熒光定量PCR儀計量校準(zhǔn)結(jié)果的影響因素分析及控制

梁文 羅超 盛舒瑤/上海市計量測試技術(shù)研究院

0 引言

根據(jù)國家衛(wèi)健委發(fā)布的《新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案（試行第五版）》[1]，實時熒光RTPCR檢測被列為確診病例的兩種方法之一，該方法由于檢測時間短、成本低等特點(diǎn)[2]，已成為應(yīng)用最廣的確診新型冠狀病毒的方法。用實時熒光RTPCR法進(jìn)行疑似病例確診需要檢測到患者體內(nèi)含有新型冠狀病毒的特征基因，而特征基因的檢測有兩個重要的制約性條件：一是新型冠狀病毒核酸檢測試劑盒，二是檢測結(jié)果準(zhǔn)確可靠的熒光定量PCR儀（以下簡稱PCR儀）。為確保PCR儀檢測結(jié)果的準(zhǔn)確可靠，2015年發(fā)布了JJF 1527-2015《聚合酶鏈反應(yīng)分析儀校準(zhǔn)規(guī)范》[3]。上海市計量測試技術(shù)研究院是全國最早開展PCR儀計量校準(zhǔn)的單位之一，根據(jù)多年的經(jīng)驗積累，現(xiàn)就熒光定量PCR儀校準(zhǔn)過程的影響因素進(jìn)行探討。

1 溫度部分校準(zhǔn)的影響因素

溫度檢測計量器具通常由15個精密溫度傳感器、數(shù)據(jù)采集分析模塊組成，測溫范圍為0～120 ℃，測量不確定度U=0.10℃（k=2）。該裝置可實現(xiàn)靜態(tài)溫度測定、動態(tài)溫度跟蹤和多通路檢測，每個探頭的實時采集數(shù)據(jù)以曲線圖格式保存在磁盤中，并通過軟件解碼處理[4]。該裝置用于對PCR儀的溫度示值誤差、溫度均勻度、平均升降溫速率、樣本示值誤差等溫度指標(biāo)進(jìn)行校準(zhǔn)。

溫度探頭貼合性的影響：測溫探頭的外觀應(yīng)該和PCR反應(yīng)孔的外觀一致，尺寸誤差小于1 mm。市場上在售PCR儀的廠家和型號眾多，雖然反應(yīng)孔的大小有行業(yè)的統(tǒng)一規(guī)定，但反應(yīng)孔的高低有0.1 mL和0.2 mL兩種不同的型號。不同廠家，甚至同一個廠家不同型號的儀器有不同的樣品倉打開方式，都會對測溫探頭的貼合性提出新的挑戰(zhàn)。儀器校準(zhǔn)實施單位購買0.1 mL反應(yīng)孔適用的測溫探頭，當(dāng)檢測0.2 mL反應(yīng)孔時，應(yīng)在測溫探頭固定板上加蓋同等大小、高度適合的軟木塞，以便測溫探頭和反應(yīng)孔底部充分接觸。旋轉(zhuǎn)式樣品倉打開方式的儀器（如ABI公司的Quanstudio 12K），宜先將測溫探頭平穩(wěn)地放入儀器內(nèi)，再開啟儀器進(jìn)行測溫。避免開啟儀器后，將測溫探頭放入樣品托盤，旋轉(zhuǎn)進(jìn)入樣品倉。因為旋轉(zhuǎn)的過程不可控，易導(dǎo)致探頭和反應(yīng)孔對標(biāo)不準(zhǔn)，測溫探頭和儀器反應(yīng)孔貼合性差導(dǎo)致測溫不準(zhǔn)，嚴(yán)重情況可導(dǎo)致測溫探頭支撐板折斷。

2 核酸檢測部分校準(zhǔn)的影響因素

核酸定量檢測準(zhǔn)確性的校準(zhǔn)采用國家有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，要求相對擴(kuò)展不確定度小于5%。將標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)經(jīng)系列稀釋后配制成濃度范圍為 102～1010copies/μL的樣品，作為DNA模板配制PCR反應(yīng)體系，制備PCR儀校準(zhǔn)板，對定量PCR儀的樣本示值誤差、樣本線性等定量指標(biāo)進(jìn)行校準(zhǔn)。

2.1 核酸反應(yīng)試劑耗材的配套性影響

PCR反應(yīng)管/反應(yīng)板的配套性：不同型號儀器，除了有特定的0.1 mL或0.2 mL的容積的差別外，反應(yīng)蓋帽也有差異。例如：羅氏公司與ABI公司的反應(yīng)罐不同，部分國產(chǎn)公司的PCR儀蓋帽有明顯的弧度，不能良好配套可能導(dǎo)致PCR管蓋帽多余部分被105 ℃高溫的PCR儀熱蓋熔化。

PCR預(yù)混液中ROX校準(zhǔn)熒光劑的添加對定量結(jié)果準(zhǔn)確性的影響：由于不同廠家的儀器對預(yù)混液的選擇性不同，對同一臺儀器使用不同的PCR預(yù)混液得到的校準(zhǔn)結(jié)果會有差異。如TAKARA公司生產(chǎn)的PCR預(yù)混液帶有兩種ROX校準(zhǔn)熒光劑，本實驗室前期的工作經(jīng)驗顯示羅氏公司的儀器可以不使用ROX校準(zhǔn)熒光劑，而ABI公司的儀器不使用ROX校準(zhǔn)熒光劑會使實驗的重復(fù)性變差。

2.2 校準(zhǔn)用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的影響

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的均勻性、穩(wěn)定性、定值的可靠性直接影響核酸定量檢測的結(jié)果。大分子核酸和小分子的化學(xué)試劑不同，容易出現(xiàn)分散性差、易聚集的問題[5]，因此取樣稀釋時標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的均勻性會影響定量結(jié)果的準(zhǔn)確性。另外生物標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)穩(wěn)定性受溫度影響較大，保存時間較短或容易受到運(yùn)輸條件和反復(fù)凍融的影響，導(dǎo)致部分降解量值不準(zhǔn)確[6]。采用上海市計量測試技術(shù)研究院研制的國家二級標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)阪崎腸桿菌ITS基因檢測質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)GBW(E)100307，該標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)濃度為 75.1 ng/μL，2.2×1010copies/μL，相對擴(kuò)展不確定度Urel=2.8%（k= 2）。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)系列溶液配制的影響

稀釋操作的影響 ：應(yīng)嚴(yán)格按照 JJF 1527-2015《聚合酶鏈反應(yīng)分析儀校準(zhǔn)規(guī)范》的要求，用經(jīng)過計量檢定合格的電子天平進(jìn)行稱量和稀釋，而不應(yīng)該直接采用移液器進(jìn)行稀釋，移液器稀釋會大大增加核酸定量結(jié)果的不確定度。稀釋的過程中盡量采用10倍稀釋，不能采用1 000倍稀釋[7]。

稀釋緩沖液的影響：試驗發(fā)現(xiàn)，稀釋緩沖液對核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的穩(wěn)定性影響很大，特別是對于低濃度的核酸樣品。本實驗室分別用滅菌水和TE緩沖液（10 mM Tris-HCl，1 mM EDTA，pH=7.5）稀釋得到濃度為 440 000 copies/μL（樣品 1）和 220 000 copies/μL（樣品 2）標(biāo)準(zhǔn)溶液，在室溫分別放置 4 h、8 h、24 h 后，用熒光PCR儀檢測這兩種濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液的Ct值（擴(kuò)增循環(huán)數(shù)），數(shù)據(jù)見表1，結(jié)果顯示用滅菌水進(jìn)行稀釋的標(biāo)準(zhǔn)溶液的Ct值有明顯的滯后現(xiàn)象，建議采用TE緩沖液進(jìn)行稀釋。

表1 不同稀釋方式對核酸濃度的影響

2.4 PCR反應(yīng)體系配制的影響

市場上在售的PCR儀以96孔的居多，給96個反應(yīng)孔加液對操作人員加樣準(zhǔn)確性和重復(fù)性有較高的要求，不當(dāng)操作會影響校準(zhǔn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。建議操作時有條件的話盡量使用排槍加樣，減少單孔加樣的誤操作。反應(yīng)體系中DNA的體積占總體積的20%最佳，既避免DNA干擾物對實驗的抑制作用，又避免DNA溶液加樣量過少帶來的誤差。分兩步加樣，先統(tǒng)一加入除DNA外的反應(yīng)液成分，再加入不同濃度的核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和未知樣品。建議操作不熟練的校準(zhǔn)員，使用配制好并經(jīng)計量驗證的PCR校準(zhǔn)反應(yīng)板。

3 結(jié)語

綜上所述，開展熒光定量PCR儀校準(zhǔn)時，即使按照規(guī)程規(guī)范操作，每個校準(zhǔn)環(huán)節(jié)中的影響因素也可能帶來誤差，校準(zhǔn)人員應(yīng)當(dāng)對校準(zhǔn)過程增加了解、熟悉操作，使校準(zhǔn)結(jié)果更加準(zhǔn)確可靠。當(dāng)前各校準(zhǔn)機(jī)構(gòu)都在積極投入疫情防控技術(shù)服務(wù)的工作，相信通過行業(yè)齊心協(xié)力，開展有效的經(jīng)驗分享和問題探討，提升工作效率和質(zhì)量，就能讓儀器更加精準(zhǔn)、數(shù)據(jù)更加可靠、質(zhì)量控制更好，為各檢驗機(jī)構(gòu)更加快速地實現(xiàn)新型冠狀病毒的確認(rèn)和打贏疫情防控阻擊戰(zhàn)作出計量人的貢獻(xiàn)。