基于SSR分子標記對西瓜雜交種早佳8424純度的高通量鑒定

李寐華，楊 永，馬新力，張學軍，張 紅，張永兵，伊鴻平

(新疆農業(yè)科學院哈密瓜研究中心,烏魯木齊 830091)

0 引 言

【研究意義】雜種優(yōu)勢已廣泛應用于作物育種和農業(yè)生產中[1]。西瓜具有明顯的雜種優(yōu)勢，主要表現(xiàn)為植株長勢旺，果實品質好，產量高，抗病，抗逆性強等[2]，目前中國西瓜生產用種100%為雜交種[3]。雜交種子在生產過程中由于人工去雄不徹底、套帽夾花不嚴或機械混雜等，易導致?lián)饺肽副痉N子或外來雜種子[4,5]。雜交種子的純度和真實性是種子質量的重要指標，是決定西瓜生產產量和品質的重要保障，關系到種子銷售企業(yè)的品牌效益，雜交種子在銷售前進行純度和真實性鑒定,對滿足制種單位種子快速準確鑒定有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】目前隨機擴增多態(tài)性DNA標記(random amplified polymorphism DNA，RAPD)技術、相關序列擴增多態(tài)性(Sequence-related amplified polymorphism，SRAP)和簡單重復序列(simple sequence repeat，SSR) 技術等均已應用于西瓜雜交種純度鑒定[3,6～7]，其中SSR標記因其分布均勻、共顯性遺傳、操作簡單、穩(wěn)定性好等在雜交種純度鑒定方面的應用最為廣泛?！颈狙芯壳腥朦c】早佳8424西瓜是20世紀80年代培育的早熟、品質極佳且具有廣泛生態(tài)適應性的露地、設施兼可種植的雜交種。2018年全國種植面積約26.67×104hm2(400萬畝)。隨著早佳8424西瓜品種種植面積不斷擴大，種子需求量和制種面積不斷增加，種子真實性和純度的高通量快速準確鑒定成為制種單位的迫切需求。早佳8424西瓜種子純度的傳統(tǒng)鑒定主要依據(jù)田間形態(tài)學鑒定，即F1雜交種果皮為綠底墨綠色條帶，而母本果皮為淺綠底核桃紋條帶。傳統(tǒng)鑒定需要品種特異農藝性狀表現(xiàn)出來才能進行鑒別，較為費時費力，且受季節(jié)限制，易受環(huán)境因素影響?！緮M解決的關鍵問題】利用早佳8424西瓜及其雙親篩選獲得4對SSR共顯性分子標記，在對單一標記優(yōu)化的基礎上，創(chuàng)建雙重PCR擴增體系，將條帶大小具有明顯差異的分子標記組合應用于雜交種純度鑒定，采用堿裂解法提取DNA法鑒定早佳8424西瓜雜交種子純度和真實性。

1 材料與方法

1.1 材 料

西瓜品種早佳8424(F1)及其父母雙親T2(P2)、伊選(P1)共3份材料均由新疆農業(yè)科學院哈密瓜研究中心提供。

1.2 方 法

1.2.1 基因組DNA提取

改良CTAB法：取早佳8424西瓜及其父母雙親各10粒種子置于35℃培養(yǎng)箱中催芽約36 h至露出胚根即可，將10粒種子胚根等量混為1個樣品，置于2 mL離心管中，然后加入1個約5 mm的鋼珠和500 μL CTAB。利用羅氏MagNA Lyser組織勻漿儀以2 500 r/min震蕩30 s，每管加入500 μL氯仿異戊醇，上下顛倒震蕩50次，12 000 r/min離心3 min，吸取200 μL上清液于新的1.5 mL離心管中，加入等體積異丙醇上下顛倒50次混勻，12 000 r/min離心3 min，用70%無水乙醇清洗2次，于80℃烘箱中約10 min蒸干，然后用200 μL ddH2O溶解。取2 μL DNA溶液，利用Q3000超微量分光光度計測定樣品DNA濃度和純度，取適量樣品DNA母液統(tǒng)一稀釋為20 ng/μL存放于-20℃冰箱中備用，DNA母液存放于-80℃冰箱中長期保存。提取大量樣品時，為進一步提高效率，異丙醇沉降及70%無水乙醇清洗步驟可利用96孔PCR板結合排槍完成，離心時改用平板離心機4 680 r/min離心10 min，其它步驟同上。

堿裂解法：配置BufferA溶液(100 mM NaOH+2%Tween)和BufferB溶液(100 mM Tris-HCl+2 mM EDTA)。將待檢測樣品嫩葉或胚根置于96孔PCR板中，加入50 μL BufferA溶液，置于PCR儀中95℃溫浴10 min中，加入50 μL BufferB溶液，上下顛倒50次混勻，取2 μL用于PCR擴增。

利用早佳8424母本伊選和父本T2從72對SSR引物中共篩選出4對呈現(xiàn)明顯差異的分子標記。

1.2.2 SSR多態(tài)性引物的篩選

72對SSR引物由上海生物工程有限公司合成，具體引物信息詳見T. Joobeur等[9]、范建光等[10]和李麗等[4]。以早佳8424及其雙親基因組DNA為模板進行PCR擴增，篩選出在早佳8424雙親間呈現(xiàn)多態(tài)性且早佳8424帶型為雙親復合型的SSR引物。PCR反應體系10 μL，其中2×EasyTaqPCR SuperMix for PAGE(北京全式金生物技術有限公司) 5 μL，濃度為10 μM的正向引物和反向引物各0.25 μL，ddH2O 3.5 μL，DNA模板1 μL。PCR擴增程序為94℃預變性 3 min；94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，28個循環(huán)；72℃終延伸5 min；PCR產物4℃ 保存。利用6%的聚丙烯酰胺凝膠170 V電泳1 h，通過銀染法染色觀察。表1

為保障多重PCR技術體系的建立，以早佳8424雜交種DNA為模板，對4個標記的最佳退火溫度進行篩選。

1.2.3 西瓜雜交種早佳8424純度的田間鑒定和SSR分子標記鑒定

西瓜雜交種早佳8424純度的田間鑒定在新疆農業(yè)科學院哈密瓜研究中心亞爾鄉(xiāng)基地進行。利用直徑約5 mm的打孔器按照田間種植順序依次取192株植株嫩葉置于96孔PCR板中，采用堿裂解法提取DNA，利用篩選出的SSR分子標記鑒定，并將鑒定結果同田間鑒定結果進行比較。

雜交種純度=(1-雜種子數(shù)量/檢測種子總數(shù))×100%。

采集田間種植的早佳8424植株嫩葉，采用堿裂解法快速提取其DNA。利用WS27+MCPI-05組合對早佳8424雜交種純度進行分子鑒定。

早佳8424西瓜果實呈圓球形，綠底果面并覆有墨綠條帶，而其母本為淺綠底核桃紋條帶，將早佳8424果面特征作為田間鑒定的最主要依據(jù)。

2 結果與分析

2.1 早佳8424雜交種純度SSR鑒定標記篩選

研究表明,4對引物在早佳8424上的帶型均呈現(xiàn)為雙親復合型,4對引物均可應用于早佳8424西瓜的雜交種純度鑒定。引物BVWS00106和BVWS00333分別位于第5號和第9號染色體上，引物WS27和MCPI-05均位于第6號染色體上，4對引物PCR擴增片段大小均在100～300 bp。圖1

表1 早佳8424雜交種純度鑒定引物

Table 1 Primers used for genetic purity testing in hybrid Zaojia 8424 watermelon

引物名稱Primer正向引物序列Forward primer反向引物序列Reverse primer染色體位置ChromosomeBVWS00106TGGCCTAGAAGATTATTGAGCTGCCATTATCACATGGCAGATAATGGAAAChr5BVWS00333TGTTGAGATTCTTTGATTTCAACTGTTGGGTCAAAGTATTTTTGCTTTTTChr9WS27TTCTCTTCATTCCCCCAAAATCACGGGTGAGGGAAAACGAGChr6MCPI-05ATTTCTGGCCCCAGTGTAAGGAACAACGCAACCACGTATGChr6

圖1 4對SSR引物的PCR擴增圖譜

Fig.1 SSR profile of Zaojia8424 and its parents amplified with the four primers

2.2 雙重PCR擴增

研究表明,篩選出的4個標記根據(jù)擴增產物的大小可進行不同組合。60.2℃為最佳退火溫度，退火溫度小于60.2℃時4個標記均有不同程度的非特異性擴增，當退火溫度高于60.2℃，PCR擴增產物產量隨溫度升高逐漸降低甚至無擴增產物。配制BVWS00106+BVWS00333、BVWS00106+WS27、BVWS00333+WS27、BVWS00333+MCPI-05、WS27+MCPI-05、BVWS00106+BVWS00333+WS27和BVWS00333+WS27+MCPI-05等7個組合在60℃退火溫度下進行PCR擴增。BVWS00106+BVWS00333、BVWS00333+WS27、BVWS00333+MCPI-05和WS27+MCPI-05等4種組合能夠用于早佳8424雜交種純度鑒定，其它3種組合形式擴增失敗。將不同引物組合進行多重PCR擴增時，會呈現(xiàn)競爭性擴增或選擇偏好性擴增甚至相互抑制的現(xiàn)象，如BVWS00106+BVWS00333組合，兩對引物PCR產物濃度均明顯低于單一擴增；BVWS00333+WS27組合和BVWS00333+MCPI-05組合擴增時，BVWS00333引物PCR擴增均受到了抑制；將3對引物混合擴增時，均未能獲得理想的PCR產物。圖2,圖3

注：1、2、3和4分別代表引物 VWS00106、BVWS00333、WS27和MCPI-05

Note:1, 2, 3 and 4 represent primer BVWS00106, BVWS00333, WS27 and McPi-05 ,respectively

圖2 4對引物最佳退火溫度的篩選

Fig. 2 Selection of optimum annealing temperature for the four SSR primers

圖3 不同引物組合的多重PCR擴增

Fig. 3 Multiple PCR amplification for different primer combinations

2.3 早佳8424雜交種純度SSR分子標記鑒定

研究表明,第49號植株帶型與早佳8424母本帶型一致，缺少其父本帶型，因此,認定為雜種子，其它植株帶型均為早佳8424雙親的復合帶型，為真實的雜交種，該批樣品雜交種純度為99.5%。圖4

圖4 利用WS27+MCPI-05組合對早佳8424雜交種純度的鑒定

Fig. 4 WS27+ McPi-05 combination was used to identify the hybrid purity of zaojia 8424

2.4 早佳8424雜交種純度的田間鑒定

在田間共種植200株，經田間實地考察，第49株果實呈現(xiàn)為母本的果面特征，其余植株均為真實雜交種的果面特征，與分子鑒定結果完全一致，該批樣品雜交種純度為99.5%，利用SSR分子標記對早佳8424西瓜雜交種純度進行鑒定是切實可行的。

3 討 論

3.1 西瓜雜交種的生產及其純度鑒定

西瓜一般為雌雄異花同株，偶爾也出現(xiàn)完全花和雄花同株。在西瓜雜交種生產過程中，要嚴格遵照雜交種生產技術規(guī)程，對易引起混雜的關鍵點進行嚴格把控，及時拔除制種田中的雜株、避免套冒夾花不嚴造成自交或串入其它花粉，避免在種子收獲、精選過程中的機械混雜等，以保障雜交種子的純度。目前用于西瓜雜交種純度鑒定的方法主要分為兩大類，利用形態(tài)學觀察的傳統(tǒng)田間鑒定和利用分子標記圖譜信息的室內鑒定。早佳8424西瓜傳統(tǒng)田間鑒定主要利用幼果期果皮附著條帶來判斷，果皮表面呈現(xiàn)為淺綠底核桃紋條帶的即為雜種子。采用傳統(tǒng)鑒定方法需要幼果膨大到一定階段待果面特征顯現(xiàn)出來才能準確鑒定，較為費時費力，當年收獲的種子僅能在吐魯番或南方通過設施大棚種植鑒定，甚至次年才能獲得鑒定結果，鑒定周期長，成本高昂[11]，但由于形態(tài)學性狀直觀可見，該方法目前依然在廣泛使用。利用分子標記對雜交種純度鑒定，不受外界環(huán)境限制，簡單快速，便于規(guī)?；?、自動化流水作業(yè)[3,12～13]。尤其是SSR標記，因其對DNA質量要求低，共顯性遺傳，譜帶信息清晰，穩(wěn)定性好等優(yōu)點，是目前開發(fā)應用最多，被認為比較理想的用于西瓜雜交種純度鑒定的分子標記[12]。相比于形態(tài)學性狀觀察，SSR位點的差異不受人為選擇傾向的影響，對品種的檢測是一個綜合客觀的評價[4]，鑒定結果更為準確有效。

3.2 SSR分子標記鑒定體系及優(yōu)化

SSR分子標記鑒定主要包括DNA提取、PCR擴增和電泳檢測3個步驟。DNA快速高通量提取是關鍵限速環(huán)節(jié)。DNA提取主要包括試劑盒膜吸附洗脫提取、CTAB提取和堿裂解法提取3種方法。在大規(guī)模雜交種純度鑒定時，試劑盒膜吸附洗脫提取法因成本高昂且不能有效結合排槍批量操作不宜采納。堿裂解法避免了離心及更換離心管等操作，簡便易行，大大提高了DNA提取效率，一般濃度相對較低，質量較差，但可以滿足SSR-PCR擴增，可用于雜交種純度SSR分子標記鑒定[10]。

單一分子標記PCR可有效區(qū)分混入雜交種中的母本種子，但雙重或多重分子標記PCR可獲得更為準確可靠的鑒定結果。劉子記等[3]建立了小型西瓜美月雜交種純度雙重PCR鑒定體系，與單一PCR相比，進一步降低了檢測時間和費用。研究共篩選出4對可用于早佳8424西瓜雜交種純度鑒定的引物，并獲得4種組合進行雙重PCR，當某一引物出現(xiàn)問題時，可有效替補。在PCR過程中需要針對不同的引物篩選其最佳退火溫度，避免非特異性擴增對鑒定結果造成干擾，不同DNA聚合酶及PCR擴增體系都會影響PCR擴增的特異性[13]，當更換不同品牌的PCR mix時，要對PCR擴增體系及PCR擴增程序重新進行探索修正，并在鑒定過程盡可能避免更換試劑。

4 結 論

以早佳8424及其雙親為試驗材料，從72對SSR引物中篩選獲得4對在早佳8424上表現(xiàn)為雙親互補帶型的引物，分布于3條染色體上，片段大小約100～300 bp。將擴增片段大小不同的引物進行雙重或多重PCR擴增，獲得4個雙重PCR組合。將SSR分子標記鑒定同田間傳統(tǒng)鑒定進行比較，結果完全一致，SSR標記及其組合切實可用于西瓜雜交種早佳8424純度鑒定，效率高，操作簡便，適于室內高通量流水作業(yè)。