不同生長(zhǎng)階段斑馬魚(yú)對(duì)Cu2+的毒性響應(yīng)差異

廖 偉， 劉大慶， 馮承蓮,*， 金小偉， 劉 娜， 白英臣,， 吳代赦

1.南昌大學(xué)資源環(huán)境與化工學(xué)院， 鄱陽(yáng)湖環(huán)境與資源利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 江西 南昌 330031 2.中國(guó)環(huán)境科學(xué)研究院， 環(huán)境基準(zhǔn)與風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 北京 100012 3.江西省灌溉試驗(yàn)中心站， 江西 南昌 330201 4.中國(guó)環(huán)境監(jiān)測(cè)總站， 北京 100012

環(huán)境中的重金屬具有持久性和不可降解性，水域水體、沉積物中一旦重金屬含量增高，將危及或危害水生生物的生存和繁衍. Cu雖然在生物機(jī)體細(xì)胞代謝中起重要作用[1]，但Cu (主要指Cu2+)同樣會(huì)對(duì)水生生物具有較高毒性[2-5]. 研究[2,6-7]發(fā)現(xiàn)，我國(guó)太湖、遼河、鄱陽(yáng)湖等水域重金屬污染的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)均較高，其中Cu為潛在風(fēng)險(xiǎn)最大的重金屬元素之一，故選擇Cu作為目標(biāo)污染物具有重要意義.

目前，大部分研究主要考慮水質(zhì)因素如硬度[8-11]、pH[12-13]、溶解性有機(jī)碳(DOC)[12,14-16]等對(duì)重金屬污染物生物有效性的影響，而極少考慮水生生物不同生長(zhǎng)階段群體對(duì)污染物響應(yīng)的差異. 在進(jìn)行水環(huán)境基準(zhǔn)推算時(shí)，大部分環(huán)境管理文件提到原則上選擇最敏感生長(zhǎng)階段的毒性數(shù)據(jù)來(lái)推導(dǎo)基準(zhǔn)值. 常用的水生生物，如蝦的各生長(zhǎng)階段變化明顯，相關(guān)研究較多，但不同受試生物對(duì)污染物的最敏感生長(zhǎng)階段不同. 而魚(yú)作為最重要的水生生物類(lèi)群之一，不同生命階段對(duì)污染物敏感性的研究較少，所以選取合適的模式生物，合理區(qū)分其不同生長(zhǎng)階段，研究污染物對(duì)其不同階段毒性差異具有重要意義.

斑馬魚(yú)屬鯉科，具有生長(zhǎng)周期短、繁殖能力強(qiáng)、對(duì)污染物敏感等特點(diǎn)，是研究水生生物毒性效應(yīng)良好的模式生物之一. 目前我國(guó)已建立了斑馬魚(yú)國(guó)家資源中心，廣泛用于各種重金屬、有機(jī)物等化學(xué)物質(zhì)的毒性測(cè)試[17-21]. 現(xiàn)有研究?jī)H將斑馬魚(yú)分為胚胎、幼魚(yú)、成魚(yú)3個(gè)階段[22-24]來(lái)比較污染物對(duì)其毒性的差異，但并未提及階段劃分的依據(jù). 斑馬魚(yú)早幼期生長(zhǎng)發(fā)育速度快，易受外界干擾，僅分為胚胎、幼魚(yú)、成魚(yú)3個(gè)階段難以代表斑馬魚(yú)生命周期不同階段對(duì)待測(cè)有毒化合物敏感性的變化，因此，有必要對(duì)斑馬魚(yú)早幼期不同階段進(jìn)行細(xì)分，進(jìn)一步研究其對(duì)有毒化合物敏感性的差異變化.

該研究旨在探索我國(guó)常見(jiàn)的且已大規(guī)模使用的模式生物斑馬魚(yú)不同生長(zhǎng)階段劃分及分階段培養(yǎng)方法，并研究不同生長(zhǎng)階段斑馬魚(yú)對(duì)Cu2+的毒性響應(yīng)差異，以期為污染物生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)和水質(zhì)基準(zhǔn)研究中對(duì)受試生物不同階段的選取提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)用魚(yú)：受試生物為AB品系斑馬魚(yú)(Daniorerio)，購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所，已在實(shí)驗(yàn)室馴養(yǎng)5 a以上.

CuSO4·5H2O(五水合硫酸銅，GR)購(gòu)自上海國(guó)藥試劑廠；Cu標(biāo)準(zhǔn)溶液購(gòu)于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)網(wǎng)；CaCl2·2H2O(氯化鈣，AR)、MgSO4·7H2O(硫酸鎂，AR)、NaHCO3(碳酸氫鈉，AR)、KCl(氯化鉀，AR)等試劑均購(gòu)自上海國(guó)藥試劑廠；豐年蝦休眠卵購(gòu)自天津豐年水產(chǎn)養(yǎng)殖有限公司. 試驗(yàn)用所有容器均放入酸桶(10%～15%鹽酸)浸泡24 h，再用自來(lái)水、除氯水沖洗干凈.

1.2 主要儀器

MGC-350 HP-2人工智能氣候箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；CASA流水養(yǎng)殖系統(tǒng)(無(wú)錫中科水質(zhì)環(huán)境技術(shù)有限公司)；Leica M165C體式顯微鏡(徠卡微系統(tǒng)有限公司)；Mettler Toledo XPE205電子天平〔瑞士梅特勒-托利多國(guó)際貿(mào)易(上海)有限公司〕；Milli Q Direct8試驗(yàn)超純水機(jī)〔默瑞(上海)生物科技有限公司〕；Agilent7500a電感耦合等離子體質(zhì)譜儀(美國(guó)安捷倫科技有限公司)；YSI Professional Plus多參數(shù)水質(zhì)分析儀〔維賽儀器貿(mào)易(上海)有限公司〕；PHS-3E精密pH計(jì)(上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司).

1.3 斑馬魚(yú)培育方法

斑馬魚(yú)親魚(yú)飼養(yǎng)：置于流水養(yǎng)殖系統(tǒng)，飼養(yǎng)條件為溫度(25±1)℃、光強(qiáng) 1 000 lx、光暗比為16 h∶8 h. 水源為普通自來(lái)水經(jīng)過(guò)活性炭過(guò)濾曝氣后注入流水養(yǎng)殖系統(tǒng)，水質(zhì)硬度為(130±10)mg/L，pH為7.7±0.2，ρ(DO)>6 mg/L.

斑馬魚(yú)繁殖：夜晚將待產(chǎn)卵親魚(yú)放入孵化盒中，每個(gè)孵化盒放置兩雄、兩雌，第2天即可產(chǎn)卵.

根據(jù)斑馬魚(yú)的培養(yǎng)方法[25]、標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)方法[26-27]及實(shí)驗(yàn)室觀察，該研究將斑馬魚(yú)生命周期劃分為8個(gè)不同階段(見(jiàn)表1).

表1 不同生長(zhǎng)階段斑馬魚(yú)劃分描述

斑馬魚(yú)孵化：將斑馬魚(yú)受精卵收集到盛有曝氣自來(lái)水(經(jīng)0.45 μm濾膜過(guò)濾)的結(jié)晶皿中，加入約0.01%的亞甲基藍(lán)試劑，置于光強(qiáng)為 1 000 lx、光暗比為16 h∶8 h、溫度為(28±1)℃下孵化. 孵化密度以每0.5 L水放入60～80枚受精卵為宜，每6～8 h觀察1次，視情況換水. 該方法下，實(shí)驗(yàn)室斑馬魚(yú)受精卵 48～72 h可全部孵化，平均孵化率高于95%.

仔、幼魚(yú)飼養(yǎng)：孵化3～4 d后喂食經(jīng)碾磨的初孵化豐年蝦碎末及少量新鮮蛋黃水；7～8 d喂食初孵化豐年蝦，每天換水1次；14 d后放入流水養(yǎng)殖系統(tǒng)與成魚(yú)同條件飼養(yǎng).

成魚(yú)飼養(yǎng)：流水養(yǎng)殖系統(tǒng)飼養(yǎng)，早晚喂食孵化豐年蝦，培養(yǎng)條件與親魚(yú)一致.

孵化10 d后斑馬魚(yú)累積平均成活率為85.3%±4.5%，10 d后不同生長(zhǎng)階段斑馬魚(yú)平均成活率均高于95.0%，滿(mǎn)足試驗(yàn)方法中對(duì)受試生物成活率的要求.

1.4 斑馬魚(yú)生長(zhǎng)監(jiān)測(cè)

每個(gè)監(jiān)測(cè)階段至少設(shè)置6個(gè)平行組，監(jiān)測(cè)環(huán)境條件、飼養(yǎng)密度、喂食量等與試驗(yàn)受試魚(yú)相同，各階段成活率采用拍照計(jì)數(shù)的方法進(jìn)行測(cè)定. 斑馬魚(yú)體長(zhǎng)測(cè)定：孵化0～17 d內(nèi)采用拍照投影的方法測(cè)量，17 d后用直尺測(cè)量. 斑馬魚(yú)體質(zhì)量測(cè)定：孵化0～17 d內(nèi)一次稱(chēng)量5～200尾斑馬魚(yú)，再求其平均質(zhì)量；17 d后直接稱(chēng)量單尾魚(yú)質(zhì)量. 斑馬魚(yú)各生長(zhǎng)指標(biāo)見(jiàn)式(1)～(3).

魚(yú)體長(zhǎng)日均增長(zhǎng)率(GL)計(jì)算公式：

(1)

體質(zhì)量日均增長(zhǎng)率(GW)計(jì)算公式：

(2)

斑馬魚(yú)質(zhì)量指數(shù)(BMI)計(jì)算公式：

BMI=WILI2

(3)

式中：LI為某生長(zhǎng)階段初始體長(zhǎng)，mm；LF為某生長(zhǎng)階段末體長(zhǎng)，mm；WI為某生長(zhǎng)階段初始體質(zhì)量，g；WF為某生長(zhǎng)階段末體質(zhì)量，g；N為某生長(zhǎng)階段天數(shù)，d.

1.5 毒性暴露試驗(yàn)方法

斑馬魚(yú)急性毒性試驗(yàn)嚴(yán)格按照毒性試驗(yàn)操作進(jìn)行[26-27]. 采用單因子急性毒性測(cè)試方法，試驗(yàn)周期為96 h，不同生長(zhǎng)階段斑馬魚(yú)魚(yú)齡偏差均小于12 h(其中1 d幼魚(yú)魚(yú)齡偏差小于6 h)，根據(jù)魚(yú)大小選擇不同直徑的結(jié)晶皿或大燒杯，保證暴露液中魚(yú)的密度不超過(guò)0.5 g/L. 暴露試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)稀釋水按照標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)方法[26]要求配制，水體硬度為250 mg/L (以CaCO3計(jì))，模擬自來(lái)水則根據(jù)實(shí)驗(yàn)室自來(lái)水鈣鎂離子的濃度，配制成硬度約為125 mg/L (以CaCO3計(jì))的重組水. 使用前充分曝氣24 h，ρ(DO)>6.0 mg/L，pH為7.8±0.2，符合標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)方法[26]要求. 每個(gè)暴露濃度均設(shè)置3個(gè)平行，每個(gè)平行均放入10尾斑馬魚(yú)，采用半靜態(tài)試驗(yàn)方法，每24 h更換暴露液，以保證受試物質(zhì)的穩(wěn)定性及DO合格，暴露期間水溫、光照與培養(yǎng)條件保持一致. 試驗(yàn)期間觀察24、48、72、96 h魚(yú)的死亡(用玻璃棒輕觸魚(yú)的尾部，沒(méi)有反應(yīng)即認(rèn)為已死亡)情況，并記錄每個(gè)容器中魚(yú)死亡的數(shù)目，清出死魚(yú). 試驗(yàn)過(guò)程中，所有死亡以及試驗(yàn)后未死亡的魚(yú)均收集冷凍待集中處理. 試驗(yàn)期間，所有空白試驗(yàn)組斑馬魚(yú)死亡率均為0；經(jīng)電感耦合等離子體質(zhì)譜儀測(cè)量，Cu2+暴露液濃度實(shí)測(cè)值與理論值相差小于6%.

1.6 數(shù)據(jù)收集和篩選

Cu的水生生物毒性數(shù)據(jù)主要來(lái)源于已公開(kāi)發(fā)表的學(xué)術(shù)論文[6-7,28]，并檢索2014—2018年US EPA的毒性數(shù)據(jù)庫(kù)ECOTOX (http://cfpub.epa.gov/ecotox)、Web of Science和中國(guó)知網(wǎng)等文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)公開(kāi)發(fā)表的文獻(xiàn)數(shù)據(jù)作為補(bǔ)充. 毒性數(shù)據(jù)篩選規(guī)則參考 HJ 831—2017《淡水水生生物水質(zhì)基準(zhǔn)制定技術(shù)指南》[29]及文獻(xiàn)[30]，數(shù)據(jù)篩選后僅保留我國(guó)本土物種的毒性數(shù)據(jù)進(jìn)行比較.

1.7 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 22.0軟件Probit方法計(jì)算暴露試驗(yàn)的LC50(半致死濃度)及其95%置信區(qū)間，用Origin 8.0軟件制圖.

2 結(jié)果與分析

2.1 斑馬魚(yú)生長(zhǎng)監(jiān)測(cè)

通過(guò)對(duì)不同性別斑馬魚(yú)體長(zhǎng)、體質(zhì)量數(shù)據(jù)進(jìn)行模擬發(fā)現(xiàn)，logistic增長(zhǎng)方程能較好地?cái)M合斑馬魚(yú)雌魚(yú)、雄魚(yú)的體長(zhǎng)與體質(zhì)量之間變化規(guī)律(見(jiàn)表2).

不同生長(zhǎng)階段斑馬魚(yú)各生長(zhǎng)指標(biāo)變化情況如圖1所示. 由圖1可見(jiàn)，斑馬魚(yú)在17～24 d內(nèi)生長(zhǎng)最快，90 d后斑馬魚(yú)體長(zhǎng)增長(zhǎng)率降至低點(diǎn)；120 d后斑馬魚(yú)體質(zhì)量增長(zhǎng)速率也降至最低，第120天斑馬魚(yú)質(zhì)量指數(shù)與第90天時(shí)基本持平.

試驗(yàn)監(jiān)測(cè)表明，在食物充足情況下，斑馬魚(yú)的體長(zhǎng)、體質(zhì)量變化均符合logistic增長(zhǎng)方程，90 d后斑馬魚(yú)達(dá)到生殖水平. 第90天斑馬魚(yú)已接近成魚(yú)體長(zhǎng)，而體質(zhì)量方面，由于斑馬魚(yú)親魚(yú)繁殖需要，90 d后其體質(zhì)量還保持一定的增長(zhǎng)率. 由圖1可見(jiàn)，第150天斑馬魚(yú)體質(zhì)量日均增長(zhǎng)率高于第120天，除斑馬魚(yú)生殖能量?jī)?chǔ)備外，還一個(gè)重要原因是120 d后斑馬魚(yú)的飼養(yǎng)密度降低，減少了斑馬魚(yú)的生存環(huán)境壓力，使得體質(zhì)量日均增長(zhǎng)率及質(zhì)量指數(shù)升高.

表2 斑馬魚(yú)體長(zhǎng)與體質(zhì)量之間的擬合結(jié)果

注：x為魚(yú)齡，d；y為體長(zhǎng)或體質(zhì)量，mm或g.

圖1 不同生長(zhǎng)階段斑馬魚(yú)各生長(zhǎng)指標(biāo)變化情況Fig.1 The variation of indicators at different growth stages of zebrafish

由圖1可見(jiàn)：魚(yú)齡在10 d前，斑馬魚(yú)無(wú)論是體長(zhǎng)率還是體質(zhì)量的日均增長(zhǎng)率率均十分緩慢；17 d后稚魚(yú)能主動(dòng)捕食活體豐年蝦，并能快速吸收并合成自身需要的物質(zhì)，此時(shí)斑馬魚(yú)稚魚(yú)體長(zhǎng)日均增長(zhǎng)率較10 d快速增加，且17 d時(shí)體質(zhì)量日均增長(zhǎng)率約是10 d的14倍；24 d時(shí)斑馬魚(yú)幼魚(yú)的體長(zhǎng)、體質(zhì)量日均增長(zhǎng)率均為全生命周期最快的時(shí)期，此階段斑馬魚(yú)幼魚(yú)活動(dòng)范圍較17 d時(shí)有了較大提高，外表體型均接近成魚(yú)；31 d后斑馬魚(yú)幼魚(yú)體長(zhǎng)、體質(zhì)量日均增長(zhǎng)率較24 d時(shí)均有所下降，但體長(zhǎng)日均增長(zhǎng)率仍保持次高速率增長(zhǎng)，體質(zhì)量日均增長(zhǎng)率較17和24 d時(shí)有所減緩，該階段斑馬魚(yú)幼魚(yú)活動(dòng)范圍已涉及整個(gè)魚(yú)缸，能夠自由游動(dòng)，外表進(jìn)一步接近成魚(yú)；60 d時(shí)斑馬魚(yú)幼魚(yú)體長(zhǎng)、體質(zhì)量日均增長(zhǎng)率較31 d時(shí)進(jìn)一步放緩，體長(zhǎng)已經(jīng)達(dá)成魚(yú)體長(zhǎng)的75%，體質(zhì)量日均增長(zhǎng)率仍然保持較高水平；90 d時(shí)斑馬魚(yú)體長(zhǎng)、體質(zhì)量日均增長(zhǎng)率較60 d時(shí)進(jìn)一步放緩，但由于斑馬魚(yú)體長(zhǎng)和體質(zhì)量基數(shù)大，該階段處于最大的絕對(duì)增長(zhǎng)量；90 d后斑馬魚(yú)體長(zhǎng)已經(jīng)接近成魚(yú)平均水平，而體質(zhì)量則在120 d后與成魚(yú)平均水平相當(dāng). 綜上，將斑馬魚(yú)分為仔魚(yú)階段(1 d、10 d)，稚魚(yú)階段(17 d)，幼魚(yú)階段(24、31、60 d)和成魚(yú)階段(90、120 d)，符合斑馬魚(yú)的生長(zhǎng)規(guī)律.

2.2 不同生長(zhǎng)階段斑馬魚(yú)對(duì)Cu2+的毒性差異

我國(guó)魚(yú)類(lèi)急性毒性測(cè)試標(biāo)準(zhǔn)方法均采用硬度為250 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)稀釋水溶液，但其與實(shí)際環(huán)境中水的硬度存在較大差異[31]，而水體硬度又是影響Cu2+水生生物毒性的重要因素之一[9,32-33]，故該研究根據(jù)實(shí)驗(yàn)室自來(lái)水鈣鎂離子濃度，配制了硬度為125 mg/L的模擬自來(lái)水，分別研究標(biāo)準(zhǔn)稀釋水和模擬自來(lái)水下Cu2+對(duì)不同生長(zhǎng)階段斑馬魚(yú)的毒性，結(jié)果如圖2所示.

圖2 不同水質(zhì)條件下各生長(zhǎng)階段斑馬魚(yú)對(duì)Cu2毒性的響應(yīng)差異Fig.2 The toxicity response of zebrafish to Cu2+ at different growth stages under different water quality conditions

由圖2可見(jiàn)：標(biāo)準(zhǔn)稀釋水條件下，Cu2+對(duì)不同生長(zhǎng)階段斑馬魚(yú)的毒性隨暴露時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增大，Cu2+對(duì)斑馬魚(yú)各階段24 h-LC50、48 h-LC50、72 h-LC50、96 h-LC50的幾何平均值分別為0.54、0.42、0.38和0.36 mg/L；從不同生長(zhǎng)階段劃分來(lái)看，Cu2+對(duì)斑馬魚(yú)的96 h-LC50分別為0.425 mg/L (1 d)、0.768 mg/L (10 d)、0.550 mg/L (17 d)、0.309 mg/L (24 d)、0.334 mg/L (31 d)、0.327 mg/L (60 d)、0.230 mg/L (90 d)和0.180 mg/L (120 d)，表明隨著魚(yú)齡的增加，Cu2+對(duì)斑馬魚(yú)的毒性不斷增大，不同生長(zhǎng)階段斑馬魚(yú)對(duì)Cu2+的敏感性順序?yàn)?20 d>90 d>24 d>60 d>31 d>1 d>17 d>10 d.

由圖2可見(jiàn)：模擬自來(lái)水條件下，Cu2+對(duì)斑馬魚(yú)各生長(zhǎng)階段的毒性隨暴露時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增大，Cu2+對(duì)斑馬魚(yú)各生長(zhǎng)階段24 h-LC50、48 h-LC50、72 h-LC50、96 h-LC50的幾何平均值分別為0.36、0.28、0.25和0.24 mg/L；從不同生長(zhǎng)階段劃分來(lái)看，Cu2+對(duì)斑馬魚(yú)的96 h-LC50分別為0.377 mg/L (1 d)、0.438 mg/L (10 d)、0.366 mg/L (17 d)、0.201 mg/L (24 d)、0.206 mg/L (31 d)、0.189 mg/L (60 d)、0.167 mg/L (90 d)和0.144 mg/L (120 d)，結(jié)果表明隨著魚(yú)齡的增加，Cu2+對(duì)斑馬魚(yú)毒性增大，不同生長(zhǎng)階段斑馬魚(yú)對(duì)Cu2+的敏感性順序?yàn)?20 d>90 d>60 d>24 d>31 d>1 d>17 d>10 d. 模擬自來(lái)水條件下，Cu2+對(duì)斑馬魚(yú)各生長(zhǎng)階段毒性變化情況與標(biāo)準(zhǔn)稀釋水試驗(yàn)結(jié)果一致.

2.3 不同生長(zhǎng)階段斑馬魚(yú)毒性差異在Cu2+的物種敏感度分布變化

為研究不同生長(zhǎng)階段斑馬魚(yú)對(duì)Cu2+敏感性差異在Cu物種敏感度分布圖中的變化情況，將Cu2+對(duì)不同生長(zhǎng)階段斑馬魚(yú)96 h-LC50毒性數(shù)據(jù)加入Cu的物種敏感度分布圖中進(jìn)行比較. 圖3為不同生長(zhǎng)階段斑馬魚(yú)對(duì)Cu2+敏感性在Cu物種敏感度分布圖中的位置，其中每個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)生物毒性數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)的毒性終點(diǎn)均為標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)下的LC50或EC50(半數(shù)效應(yīng)濃度)，除斑馬魚(yú)外，其他物種不進(jìn)行生長(zhǎng)階段劃分. 物種敏感度分級(jí)參考文獻(xiàn)[34-36]：累積概率小于5%，屬于非常敏感；累積概率為5%～15%，屬于敏感；累積概率為15%～30%，屬于較敏感；累積概率為 30%～50%，屬于相對(duì)不敏感；累積概率大于50%，屬于不敏感.

注： DW—標(biāo)準(zhǔn)稀釋水； TW—模擬自來(lái)水. 除斑馬魚(yú)外，其他物種毒性數(shù)據(jù)來(lái)自文獻(xiàn)[6-7,28].圖3 不同生長(zhǎng)階段斑馬魚(yú)在Cu物種敏感度分布Fig.3 Species sensitivity distributions for Cu2+ under different life-stage

由圖3可見(jiàn)：Cu2+對(duì)水生生物的急性毒性數(shù)據(jù)量為152個(gè)，該研究中最敏感的為模擬自來(lái)水下120 d成魚(yú)期斑馬魚(yú)(排序第37位)，累積概率為24.18%，屬于較敏感物種；標(biāo)準(zhǔn)稀釋水下120 d成魚(yú)期斑馬魚(yú)排在第50位，累積概率為32.68%，屬于相對(duì)不敏感物種；而10 d仔魚(yú)期斑馬魚(yú)在模擬自來(lái)水和標(biāo)準(zhǔn)稀釋水下的排序分別為第111和129位，累積概率分別為72.55%和84.31%，均屬于不敏感物種. 研究發(fā)現(xiàn)，不同生長(zhǎng)階段斑馬魚(yú)對(duì)Cu2+的敏感性在Cu2+的物種敏感度分布中變化顯著，且成魚(yú)敏感性高于幼魚(yú)敏感性.

3 討論

由于發(fā)育完善程度、代謝速率等不同，生物的不同生長(zhǎng)階段對(duì)污染物毒性響應(yīng)的敏感性存在差異. 研究[37]表明，生物體在胚胎發(fā)育、性分化和性成熟期對(duì)污染物較敏感. 該研究將斑馬魚(yú)分為8個(gè)不同生長(zhǎng)階段，發(fā)現(xiàn)1、24、90和120 d的斑馬魚(yú)均處于相對(duì)敏感期，但敏感性總體趨勢(shì)為成魚(yú)階段(120、90 d)>幼魚(yú)階段(60 、31、24 d)>卵黃囊仔魚(yú)期(1 d)>稚魚(yú)期(17 d)>晚期仔魚(yú)期(10 d).

蔣金花等[22]研究發(fā)現(xiàn)，三唑酮對(duì)斑馬魚(yú)毒性大小的規(guī)律為成魚(yú)(90 d)>幼魚(yú)(55 d)>仔魚(yú)(8 d)，與筆者研究結(jié)果一致. 程艷紅等[23]研究斑馬魚(yú)不同生長(zhǎng)階段的急性毒性效應(yīng)時(shí)發(fā)現(xiàn)，乙草胺、丁草胺對(duì)斑馬魚(yú)毒性大小表現(xiàn)為仔魚(yú)(8 d)>成魚(yú)(90 d)>幼魚(yú)(55 d)，丙草胺對(duì)斑馬魚(yú)毒性大小表現(xiàn)為仔魚(yú)(8 d)、成魚(yú)(90 d)>幼魚(yú)(55 d)，成魚(yú)敏感性大于幼魚(yú)敏感性，與該研究結(jié)論一致. 但仔魚(yú)(8 d)毒性敏感性與筆者研究結(jié)果不一致，這與不同實(shí)驗(yàn)室的仔魚(yú)選取時(shí)間和養(yǎng)殖方式有較大關(guān)系，因?yàn)榘唏R魚(yú)在8 d左右，其卵黃囊剛耗盡，失去卵黃囊提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，體弱的斑馬魚(yú)容易死亡，從而導(dǎo)致仔魚(yú)(8 d)敏感性增加.

大量研究表明，重金屬污染物對(duì)無(wú)脊椎動(dòng)物毒性表現(xiàn)為幼年期大于成年期. 如Soegianto等[38-39]研究發(fā)現(xiàn)，幼蝦對(duì)Pb和Cu最敏感；Madhav等[40]研究發(fā)現(xiàn)，7 d鹵蟲(chóng)藻對(duì)Cu最敏感，而成年鹵蟲(chóng)藻對(duì)Cu最不敏感；Verriopoulos等[41]研究發(fā)現(xiàn)，Cu對(duì)橈足類(lèi)水蚤的毒性大小表現(xiàn)為1 d>5 d>10 d. 由于重金屬對(duì)不同生長(zhǎng)階段魚(yú)類(lèi)致毒機(jī)理復(fù)雜，研究結(jié)果沒(méi)有特定的規(guī)律. TANG等[42]發(fā)現(xiàn),Cu對(duì)15 d白鱘的毒性高于對(duì)48及139 d白鱘的毒性，但Cd對(duì)48 d白鱘的毒性高于對(duì)15和139 d白鱘的毒性. Mcnulty等[43]研究Cu對(duì)擬銀漢魚(yú)年齡特異性差異時(shí)發(fā)現(xiàn)，年齡在0、3、5 d的擬銀漢比年齡≥7 d的擬銀漢對(duì)Cu更不敏感，原因是魚(yú)在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中由皮膚呼吸為主逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)槿粑鼮橹?，隨著魚(yú)齡增大，增加腮損傷或功能障礙導(dǎo)致幼魚(yú)的敏感性增加，另外該研究表明擬銀漢魚(yú)早幼期階段腮的表面積增加超過(guò)7倍，而皮膚表面積在同一時(shí)期只增長(zhǎng)了3倍. 該研究發(fā)現(xiàn)，Cu2+對(duì)斑馬魚(yú)各生長(zhǎng)階段的毒性在10、17和24 d隨魚(yú)齡的增加而增大，24 d后無(wú)顯著差異，但31 d略高于24 d. Cu的主要致毒機(jī)理為游離Cu (Cu2+)進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)膜，增加質(zhì)膜的滲透性，引起鈉等其他離子流失，破壞離子平衡、提升血液粘度，造成心力衰竭等癥狀，導(dǎo)致生物死亡[19,44]. 在斑馬魚(yú)馴養(yǎng)過(guò)程中研究發(fā)現(xiàn)，斑馬魚(yú)孵化12 h后有50%的仔魚(yú)能平游，但前期生長(zhǎng)十分緩慢，呼吸頻率低，且10 d仔魚(yú)基本靠卵黃囊維持生命. 該階段大部分斑馬魚(yú)死亡癥狀為畸形，失去游泳能力等，再停止心跳. 相對(duì)于發(fā)育相對(duì)完善的小魚(yú)來(lái)說(shuō)，仔魚(yú)活動(dòng)能力弱、新陳代謝慢，且主要靠皮膚與暴露液毒性離子接觸，從而減少了暴露液毒性離子進(jìn)入魚(yú)體內(nèi)的途徑，故該階段斑馬魚(yú)對(duì)暴露液毒性物質(zhì)的敏感性低. 17 d后斑馬魚(yú)稚魚(yú)活動(dòng)能力提升，捕食能力增強(qiáng)、活動(dòng)頻率提高，新陳代謝加快，呼吸頻率較之前快，此時(shí)斑馬魚(yú)可能慢慢由皮膚接觸為主轉(zhuǎn)化為魚(yú)鰓接觸為主，所以17 d幼魚(yú)對(duì)Cu2+敏感性高于10 d幼魚(yú). 但24、31 d幼魚(yú)對(duì)Cu2+的敏感性顯著高于17 d幼魚(yú)，斑馬魚(yú)在17 d后處于快速生長(zhǎng)期，此時(shí)斑馬魚(yú)幼魚(yú)無(wú)論從體長(zhǎng)還是體質(zhì)量均高于前期[45]. 60 d后隨著斑馬魚(yú)體長(zhǎng)和體質(zhì)量的快速增加，其新陳代謝速率不斷加快，極大地增強(qiáng)了魚(yú)各組織(如魚(yú)鰓)與外界溶液的交流，90 d后斑馬魚(yú)性成熟，進(jìn)入繁殖期，魚(yú)體對(duì)污染物的敏感性進(jìn)一步增大，所以該研究中Cu2+對(duì)斑馬魚(yú)成魚(yú)的毒性大小為成魚(yú)階段>幼魚(yú)階段>稚魚(yú)階段>仔魚(yú)階段.

4 結(jié)論

a) 斑馬魚(yú)在食物充足情況下，體長(zhǎng)、體質(zhì)量的變化均符合logistic增長(zhǎng)方程，90 d斑馬魚(yú)接近成魚(yú)平均體長(zhǎng)，且達(dá)到生殖水平. 根據(jù)斑馬魚(yú)生長(zhǎng)監(jiān)測(cè)結(jié)果確定斑馬魚(yú)的不同生長(zhǎng)階段，即卵黃囊仔魚(yú)期(1 d)、晚期仔魚(yú)期(10 d)、稚魚(yú)期(17 d)、早幼期(24 d)、幼魚(yú)期(31 d)、發(fā)育期(60 d)、成熟期(90 d)、成魚(yú)期(120 d)等8個(gè)生長(zhǎng)階段.

b) 從不同生長(zhǎng)階段劃分來(lái)看，Cu2+對(duì)不同生長(zhǎng)階段斑馬魚(yú)的毒性表現(xiàn)為120 d>90 d>24 d>60 d>31 d>1 d>17 d>10 d，隨著魚(yú)齡的增加，Cu2+對(duì)斑馬魚(yú)的毒性逐漸增大；將試驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)合文獻(xiàn)數(shù)據(jù)構(gòu)成Cu2+的物種敏感度分布，結(jié)果顯示成魚(yú)期斑馬魚(yú)為較敏感物種，而晚期仔魚(yú)期斑馬魚(yú)為不敏感物種，受試生物的不同生長(zhǎng)階段對(duì)污染物的敏感性存在較大差異.

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