尿液8-oxo-Gsn與丙型肝炎病毒感染引起肝損害的關(guān)系研究

楊麗霞，張厚亮，吳洪章

(1.天津醫(yī)科大學(xué)靜海臨床學(xué)院免疫科,天津 301600；2.天津市第二人民醫(yī)院，天津 300192)

丙型肝炎病毒(HCV)為單股正鏈RNA病毒，感染后可引起肝臟炎性反應(yīng)，約85%的感染會(huì)轉(zhuǎn)為慢性[1]。丙型肝炎是全球性的公共衛(wèi)生健康問題，患者人數(shù)眾多。據(jù)WHO統(tǒng)計(jì)，全世界約1.7億到2.0億人患丙型肝炎，每年約有39.9萬人因長期HCV感染導(dǎo)致肝硬化或肝癌死亡[2]，我國是HCV感染人數(shù)較多的國家之一，并且丙型肝炎已經(jīng)繼乙型肝炎之后成為我國肝細(xì)胞癌的另一個(gè)重要致病因素[3]。隨著臨床研究的深入，發(fā)現(xiàn)活性氧自由基(ROS)可引起核酸損傷，而其所引發(fā)的氧化應(yīng)激是肝細(xì)胞損傷的重要環(huán)節(jié)，ROS增多可引起核酸中堿基修飾、錯(cuò)配、蛋白變異。RNA中鳥嘌呤核苷常在ROS的作用下形成8-氧化鳥苷(8-oxo-Gsn)，受損的核酸氧化產(chǎn)物進(jìn)入血液循環(huán)，從尿液排出。RNA的氧化損傷可能參與多種疾病的發(fā)生、發(fā)展[4]。8-oxo-Gsn是RNA鳥苷的氧化產(chǎn)物，可作為體內(nèi)RNA氧化標(biāo)志物，在發(fā)生氧化損傷后尿液中的8-oxo-Gsn水平較其他體液指標(biāo)變化更明顯，其檢測(cè)手段具有無創(chuàng)性，容易操作，是極具臨床推廣價(jià)值的RNA氧化損傷標(biāo)志物。本研究旨探討尿液中RNA氧化產(chǎn)物8-oxo-Gsn與丙型肝炎肝損害的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2015年5月至2018年8月在天津醫(yī)科大學(xué)靜海臨床學(xué)院和天津市第二人民醫(yī)院進(jìn)行肝穿刺活檢的慢性丙型肝炎(CHC)患者45例作為CHC組，其中男25例、女20例，年齡29～65歲，平均(48.8±11.1)歲；選取同期的HCV攜帶者50例作為HCV攜帶組，其中男28例、女22例，年齡31～63歲，平均(49.3±10.8)歲；選取同期體檢健康者50例作為對(duì)照組，其中男25例、女25例，年齡30～63歲，平均(47.9±12.7)歲。各組年齡差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

1.2納入及排除標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1CHC組患者 納入標(biāo)準(zhǔn)：CHC患者符合《丙型肝炎防治指南》(2015更新版)[5]CHC診斷標(biāo)準(zhǔn)，即HCV感染6個(gè)月以上，或有6個(gè)月以前的流行病學(xué)史；血清HCV抗體陽性及HCV核糖核酸(HCV RNA)陽性；肝臟組織病理學(xué)檢查符合慢性肝炎；或根據(jù)臨床癥狀、體征、實(shí)驗(yàn)室及影像學(xué)檢查結(jié)果綜合分析診斷。排除標(biāo)準(zhǔn)：酒精性肝炎、脂肪肝；有甲、乙、丁、戊、庚型等其他肝炎病毒的混合感染；人類免疫缺陷病毒(HIV)、梅毒等感染性疾??；有嚴(yán)重心、腦疾病及各種嚴(yán)重全身性疾??；接受過干擾素或抗病毒治療；有穿刺禁忌證。

1.2.2HCV攜帶組 納入標(biāo)準(zhǔn)：HCV抗體陽性，HCV RNA陰性；1年內(nèi)連續(xù)隨訪2次以上，每次間隔6個(gè)月，肝功能均正常。排除標(biāo)準(zhǔn)：酒精性肝炎、脂肪肝；有其他肝炎病毒的混合感染；HIV、梅毒等感染性疾病；嚴(yán)重心、腦疾病及各種嚴(yán)重全身性疾病。

1.2.3對(duì)照組 納入標(biāo)準(zhǔn)：體檢身體健康。無酒精性肝炎、脂肪肝、自身免疫性肝病；無甲、乙、丁、戊、庚型等其他肝炎病毒的混合感染；無HIV、梅毒等感染性疾病；體檢肝、腎功能等各項(xiàng)常規(guī)檢測(cè)項(xiàng)目均無異常。

1.3儀器與試劑 Agilent UPLC 1290超高效液相系統(tǒng)(Agilent公司,美國)；Agilent 6490 Triple Quad MS/MS三重串聯(lián)四極桿液質(zhì)連用系統(tǒng)(Agilent公司,美國)。液相條件如下。A液：10 mmol/L醋酸銨水溶液,調(diào)節(jié)pH值3.7；B液：色譜級(jí)純甲醇；色譜柱:SB-Aq，3.0 mm×100.0 mm，1.8 μm，600 Bar(Agilent公司，美國)，柱溫35 ℃。羅氏Cobas c701全自動(dòng)生化分析儀及其配套試劑。

1.4方法

1.4.1檢測(cè)方法 留取納入研究者空腹新鮮中段晨尿,裝入15 mL無菌尿管，立即于-80 ℃冰箱凍存。應(yīng)用同位素稀釋高效液相-串聯(lián)質(zhì)譜(ID-LC-MS/MS)定量測(cè)定所有患者晨尿中8-oxo-Gsn水平，酶法測(cè)定尿肌酐值(creatinine)。尿液的前處理：凍存的尿液于37 ℃水浴10 min解凍，7 500×g，離心5 min(4 ℃)；取上清200 μL，200 μL工作液(70%純甲醇,30%醋酸銨水溶液,水平10 mmol/L，pH值為3.7),再加入10 μL濃度為480 pg/μL的8-oxo-Gsn(13C,15N2)同位素內(nèi)標(biāo),震蕩混勻2 min,置于37 ℃溫育箱孵育10 min，然后12 000×g低溫離心15 min(4 ℃),上清液用作LC-MS/MS檢測(cè)分析，試驗(yàn)嚴(yán)格按照產(chǎn)品說明和儀器操作規(guī)程進(jìn)行。用尿creatinine校正測(cè)得的8-oxo-Gsn值以減少腎小球功能和尿液體積對(duì)測(cè)定的影響，校正方法參考文獻(xiàn)[6]。C校正=C測(cè)定/C尿creatinine，合格creatinine水平范圍0.5～3.0 g/L。

1.4.2肝臟組織學(xué)檢查 通過超聲檢查定位,取右腋中線第8～9肋間隙、肝實(shí)音處為穿刺點(diǎn),囑患者深吸氣屏氣，采用美國Bard公司生產(chǎn)的彈射式肝穿刺槍和配套的16 G一次性活檢穿刺針，1 s負(fù)壓吸取肝組織,要求穿刺取出的肝組織長度≥1.5 cm,包含至少3個(gè)可供評(píng)價(jià)匯管區(qū)。常規(guī)用10%甲醛溶液固定肝組織，及時(shí)送檢。使用國際上最常用的肝纖維化METAVIR評(píng)分系統(tǒng)[7]，將肝組織纖維化程度分為0～4五個(gè)等級(jí)：F0為無纖維化；F1為匯管區(qū)星芒狀擴(kuò)大但無纖維間隔形成；F2為匯管區(qū)星芒狀擴(kuò)大，極少數(shù)纖維間隔形成；F3為眾多纖維間隔，但無硬化；F4為硬化。將肝組織炎癥活動(dòng)度分為0～3四個(gè)等級(jí)：A0為無活動(dòng)，A1為輕度活動(dòng)，A2為中度活動(dòng)，A3為重度活動(dòng)。

2 結(jié) 果

2.1尿液8-oxo-Gsn水平的比較 CHC組尿8-oxo-Gsn水平顯著高于HCV攜帶組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.319,P=0.002)；HCV攜帶組尿8-oxo-Gsn水平顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=17.867,P=0.000)，見表1。

表1 各組間尿8-oxo-Gsn水平比較

2.2CHC患者各組間尿8-oxo-Gsn、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)水平比較 肝臟炎癥程度高(A2～A3)的患者尿液8-oxo-Gsn、血清ALT、AST水平均顯著高于肝臟炎癥程度低(A0～A1)的患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。纖維化程度高(F3～F4)的患者尿8-oxo-Gsn水平與纖維化程度低(F0～F2) 的患者比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。尿8-oxo-Gsn水平與血清ALT和AST并未發(fā)現(xiàn)相關(guān)性(P分別為0.212、0.470)。不同炎癥分期及纖維化分期的CHC患者間檢測(cè)指標(biāo)的比較見表2。

表2 CHC各組間尿8-oxo-Gsn、血清ALT、AST水平比較

2.3ROC分析8-oxo-Gsn對(duì)CHC炎癥活動(dòng)度和纖維化程度的診斷價(jià)值 8-oxo-Gsn對(duì)CHC炎癥活動(dòng)度的診斷靈敏度為82.2%，特異度為75.3%，曲線下面積(AUC)為0.812；8-oxo-Gsn對(duì)CHC纖維化程度的診斷靈敏度為83.2%，特異度為77.3%，AUC為0.822。見圖1。

注：A為8-oxo-Gsn對(duì)CHC炎癥活動(dòng)度診斷的ROC曲線；B為8-oxo-Gsn對(duì)CHC纖維化程度診斷的ROC曲線。

圖18-oxo-Gsn用于診斷的ROC曲線

3 討 論

HCV感染是急性丙型肝炎或CHC、肝硬化和肝癌的病因之一。在感染早期，大部分患者沒有任何癥狀，HCV也是導(dǎo)致肝臟損傷的直接原因之一，病毒感染可引起核酸損傷，而其所引發(fā)的氧化應(yīng)激是肝細(xì)胞損傷的重要環(huán)節(jié)，造成ROS釋放增多，使吞噬細(xì)胞活化并釋放前氧化性細(xì)胞因子,ROS由其羥基自由基進(jìn)一步損傷核酸，引發(fā)蛋白質(zhì)變異造成肝臟病變[8]。目前丙型肝炎肝損害程度的評(píng)估及是否進(jìn)行抗病毒治療主要依靠一般血液生化檢測(cè)、影像學(xué)和病理學(xué)檢查。然而有證據(jù)顯示，有部分ALT正常的CHC患者肝穿刺組織病理學(xué)呈明顯肝損傷表現(xiàn)，如不早期臨床干預(yù)會(huì)增加肝硬化甚至肝癌的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。由于肝穿刺檢測(cè)周期長、成本高，給患者造成有創(chuàng)傷害，不易推廣應(yīng)用，影響了隱匿性HCV感染患者肝組織損害狀態(tài)的評(píng)估，影像學(xué)檢查有一定的漏診率和灰區(qū)[9]。根據(jù)丙型肝炎防治指南，即便是對(duì)肝纖維化評(píng)估較為理想的FibroScand對(duì)肝損傷判定也存在一定的灰區(qū)[10]。無創(chuàng)性檢測(cè)方法對(duì)于醫(yī)生判斷患者肝臟炎癥分期是非常重要的檢測(cè)手段之一，并對(duì)提高患者治療依從性有一定幫助。研究表明，晨尿中RNA氧化產(chǎn)物8-oxo-Gsn用creatinine校正后，與24 h尿中RNA氧化產(chǎn)物濃度意義相近，能反映一定時(shí)間內(nèi)人體氧化應(yīng)激水平[11]。

氧化應(yīng)激是人體正常細(xì)胞中氧化和抗氧化失去平衡的一種狀態(tài)，在引起肝臟發(fā)生病理損傷中發(fā)揮了關(guān)鍵作用[12]。當(dāng)前許多研究證明RNA在細(xì)胞質(zhì)中分布廣泛，相對(duì)于DNA來說，RNA大部分為單鏈，缺乏組蛋白保護(hù)和RNA聚合酶的校正功能，容易受到ROS攻擊發(fā)生氧化損傷，氧化修飾的RNA可引起轉(zhuǎn)錄翻譯的異常，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)合成的障礙，誘發(fā)細(xì)胞變異[13]，RNA中鳥嘌呤核苷常在ROS的作用下形成氧化代謝產(chǎn)物8-oxo-Gsn。分泌至血液、尿液、腦脊液等體液中的氧化代謝產(chǎn)物8-oxo-Gsn可作為一種新的生物學(xué)標(biāo)志物，提示體內(nèi)RNA氧化損傷的水平，對(duì)人們了解疾病狀態(tài)、致病因素、治療選擇等有一定的參考價(jià)值。WANG等[14]在糖尿病的大鼠模型中發(fā)現(xiàn)也證實(shí)了這一點(diǎn)，高血糖狀態(tài)下相較于DNA，RNA更易受到損傷。有研究表明,RNA氧化損傷是一種潛在的發(fā)病機(jī)制，氧化損傷在一些疾病及并發(fā)癥的發(fā)生和進(jìn)展中扮演了重要角色[15]。RNA氧化參與多種疾病的發(fā)生、發(fā)展，如氧化應(yīng)激相關(guān)疾病、糖尿病、腫瘤等。LIU等[6]運(yùn)用ID-LC-MS/MS法檢測(cè)對(duì)比糖尿病患者及健康人尿8-oxo-Gsn后發(fā)現(xiàn)，尿8-oxo-Gsn的升高可能是一種糖尿病進(jìn)展的危險(xiǎn)因素，尤其在糖尿病合并大血管病變中RNA氧化損傷與許多疾病相關(guān)，是許多疾病的潛在發(fā)病機(jī)制，尤其是神經(jīng)退行性病變、糖尿病等疾病。SONG等[16]研究證明在胃癌患者尿8-oxo-Gsn顯著增高,與胃癌分期嚴(yán)重程度有明顯相關(guān)性。RNA氧化產(chǎn)物8-oxo-Gsn已經(jīng)成為公認(rèn)的RNA氧化最重要的標(biāo)志物，前期研究表明，在大鼠和獼猴等動(dòng)物組織和體液中，如白細(xì)胞、血液和尿液中，RNA氧化產(chǎn)物8-oxo-Gsn水平隨年齡逐漸升高，且尿液中的8-oxo-Gsn水平最高[17-20]。因此，無創(chuàng)性尿液8-oxo-Gsn是一種評(píng)估機(jī)體氧化應(yīng)激損傷非常重要的生物學(xué)標(biāo)志物。

RNA氧化標(biāo)志物的檢測(cè)目前主要采用免疫組化法、反轉(zhuǎn)錄酶-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法(RT-PCR)、高效液相色譜-電化學(xué)探測(cè)器聯(lián)用法(HPLC-ECD)及ID-LC-MS/MS,有研究認(rèn)為ID-LC-MS/MS是最具有靈敏度和特異度的檢測(cè)尿液8-oxo-Gsn的方法，推薦使用ID-LC-MS/MS檢測(cè)尿液8-oxo-Gsn評(píng)估患者氧化應(yīng)激損傷情況[7]。本研究采用無創(chuàng)的ID-LC-MS/MS檢測(cè)尿液中RNA氧化標(biāo)志物8-oxo-Gsn，結(jié)果顯示CHC組尿液中RNA氧化標(biāo)志物8-oxo-Gsn顯著高于HCV攜帶組，HCV攜帶組患者尿8-oxo-Gsn顯著高于對(duì)照組，尿液8-oxo-Gsn水平對(duì)快速判斷丙型肝炎患者所處感染的不同臨床時(shí)期有重要參考價(jià)值，可用于區(qū)分丙型肝炎攜帶者和CHC患者。肝臟炎性損傷程度越高尿8-oxo-Gsn水平越高，說明尿液8-oxo-Gsn對(duì)評(píng)估丙型肝炎炎癥程度有較高的參考價(jià)值。血清ALT和AST與丙型肝炎炎癥程度顯著相關(guān)。纖維化程度高的患者尿8-oxo-Gsn水平也高于纖維化程度低的患者,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，是否受標(biāo)本例數(shù)的影響，下一步本課題組還將深入研究。

4 結(jié) 論

8-oxo-Gsn作為一種極具潛力的新型氧化損傷標(biāo)志物，對(duì)評(píng)估丙型肝炎肝臟損害程度有較高的價(jià)值，對(duì)臨床選擇治療方案提供一定的依據(jù)。尿液8-oxo-Gsn有可能對(duì)于患者抗病毒療效觀察起到一定輔助作用，由于本研究樣本量少，數(shù)據(jù)分析受多種因素干擾可能存在偏移，后續(xù)本課題組將進(jìn)一步深入研究以減少這類偏移。