響應(yīng)面法優(yōu)化采油用蠟狀芽孢桿菌發(fā)酵配方

馬 樂，羅梓軒，姬文鈺

（1.中國石油長慶油田分公司第一采油廠，陜西西安 710200；2.長慶化工集團(tuán)慶陽分公司，甘肅慶陽 715000；3.長慶（寧夏）精細(xì)化工有限公司，寧夏銀川 750000）

微生物采油技術(shù)是指將微生物注入油層，微生物在油層中生長及代謝作用于原油，改變?cè)偷囊恍┪锘再|(zhì)，從而提高原油采收率的技術(shù)[2]。該技術(shù)的采油機(jī)理是微生物能將石油烷烴作為碳源而生長繁殖，其生長代謝產(chǎn)生的酶可降解原油的組分，從而降低了原油黏度，增加了流動(dòng)性；產(chǎn)生的生物表面活性劑、有機(jī)溶劑、生物氣等通過改變油水界面張力、巖石的潤濕性，改善注入水的驅(qū)替效率，提高洗油效率；當(dāng)微生物在高滲地層生長繁殖達(dá)到一定數(shù)量，密集成團(tuán)、成膜或代謝產(chǎn)生的多糖類形成生物聚合物時(shí)，可選擇性堵塞微細(xì)孔道，改變水流方向，擴(kuò)大注水的掃油面積，提高波及系數(shù)，達(dá)到調(diào)剖作用，增加原油產(chǎn)量[3]。微生物采油技術(shù)具有成本低、適應(yīng)性廣和環(huán)保等特點(diǎn)[4]，因而越來越受到人們的重視，其應(yīng)用前景非常廣闊；目前微生物采油進(jìn)入了一個(gè)新的發(fā)展時(shí)期，微生物采油技術(shù)已在全球大量應(yīng)用[5-11]。

經(jīng)過前期的工作，從長慶采油一廠的油水樣中，分離并篩選得到了一株能高效降解石油烴類物質(zhì)的細(xì)菌，通過鑒定為蠟狀芽孢桿菌（Latin Name Bacillus cereus Frankland and Frankland）。該菌細(xì)胞呈直桿狀，有成鏈趨勢，革蘭氏染色陽性，周生鞭毛。屬于化能異養(yǎng)菌，在營養(yǎng)瓊脂固體培養(yǎng)基表面，菌落粗糙、暗白色、不透明。鄧振山等[11]研究報(bào)道過利用蠟狀芽孢桿菌及其代謝產(chǎn)物處理石油污染，降解率達(dá)到90.23 %。

培養(yǎng)基組分對(duì)微生物生長特別重要，對(duì)于微生物制劑而言，活菌數(shù)的含量是其質(zhì)量保證的重要因素之一。本文采用響應(yīng)面法對(duì)蠟狀芽孢桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化，確定了其最佳配方，為工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 材料及儀器

1.1.1 材料 蠟狀芽孢桿菌（km121），由本實(shí)驗(yàn)室分離并保存。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 牛肉膏、蛋白胨，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司生產(chǎn)；氯化鈉，天津市鼎盛鑫化工有限公司生產(chǎn)；瓊脂粉、氯化鈣，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)；鹽酸、氫氧化鈉，西隴化工股份有限公司生產(chǎn)；葡萄糖、硫酸銨，西安化學(xué)試劑廠；尿素，內(nèi)蒙古博大實(shí)地化學(xué)有限公司；硫酸鎂、磷酸二氫鈉，天津市科密歐化學(xué)有限公司；磷酸氫二鉀，天津市天力化學(xué)試劑有限公司。

1.1.3 儀器 干燥箱（型號(hào)為101A-1），中華人民共和國上海市實(shí)驗(yàn)儀器總廠生產(chǎn)；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（型號(hào)為DH-101-2BS），天津市中環(huán)實(shí)驗(yàn)電爐有限公司生產(chǎn)；實(shí)驗(yàn)室pH 計(jì)（型號(hào)為PHSJ-4A），上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司生產(chǎn)；立式壓力蒸汽滅菌鍋（型號(hào)為LDZH-75KBS），上海申安醫(yī)療器械廠生產(chǎn)；隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱（型號(hào)為PYX-DHS-40×50-BS-Ⅱ），上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司生產(chǎn)；臺(tái)式恒溫振蕩器（型號(hào)為THZ-82A），上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司生產(chǎn)；分析天平（型號(hào)為AL204），賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司生產(chǎn)。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 斜面培養(yǎng)基 牛肉膏3 g/L，蛋白胨10 g/L，氯化鈉5 g/L，瓊脂15 g/L，初始pH 值為6.8～7.2。

1.2.2 種子培養(yǎng)基 牛肉膏3 g/L，蛋白胨10 g/L，氯化鈉5 g/L，初始pH 值為6.8～7.2。

1.2.3 發(fā)酵培養(yǎng)基 葡萄糖20 g/L，尿素1 g/L，硫酸銨1 g/L，硫酸鎂1 g/L，磷酸二氫鈉2.5 g/L，磷酸氫二鉀0.5 g/L，酵母膏0.5 g/L，氯化鈣0.02 g/L。初始pH 值為6.8～7.2。

以上培養(yǎng)基滅菌條件均:121 ℃，20 min。

1.3 培養(yǎng)方法

1.3.1 種子活化 將蠟狀芽孢桿菌（km121）轉(zhuǎn)接到斜面培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)20 h。

1.3.2 種子培養(yǎng) 挑一環(huán)斜面種子接種于500 mL 三角瓶種子培養(yǎng)基中，裝液量為100 mL，37 ℃，120 r/min振蕩培養(yǎng)20 h。

1.3.3 發(fā)酵培養(yǎng) 將種子液以5 %接種量接種于三角瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中，裝液量為100 mL，37 ℃，120 r/min振蕩培養(yǎng)24 h。

1.4 Plackett-Burman 設(shè)計(jì)

采用Plackett-Burman 進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，篩選蠟狀芽孢桿菌（km121）基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中的顯著因子，對(duì)培養(yǎng)基的8 個(gè)組分，葡萄糖（A），尿素（B），硫酸銨（C），硫酸鎂（E），磷酸二氫鈉（F），磷酸氫二鉀（G），酵母膏（J），氯化鈣（K）進(jìn)行全面考察。選擇10 因子2 水平的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，增加2 個(gè)虛擬項(xiàng)D，H 來估計(jì)實(shí)驗(yàn)誤差，每個(gè)因子取高低2 個(gè)水平（見表1）。

1.5 爬坡實(shí)驗(yàn)

通過對(duì)1.4 的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，確定蠟狀芽孢桿菌（km121）基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基的主要因子，根據(jù)回歸方程和各因子的系數(shù)來確定主要因子的爬坡路徑和步長[12]。改變?nèi)N組分的質(zhì)量濃度，使其成梯度變化檢測發(fā)酵液活菌數(shù)量，快速確定最大響應(yīng)值的區(qū)域。

表1 Plackett-Burman 設(shè)計(jì)因子與水平

1.6 響應(yīng)面分析

通過1.5 的結(jié)果確定了影響蠟狀芽孢桿菌（km121）濃度的3 個(gè)主要因子，爬坡實(shí)驗(yàn)確定了3 個(gè)主要影響因子的響應(yīng)區(qū)域，采用Box-Behnken 的中心組合設(shè)計(jì)原理，設(shè)計(jì)3 因素3 水平的響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)，最終確定最佳發(fā)酵培養(yǎng)基組分。

1.7 蠟狀芽孢桿菌濃度測定方法

采用平板菌落計(jì)數(shù)法測發(fā)酵液濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 Plackett-Burman 設(shè)計(jì)

篩選顯著因子采用Plackett-Burman 設(shè)計(jì)對(duì)基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基的8 個(gè)組分進(jìn)行分析，各組分分別取高低2個(gè)水平（見表2），各因子水平方差分析結(jié)果（見表3）。

表2 Plackett-Burman 設(shè)計(jì)及響應(yīng)值

表3 Plackett-Burman 設(shè)計(jì)顯著因子分析

S=0.404 145 PRESS=23.52

R-Sq=99.98 % R-Sq（預(yù)測）=96.60 % R-Sq（調(diào)整）=99.74 %

利用Minitab16 軟件對(duì)表2 中的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得到回歸模型方差分析和各因素的主效應(yīng)結(jié)果（見表3），該模型的P 值為0.002＜0.05，說明該模型顯著，能較好擬合數(shù)據(jù)。由表3 中P 值的大小可以判定，培養(yǎng)基中各因子對(duì)蠟狀芽孢桿菌（km121）活菌數(shù)影響的重要性排序?yàn)镴＞B＞A＞F＞C＞E＞G＞K。虛擬項(xiàng)D、H 的P 值較大，說明不顯著，未知因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響較小。酵母膏、尿素和葡萄糖3 個(gè)因子的P 值均小于0.05，說明其對(duì)蠟狀芽孢桿菌（km121）活菌數(shù)有顯著影響，因此選定酵母膏、尿素和葡萄糖作為下一步實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵因素。

2.2 爬坡實(shí)驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)2.1 實(shí)驗(yàn)結(jié)果來設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果（見表4）。當(dāng)酵母膏濃度為1 g/L，尿素為1.5 g/L，葡萄糖濃度為20 g/L 時(shí)，活菌數(shù)達(dá)到最大值，所以以此為中心點(diǎn)進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)分析。

2.3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

利用Design Expert 軟件，根據(jù)Box-Behnken 中心組合設(shè)計(jì)原理，設(shè)計(jì)了3 因素3 水平的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及實(shí)驗(yàn)結(jié)果（見表5），將表5 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，獲得活菌數(shù)對(duì)編碼自變量酵母膏，尿素，葡萄糖的二次多項(xiàng)回歸方程：R1=50.06+1.74×A-0.11×B+1.71×C+0.075×A×B+0.25×A×C+2.42×B×C-0.86×A2-3.32×B2-2.27×C2

2.3.1 交互項(xiàng)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響

（1）酵母膏和尿素對(duì)菌濃的影響（見圖1）。

（2）酵母膏和葡萄糖對(duì)菌濃的影響（見圖2）。

（3）尿素和葡萄糖對(duì)菌濃的影響（見圖3）。

由圖1～圖3 可以看出，等高線為橢圓形，說明交互作用顯著。等高線的疏密可以看出酵母膏和尿素對(duì)菌濃的影響＞酵母膏和葡萄糖對(duì)菌濃的影響＞尿素和葡萄糖對(duì)菌濃的影響。

表4 爬坡實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表5 響應(yīng)面設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖1 響應(yīng)面法（酵母膏和尿素）立體分析及等高線圖

圖2 響應(yīng)面法（酵母膏和葡萄糖）立體分析及等高線圖

圖3 響應(yīng)面法（尿素和葡萄糖）立體分析及等高線圖

2.3.2 響應(yīng)面分析法對(duì)菌液濃度的ANOVA 分析（見表6）由表6 可知本實(shí)驗(yàn)相關(guān)系數(shù)為0.973 7，決定系數(shù)為0.920 8，說明因素水平選擇合理，二次多項(xiàng)回歸方程的P 值小于0.000 1，說明模型顯著，回歸方程失擬檢驗(yàn)P 值為0.564 5＞0.05，說明失擬項(xiàng)不顯著，未知因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果干擾小。擬合檢驗(yàn)顯著，說明所建立的模型是有效的與實(shí)際情況擬合，3 種參數(shù)對(duì)菌液濃度的影響是顯著的。

表6 響應(yīng)面分析法對(duì)菌液濃度的ANOVA 分析

2.4 最終優(yōu)化結(jié)果

為進(jìn)一步確定最佳點(diǎn)，利用Design Expert-8.0.6軟件程序?qū)ο灎钛挎邨U菌（km121）培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，可得最佳方案為：酵母膏為1.5 g/L，葡萄糖為22.67 g/L，尿素1.09 g/L。在此條件下，軟件程序?qū)Πl(fā)酵液活菌數(shù)的預(yù)測值為51.46×108cfu/mL。為了實(shí)際的操作方便，將葡萄糖改為22.7 g/L，尿素1.1 g/L，在此條件下實(shí)際實(shí)驗(yàn)值為51.2×108cfu/mL，絕對(duì)誤差為0.05 %。因此采用修正后的方法得到的提取參數(shù)準(zhǔn)確可靠，具有實(shí)用價(jià)值。

3 結(jié)論

該研究采用Plackett-Burman 設(shè)計(jì)從蠟狀芽孢桿菌（km121）基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中的8 個(gè)組分中篩選出3個(gè)顯著因子：葡萄糖（A）、尿素（B）和酵母膏（J），然后利用爬坡實(shí)驗(yàn)快速找到最大響應(yīng)區(qū)，并用響應(yīng)面分析法的Box-Behnken 設(shè)計(jì)確定顯著因子的最優(yōu)配比：酵母膏1.5 g/L，葡萄糖22.67 g/L，尿素1.09 g/L，最終確定了蠟狀芽孢桿菌（km121）的最優(yōu)培養(yǎng)基配方:葡萄糖22.7 g/L，尿素1.1 g/L，硫酸銨1 g/L，硫酸鎂1 g/L，磷酸二氫鈉2.5 g/L，磷酸氫二鉀0.5 g/L，酵母膏1.5 g/L，氯化鈣0.02 g/L，經(jīng)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果準(zhǔn)確可靠，具有實(shí)用價(jià)值，生物量比優(yōu)化前的33.2×108cfu/mL 提高了35.2 %，并且培養(yǎng)基成本低，成分簡單，適合大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)。