晶核的形成及完善產(chǎn)生影響，進(jìn)而影響長期回生的程度。這種晶體協(xié)同增長現(xiàn)象，豐富了淀粉回生共性理論。