循環(huán)腫瘤細胞與腫瘤標志物在肺癌診斷中的價值比較*

吳 方，趙 京，張 俠，郭沛艷，楊家樹，劉 杰△

(1.南方醫(yī)科大學第二臨床醫(yī)學院，廣東廣州 510280；中國人民解放軍總醫(yī)院第七醫(yī)學中心: 2.檢驗科;3.胸外科;4.腫瘤科;5.呼吸內科，北京 100700)

肺癌是我國常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率及病死率在各類惡性腫瘤中均居首位[1]，早期診斷對療效及延長患者生存期限具有重要意義[2]。由于患者早期并無明顯癥狀及當前檢查手段自身的局限性，致使60%～80%的患者確診時已是中晚期而錯失了最佳治療時機[3]。循環(huán)腫瘤細胞(CTCs)來源于腫瘤原發(fā)灶或轉移灶，在肺癌的診斷中具有潛在應用價值[4]。本研究將CTCs與傳統(tǒng)血清腫瘤標志物進行比較分析，從而探討CTCs在肺癌中的診斷價值，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2017年9月至2019年7月中國人民解放軍總醫(yī)院第七醫(yī)學中心收治的且經(jīng)病理檢查確診的肺癌患者35例作為肺癌組，其中男性27例，女性8例，年齡40～88歲，平均(60.7±9.6)歲，根據(jù)第8版國際肺癌TNM分期標準：Ⅰ期患者10例、Ⅱ期患者6例、Ⅲ期患者3例、Ⅳ期患者16例；大細胞癌1例、鱗癌8例、肉瘤1例、腺癌13例、腺鱗癌3例、小細胞癌9例。選取同期入院的非結核肺良性疾病者以及健康體檢者共48例作為對照組，其中男性38例，女性10例，年齡31～98歲，平均(61.0±17.6)歲；非結核肺良性疾病均為肺炎、慢性阻塞性肺疾病等呼吸系統(tǒng)疾病。兩組患者一般資料差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，具有可比性。納入標準：(1)年齡18～98歲；(2)經(jīng)組織病理學檢查確診為肺癌；(3)入組前未接受任何抗腫瘤治療；(4)患者知情同意。排除標準：(1)缺乏病理學診斷；(2)已接受手術、化療等任何治療；(3)依從性較差。

1.2方法

1.2.1CTCs檢測方法 用含ACD保養(yǎng)液的真空采血管抽取納入研究者(患者在入院接受治療前)空腹靜脈血5 mL，使用人外周血白細胞去除試劑盒(江蘇萊爾生物醫(yī)藥科技有限公司)對CTCs進行富集，使用熒光原位雜交樣品處理試劑盒(江蘇萊爾生物醫(yī)藥科技有限公司)對CTCs進行鑒定，即使用CD45對白細胞進行標記；使用DAPI對細胞核進行標記；使用CEP8探針對著絲粒進行標記。

1.2.2血清腫瘤標志物檢測方法 患者入院接受治療前，用紅色真空采血管抽取其空腹靜脈血5 mL，4 000 r/min離心5 min，使用羅氏Cobas e601全自動化學發(fā)光免疫分析儀及其配套試劑對癌胚抗原(CEA)、神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)、糖類抗原125(CA125)、糖類抗原153(CA153)、細胞角蛋白19片段(CYFRA21-1)進行檢測；使用新產(chǎn)業(yè)Maglumi 4000 Plus型全自動化學發(fā)光測定儀及其配套試劑對鱗狀細胞癌相關抗原(SCCA)進行檢測。操作步驟嚴格按照儀器及試劑說明書進行。

1.2.3CTCs陽性判斷標準 (1)單個細胞，核質均勻，未發(fā)現(xiàn)分層；(2)探針信號三個或三個以上；(3)CD45不顯色；(4)細胞表面無或僅一顆磁珠。見圖1。

圖1 熒光顯微鏡下對白細胞及CTCs的鑒別(400×)

1.2.4參考范圍 血清腫瘤標志物正常值：CYFRA21-1 0～3.3 ng/mL，NSE 0～16.3 ng/mL，SCCA 0～2.5 ng/mL，CEA 0～5 ng/mL，CA125 0～35 U/mL，CA153 0～25 U/mL；CTCs正常值：0～1個/3.2 mL。

1.3統(tǒng)計學處理 采用SPSS 20.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析處理，以ROC曲線對CTCs在肺癌中的診斷效能進行評價；計數(shù)資料以頻數(shù)及百分比[n(%)]表示，組間差異比較采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1肺癌組和對照組CTCs陽性率比較 應用免疫磁珠陰性富集結合熒光原位雜交技術對兩組患者外周血CTCs進行檢測，肺癌組陽性率為77.1%(27/35)，高于對照組CTCs陽性率10.4%(5/48)，差異具有統(tǒng)計學意義(χ2=38.042，P=0.000)。

2.2CTCs與傳統(tǒng)血清腫瘤標志物診斷肺癌的靈敏度及特異度比較 以病理診斷為金標準，整理CTCs對肺癌診斷的四格表資料，見表1。CTCs檢測在肺癌診斷中的靈敏度及特異度分別為77.1%、89.6%，見表2，均高于傳統(tǒng)血清腫瘤標志物NSE(42.9%、77.1%)、CA125(34.3%、87.5%)、CA153(11.4%、89.5%)、CYFRA21-1(62.9%、64.6%)、SCCA(22.9%、66.7%)；而CEA的特異度為93.8%，雖高于CTCs(89.6%)，但其靈敏度(45.7%)要低于CTCs(77.1%)。

表1 CTCs對肺癌診斷的四格表資料(n)

表2 CTCs與傳統(tǒng)血清腫瘤標志物診斷肺癌的靈敏度及特異度(%)

2.3CTCs與傳統(tǒng)血清腫瘤標志物診斷肺癌的ROC曲線分析 以病理診斷為金標準，以35例肺癌患者為疾病組，以48例健康者及肺良性疾病為對照組，如圖2所示，CTCs診斷肺癌的曲線下面積為0.865(95%CI:0.779～0.952)，其曲線下面積均高于CEA(0.793)、NSE(0.591)、CA125(0.706)、CA153(0.530)、CYFRA21-1(0.674)、SCCA(0.336)，ROC曲線分析結果顯示CTCs檢測對肺癌的診斷價值均比傳統(tǒng)血清腫瘤標志物高。

圖2 CTCs與傳統(tǒng)血清腫瘤標志物診斷肺癌的ROC曲線分析

2.4傳統(tǒng)血清腫瘤標志物聯(lián)合檢測與CTCs診斷肺癌的靈敏度及特異度比較 聯(lián)合檢測時,有一項指標陽性便判定檢測結果為陽性。如表3所示，CEA、NSE、CA125、CA153、CYFRA21-1、SCCA聯(lián)合檢測的靈敏度為94.3%，高于CTCs檢測的靈敏度(77.1%)，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=4.200，P=0.04)；但CTCs檢測的特異度(89.6%)顯著高于6項腫瘤標志物聯(lián)合檢測的特異度(33.3%)，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=32.059，P=0.000)。

表3 6項血清腫瘤標志物聯(lián)合檢測與CTCs診斷肺癌的靈敏度及特異度(%)

2.5CTCs陽性與肺癌患者病理類型的關系 CTCs的陽性與肺癌患者的病理類型無關(χ2=1.772，P=0.880>0.05),見表4。

表4 CTCs陽性與肺癌患者病理類型的關系[ n(%)]

3 討 論

癌癥是全球的公共衛(wèi)生問題，根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)2015年的估計，癌癥是導致91個國家70歲前死亡的第一或第二主要原因[5]，而在2018年的1 810萬例新發(fā)癌癥病例(肺癌占11.6%)和960萬癌癥死亡病例(肺癌占18.4%)中，肺癌均居首位[5]。在我國，肺癌的發(fā)病例數(shù)(約78.7萬例)及病死率(約63.1萬例)依然居各惡性腫瘤之首[1]，而且發(fā)病率還在逐年上升[6]，嚴重影響了我國人民的身體健康，也給社會和個人帶來了極大的經(jīng)濟負擔。對于肺癌，只有早期診斷、早期治療，才會獲得好的療效，但由于目前診斷手段自身的局限性[7]，致使60%～80%的肺癌患者因確診時已是中晚期而失去了最佳的治療時機[3]。

1869年，一名澳大利亞醫(yī)生在1例因腫瘤而死亡的患者外周血里發(fā)現(xiàn)了CTCs并因此首次提出了CTCs的概念[8]，CTCs來源于腫瘤原發(fā)灶或轉移灶，在腫瘤早期就可以進入血液循環(huán)，因此在腫瘤的早期診斷中具有重要應用價值。CHEN等[9]的研究發(fā)現(xiàn)，CTCs檢測在原發(fā)性肺癌及良性肺病和健康人組成的對照組中的陽性率分別為84.0%、4.2%，本研究也得到了同樣的結果，這提示CTCs檢測在肺癌的診斷中具有一定的應用價值。此外，在傳統(tǒng)的血清腫瘤標志物里，有研究者發(fā)現(xiàn)CEA、NSE、CA125、CA153、CYFRA21-1、SCCA在肺癌診斷中均具有一定價值，各項指標的靈敏度及特異度分別為42.50%、100.00%，47.67%、84.78%，34.88%、88.04%，17.50%、92.50%，64.44%、61.11%，30.20%、78.50%[10-12]。為了對CTCs檢測在肺癌中的診斷效能進行評價，本研究將CTCs在肺癌診斷中的靈敏度及特異度與傳統(tǒng)的血清腫瘤標志物進行了比較分析。結果顯示，CTCs在靈敏度方面高于傳統(tǒng)血清腫瘤標志物，而在特異度方面，CTCs高于NSE、CA125、CA153、CYFRA21-1、SCCA，僅低于CEA，但CEA的靈敏度要遠低于CTCs，說明CTCs檢測在肺癌的診斷中具有較高的靈敏度和特異度，具有較低的漏診率及誤診率，這與YE等[13]的研究結果基本符合。為了進一步探索CTCs在肺癌中的診斷價值，本研究使用并聯(lián)試驗對六項腫瘤標志物進行聯(lián)合檢測，結果顯示聯(lián)合檢測將腫瘤標志物的敏感性提高至94.3%，顯著高于CTCs檢測的靈敏度(77.1%)，但聯(lián)合檢測卻降低了腫瘤標志物的檢測特異度(33.3%)，遠低于CTCs(89.6%)，這提示腫瘤標志物聯(lián)合檢測在肺癌的早期篩查方面會優(yōu)于單項CTCs檢測，而CTCs檢測的費用較為昂貴，臨床醫(yī)師可先對可疑患者行腫瘤標志物的聯(lián)合檢測，當所有指標均陰性時，可囑患者定期復查；當聯(lián)合檢測陽性時，CTCs檢測具有較高的靈敏度及特異度，可做CTCs檢測，以先于組織活檢為臨床醫(yī)師提供參考。與此同時，本研究也使用ROC曲線對CTCs及傳統(tǒng)血清腫瘤標志物在肺癌中的診斷價值進行了比較，結果顯示，CTCs對肺癌診斷的ROC曲線下面積均高于CEA、NSE、CA125、CA153、CYFRA21-1、SCCA，說明CTCs檢測對肺癌的診斷價值比傳統(tǒng)的腫瘤標志物均要高，這與LI等[14]的研究結果基本符合。而在CTCs陽性表達與肺癌患者病理類型的關系分析中，發(fā)現(xiàn)CTCs在肺癌中的陽性表達與肺癌患者的病理類型無關，而傳統(tǒng)的血清腫瘤標志物均與肺癌的病理類型有關：CEA在肺腺癌患者血清中會異常升高[12]；NSE常作為小細胞肺癌的血清標志物[15]；CA125在肺腺癌患者血清中會異常升高[16]；CA153在肺腺癌患者血清中會異常升高[10]；CYFRA21-1常作為非小細胞肺癌的血清標志物[12]；SCCA常作為肺鱗癌的血清標志物[12]。而CTCs在肺癌中的陽性表達不受肺癌病理類型的影響，因此，在應用于肺癌的診斷中時，更具有優(yōu)勢。但本研究因經(jīng)費所限，也存在一些局限，即對照組樣本量較少，但有研究者報道CTCs、CEA、NSE、CA125、CA153、CYFRA21-1、SCCA在肺良性疾病和健康組中差異無統(tǒng)計學意義[9,17-20]，因此本研究將肺良性疾病組和健康組合并為一組進行了探討，與同類研究結果基本符合，結果較為可靠。

4 結 論

CTCs檢測在肺癌的診斷中具有較高的靈敏度及特異度，可將其作為輔助肺癌診斷的一種手段。