微塑料（MPs）與氟苯尼考復(fù)合暴露對(duì)普通小球藻的毒性效應(yīng)研究

高明宇 許曉路 張德勇

【摘 要】對(duì)普通小球藻分別進(jìn)行微塑料、氟苯尼考單獨(dú)染毒及聯(lián)合染毒96h，結(jié)果顯示藻類的增殖收到抑制，96h-EC50值分別為95.58 mg/L和22.82mg/L。染毒組藻類的葉綠素a含量降低、POD酶活力降低、MDA含量升高。聯(lián)合染毒實(shí)驗(yàn)則進(jìn)一步顯示，微塑料與氟苯尼考復(fù)合暴露時(shí)，具有一定程度的拮抗效應(yīng)，其毒性效應(yīng)稍低于單獨(dú)染毒的毒性之和。

【關(guān)鍵詞】微塑料，氟苯尼考，普通小球藻，淡水綠藻

微塑料（Microplastics，MPs）指直徑小于5毫米的塑料碎片和顆粒，是水體中的新型污染物。預(yù)計(jì)到2025年全球塑料的產(chǎn)量將達(dá)到330億噸，其環(huán)境污染問(wèn)題日趨嚴(yán)重[1]。其中相當(dāng)大比例的塑料，在經(jīng)歷了一系列化學(xué)、物理的反應(yīng)和聯(lián)合作用，就變成體積更小，危害更大，處理難度也更大的MPs。由于MPs顆粒很小，于是很容易被水生生物誤食而攝入體內(nèi)，對(duì)其腸道或組織等造成損傷并影響其生長(zhǎng)。MPs可沿食物鏈傳遞，并對(duì)許多生物的生長(zhǎng)、繁殖、免疫等產(chǎn)生不良影響。MPs還可滲透磷脂雙分子層，影響細(xì)胞物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)。PS-NH2能破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)[2 3]，導(dǎo)致血細(xì)胞吞噬活性異常，還會(huì)改變細(xì)胞形態(tài)甚至導(dǎo)致細(xì)胞死亡[4]。

藻類是水生生態(tài)系統(tǒng)中的初級(jí)生產(chǎn)者，處于食物鏈的底端同時(shí)容易受污染物的影響，其生物量直接決定了食物鏈上游各級(jí)生物的維系，對(duì)生態(tài)系統(tǒng)至關(guān)重要。MPs對(duì)藻類的毒性可為抑制細(xì)胞生長(zhǎng)、降低葉綠素含量、引起細(xì)胞氧化損傷等，且毒性大小與微塑料的種類、大小、濃度等有關(guān)[5-6]。氟苯尼考作為良好的抗菌藥物，在養(yǎng)殖業(yè)中大量使用，并被排放到水體環(huán)境中，由于其半衰期長(zhǎng)，因此可在水體中存在較長(zhǎng)時(shí)間，是一種廣受關(guān)注的污染物。雖然這兩種污染物對(duì)藻類的單獨(dú)的毒性效應(yīng)已有不少研究，但是關(guān)于二者復(fù)合暴露時(shí)的復(fù)合效應(yīng)卻尚且罕有研究。實(shí)際上，單獨(dú)染毒不能反映實(shí)際情況，在實(shí)際環(huán)境中總是許多污染物共同存在時(shí)，會(huì)彼此影響，使得總體毒性的呈現(xiàn)十分復(fù)雜。因此，有必要進(jìn)行復(fù)合毒性的研究，以深入了解環(huán)境污染物在實(shí)際情況中的復(fù)雜效應(yīng)。對(duì)評(píng)價(jià)污染物對(duì)水體環(huán)境的危害具有重要的意義。

1、材料與方法

1.1 藻類培養(yǎng)及染毒方案

微塑料采用聚乙烯（PE）粉末;普通小球藻（Chlorella vulgaris）購(gòu)自中科院水生生物所;“水生4號(hào)”培養(yǎng)基由所在實(shí)驗(yàn)室配制;藻類培養(yǎng)條件為25℃、12h/12h光暗循環(huán)。單獨(dú)及聯(lián)合染毒的劑量方案見(jiàn)表1。藻類染毒后繼續(xù)培養(yǎng)96h并分析各指標(biāo)。

1.2 藻類生物量的分析

首先對(duì)藻液進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，找出特征吸收峰。然后分別利用吸光度法與顯微鏡計(jì)數(shù)法建立藻濃度與吸光度值之間的回歸方程。以吸光度作為分析藻類生物量的方法用于各指標(biāo)分析。

1.3 藻類的生長(zhǎng)抑制效應(yīng)分析及96h-EC50值計(jì)算

基于A690值繪制生長(zhǎng)曲線，建立抑制率P和濃度的自然對(duì)數(shù)LnC的線性回歸關(guān)系，求解抑制率為50%的濃度值即EC50值。抑制率P（%）=（對(duì)照組A690-處理組A690）/對(duì)照組A690。

1.4 葉綠素含量測(cè)定

藻液用高速離心法提取，加1.5mL乙醇和少許石英砂研磨，轉(zhuǎn)入離心管定容到10mL，于4℃黑暗提取12h;4000rpm離心10min;上清于比色管中用90%乙醇定容10mL。于比色皿中，測(cè)吸光值。葉綠素a濃度（mg/L）=（11.64A633+2.16A645+0.10A630）V1/1000V2。式中V1為提取液定容體積（mL）;V2為濾液體積（L）。

1.5 POD活性測(cè)定

藻細(xì)胞破壁后，上清充分轉(zhuǎn)入25mL容量瓶定容。取比色皿加入反應(yīng)混合液3 mL和酶液1 mL。立即開(kāi)啟秒表記錄A470，每隔1min讀數(shù)1次，共5min。U=（A470×0. 01×W ×t）×樣品稀釋倍數(shù)。

1.6 丙二醛（MDA）活性測(cè)定

藻液離心后加10%TCA研磨，勻漿液12000rpm離心10min。取2mL上清于試管，加入0.6%硫代巴比妥酸2mL，沸水浴10min。4500rpm離心10min，取上清測(cè)吸光度。MDA濃度=6.45（A532-A600）-0.56×A450。

2、結(jié)果

2.1 藻類增殖分析及96h-EC50值計(jì)算

基于建立的吸光度法分析藻類增殖規(guī)律，經(jīng)計(jì)算，微塑料、氟苯尼考對(duì)淡水綠藻的抑制率P（%）和濃度的自然對(duì)數(shù)（LnC）的線性回歸方程分別為：y=0.0633x+0.2111，R2=0.949;y=-0.4574x+19305，R2=0.9616。其96h-EC50值分別為95.58 mg/L和22.82mg/L。

2.2 葉綠素含量

如表1所示，單獨(dú)染毒MPs、氟苯尼考均引起葉綠素含量下降，MPs低劑量、高劑量組降幅分別為27.1%和36.5%;氟苯尼考組則分別為39.9%和44.6%。4個(gè)聯(lián)合染毒組的抑制率均低于相應(yīng)的單獨(dú)染毒組直接相加，故聯(lián)合染毒表現(xiàn)出拮抗效應(yīng)。

2.3 POD的活性

如表1所示，單獨(dú)染毒MPs、氟苯尼考均引起POD活力下降，MPs低劑量、高劑量組降幅分別為16.7%和23.5%;氟苯尼考組則分別為48.0%和56.9%。4個(gè)聯(lián)合染毒組的降幅亦均低于直接單獨(dú)組的加和值，呈現(xiàn)拮抗效應(yīng)。

2.4 MDA含量

如表1所示，單獨(dú)染毒MPs、氟苯尼考均引起MDA值升高，MPs低劑量、高劑量組升高率分別為0.25倍和0.41倍;氟苯尼考組則分別為2.3倍和2.6倍。4個(gè)聯(lián)合染毒組的抑制率均低于相應(yīng)的單獨(dú)染毒組直接相加，故聯(lián)合染毒表現(xiàn)出拮抗作用。

3、結(jié)論

現(xiàn)在微塑料已經(jīng)成為了全球性的問(wèn)題，最近人們?cè)谥槟吕敺迳蠙z測(cè)到了微塑料的存在，這也意味著人類在最深處馬里亞納海峽以及地球最高峰上都發(fā)現(xiàn)了微塑料的蹤跡，微塑料已成為不可忽視的問(wèn)題。在2018年的歐洲胃腸病學(xué)會(huì)議上，維也納的學(xué)者首次報(bào)告在人體排泄物中檢測(cè)到了多達(dá)9種MPs，其直徑在50-500 ?m之間，每10克的糞便中就含有20個(gè)MPs微粒。微塑料是一種造成污染的主要載體，代表著其不僅具有直接毒性，還可以于其他污染物結(jié)合，擴(kuò)大污染范圍，他們之間的復(fù)合毒性效應(yīng)也亟待深入研究。本實(shí)驗(yàn)中也證實(shí)微塑料自身毒性有限，毒性效應(yīng)不大，但與氟苯尼考聯(lián)合染毒時(shí)產(chǎn)生一定的協(xié)同作用，增強(qiáng)了氟苯尼考對(duì)于葉綠素、MDA含量、POD等指標(biāo)的毒性。

本實(shí)驗(yàn)初步證明了MPs與氟苯尼考單獨(dú)染毒均會(huì)影響藻類的增殖和生理指標(biāo);復(fù)合染毒時(shí)，葉綠素、MDA含量、POD活力等指標(biāo)表現(xiàn)出的毒性效應(yīng)多數(shù)弱于單獨(dú)染毒直接相加的總合，故可認(rèn)為符合染毒具有一定的拮抗效應(yīng)。拮抗效應(yīng)的機(jī)制可能與微塑料具有一定的吸附效應(yīng)有關(guān)。

本研究初步證實(shí)了MPs對(duì)于藻類有著毒性效應(yīng)，多種污染物同時(shí)作用于藻類時(shí)，其呈現(xiàn)的現(xiàn)象是比較復(fù)雜的。MPs的毒性機(jī)制可以破壞藻類光合作用、抗氧化能力等，但是還有許多內(nèi)容有待進(jìn)一步的研究。

參考文獻(xiàn)：

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作者簡(jiǎn)介：

高明宇，1998.10.8，男，漢，浙江杭州，工作單位：浙江樹(shù)人大學(xué)在讀大學(xué)生，研究方向：環(huán)境工程。

許曉路，1966.4，男，漢，浙江金華，碩士，教授，研究方向：生態(tài)毒理。

張德勇，1978.4，男，漢，山東聊城，博士，教授，研究方向：生物工程。

致謝：本課題受浙江樹(shù)人大學(xué)“卓越工程師”項(xiàng)目（JZJ0517301）資助。

（作者單位：浙江樹(shù)人大學(xué)生物與環(huán)境工程學(xué)院）