桔梗根腐病病原鑒定及防治藥劑篩選初報(bào)

唐菲菲

摘 ? 要 ? 對(duì)桔梗根腐病癥狀觀察、病原菌分離、病原菌形態(tài)觀察及接菌和再分離，桔梗根腐病病原鑒定為鐮刀菌。同時(shí)采用室內(nèi)生長(zhǎng)速率法比較了15種殺菌劑對(duì)桔梗根腐病的毒力作用。結(jié)果表明，不同殺菌劑在抑制菌絲生長(zhǎng)程度上存在差異，其中10%氟嗎啉·50%代森錳鋅WP對(duì)桔梗根腐病菌菌絲生長(zhǎng)有明顯的抑制效果，其 EC50值為0.000 12 μg·mL-1;50%多菌靈WP對(duì)桔梗根腐病病菌菌絲的生長(zhǎng)抑制效果較好，其EC50值為0.205 01μg·mL-1，以上這兩種藥劑可作為桔梗根腐病田間藥效試驗(yàn)的首選藥劑。其他藥劑如百菌清、凱潤、嘧菌脂、代森錳鋅和瑞對(duì)桔梗根腐病病菌菌絲生長(zhǎng)的抑制效果差。

關(guān)鍵詞 ? ?桔梗;鐮刀菌;病原形態(tài);生長(zhǎng)速率法;EC50

中圖分類號(hào)：S435.672 ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A ? ?DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2020.1.007

桔梗（Platycodon grandiforus），是桔?？疲–ampanulaceae）桔梗屬（Platycodon）的一種多年生草本植物。桔梗也叫鈴鐺花、白藥、土人參等，以根入藥，除藥用外，還可以用于釀酒、菜食及作為觀賞花卉栽培。桔梗味苦、辛，性平[1]。主要分布于中國、朝鮮半島、日本和西伯利亞東部。桔梗體內(nèi)有乳汁，全株光滑無毛。根粗大肉質(zhì)，圓錐形或有分叉，外皮黃褐色。莖直立，有分枝;葉多為互生，少數(shù)對(duì)生，近無柄，葉片卵形或卵狀披針形，邊緣有鋸齒;花大型，藍(lán)紫色或藍(lán)白[2]。朝鮮族人把桔梗的根用作野菜食用，有宣肺、利咽、祛痰、排膿功效?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，桔梗還有降血糖、降血脂、鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、解熱、擴(kuò)張血管、減慢心率、抗?jié)兊裙πА?/p>

病害嚴(yán)重一直是影響桔梗產(chǎn)量的主要因素。據(jù)調(diào)查，桔梗病害主要有兩大類，一類是莖葉上的病害，主要有輪紋?。ˋscochyta.sp）、斑枯?。⊿eptiria platycodonis Sdy.）、炭疽?。–olletotrichum sp.）;另一類是根部病害，主要有立枯?。≧hizoctonia solani）、枯萎病（Fusarium）、根腐?。‵usarium sp.）、紫紋羽病菌（Helicobasidium mompa Tanaka）、根結(jié)線蟲?。∕eloidoyne incognite）等[3]。其中根部病害是影響桔梗產(chǎn)量的主要病害，危害程度不容忽視。

近年來，根腐病已經(jīng)成為影響桔梗生產(chǎn)的主要病害之一，但生產(chǎn)中仍然有很多人對(duì)其認(rèn)識(shí)不足、重視不夠，往往錯(cuò)過最佳防治時(shí)機(jī)，使病害難以得到有效防控。因此，迫切需要尋找高效、低毒、低殘留的藥劑來進(jìn)行防治。本試驗(yàn)對(duì)吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)藥植園中的患病桔梗進(jìn)行病原菌的分離和鑒定，并做了大量的室內(nèi)藥劑篩選工作，以期篩選出對(duì)桔梗病害防效好、安全環(huán)保、不影響桔梗產(chǎn)量和品質(zhì)的農(nóng)藥種類，為生產(chǎn)上科學(xué)用藥提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病害癥狀描述

2018年7月，在吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)植物園發(fā)現(xiàn)桔梗根腐病發(fā)生非常嚴(yán)重，尤其是在地勢(shì)低洼地的桔梗根腐病發(fā)病率將近100%。

1.2 病原菌分離與純化

組織分離法對(duì)在吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)藥園采集到的桔梗進(jìn)行分離，用刀片切取病健交界處病組織若干塊，大小為2 mm×2 mm，放在0.1%升汞中消毒0.5 min，再用無菌水沖洗3次，置于PDA培養(yǎng)基上，每皿2～4塊，在25 ℃恒溫培養(yǎng)箱下培養(yǎng)。

PDA培養(yǎng)基配方：馬鈴薯200 g、葡萄糖18 g、瓊脂16 g、蒸餾水1 000 mL。

將在平板培養(yǎng)基上分離出的菌絲連同培養(yǎng)基一起挑出，移植到另一PDA培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3 病原菌致病性測(cè)定

采用傷口接種法，將保存的待試菌株接種到PDA平板上活化，25 ℃下培養(yǎng)。7 d后，用無菌水將健康桔梗莖（根）沖洗干凈，用刀片割傷桔梗莖（根）。將PDA上的菌種分成大小均等的四塊菌餅，用無菌水將脫脂棉濕潤，將菌餅放入脫脂棉中，用透明膜將脫脂棉包在桔梗傷口處（注意用菌餅對(duì)準(zhǔn)傷口），以無菌水接種健康桔梗莖（根）為對(duì)照，每隔3天觀察一次，并記錄發(fā)病情況。

1.4 病原菌形態(tài)學(xué)鑒定

對(duì)接種發(fā)病的菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，包括對(duì)病原菌在培養(yǎng)基上形成的菌落形態(tài)、色澤。觀察病原菌分生孢子的大小、形態(tài)，并做好記錄。

1.5 室內(nèi)藥劑篩選

供試菌種為分離獲得的病原菌。供試殺菌劑有15種，其藥劑名稱、有效成分、生產(chǎn)單位詳見表1。

1.5.1 試驗(yàn)方法

采用生長(zhǎng)速率法進(jìn)行測(cè)定，在滅菌融化并冷卻到40～50 ℃的9 mL PDA 培養(yǎng)基中加入1 mL藥液，搖勻注入直徑 90 mm的培養(yǎng)皿中制成含毒平板。對(duì)照處理加入1 mL滅菌水。每種藥劑按高濃度到低濃度（1×104 mg·L-1、1×103 mg·L-1、1×102 mg·L-1、10 mg·L-1、1 mg·L-1、0.1 mg·L-1）順序，每個(gè)處理設(shè)3次重復(fù)。帶藥平板靜置冷卻后，將試驗(yàn)前3 d擴(kuò)繁的根腐病菌平板，用打孔器打成直徑為 8 mm的菌餅置于含藥平板中，每皿3塊菌餅，均勻放置，置于25 ℃恒溫箱中培養(yǎng)，待培養(yǎng)72 h后用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，并做記錄。

1.5.2 計(jì)算方法

根據(jù)公式：抑制率（%）=（對(duì)照組菌落直徑-處理組菌落直徑）/（對(duì)照組菌落直徑-菌碟原始直徑）×100;求出生長(zhǎng)抑制率，將其換算成幾率值，藥劑濃度取對(duì)數(shù)值，建立“濃度對(duì)數(shù)-幾率值”直線方程，即y=a+bx（y為幾率值，x為稀釋倍數(shù)的對(duì)數(shù)）。進(jìn)行相關(guān)顯著性分析，根據(jù)直線回歸方程，當(dāng)取y=5時(shí)，求得的x值的負(fù)對(duì)數(shù)即為EC50的值，比較病原菌對(duì)各種藥劑的敏感程度。

2 結(jié)果與分析

2.1 病害癥狀描述

該病菌主要為害桔梗根部，發(fā)病初期在近地面的根頭部位出現(xiàn)褐色壞死，逐漸向下蔓延，15～20 d即可引起全根壞死，后因腐生菌侵入，導(dǎo)致壞死組織軟腐分解，僅殘留外皮[4];同時(shí)地上部莖葉逐漸變黃，此時(shí)莖內(nèi)導(dǎo)管并不變色。當(dāng)整個(gè)肉質(zhì)根變褐壞死，地上部莖、葉也萎蔫死亡。

2.2 菌種純化培養(yǎng)

用組織分離法獲得純化菌株在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)，使用時(shí)轉(zhuǎn)至PDA平板培養(yǎng)基上活化。

2.3 致病性測(cè)定

用傷口法接種7 d后均開始發(fā)病，呈褐色病斑，與自然發(fā)病病斑相比顏色較淺。對(duì)照莖（根）未見發(fā)病，從以上接種的發(fā)病莖（根）再分離的病菌與原接種菌株相同，因此證實(shí)原接種菌株為致病菌（見圖1）。

2.4 病原菌形態(tài)學(xué)鑒定

在PDA平板上培養(yǎng)，菌落突起絮狀，菌絲白色質(zhì)密。菌落初期為白色，后期產(chǎn)生色素，呈粉白色、淺粉色，略帶有紫色。小型分生孢子單細(xì)胞，橢圓形至卵圓形，分生孢子大?。?.04～15.93） μm×（1.64～6.06） μm;大型分生孢子鐮刀形，少許彎曲，分生孢子大小（24.39～44.54） μm×（3.26～7.31） μm，多數(shù)為三個(gè)隔膜，少數(shù)有1～2個(gè)隔膜，鑒定為尖孢鐮刀菌（F.oxysporum）（見圖2、圖3）。

2.5 室內(nèi)藥劑篩選結(jié)果

根據(jù)供試菌碟在含毒平板上菌落直徑的大小計(jì)算抑制率，求得各藥劑對(duì)病菌的毒力回歸方程及EC50見表2。由表2可知，300億/g蠟質(zhì)芽孢桿菌WP、50%多菌靈WP、30%氟菌唑WP對(duì)桔梗根腐病菌菌絲生長(zhǎng)的抑制效果最好，其EC50值0.000 121、0.205 011、

1.359 245 μg·mL-1;10%氟嗎啉·50%代森錳鋅WP、1×106 cfu/g寡雄腐霉WP、10%苯醚甲環(huán)唑WG對(duì)桔梗根腐病菌菌絲抑制效果較好，其EC50值分別為5.766 748、6.751 321、8.040 113 μg·mL-1，以上這幾種藥劑是防治桔梗根腐病的首選藥劑;其次10%多抗霉素BWP、40%氟硅唑EC、1億/g枯草芽孢桿菌WP、25%丙環(huán)唑EC沒有明顯的抑制效果;250 g·L-1吡唑醚菌酯EC、250 g·L-1嘧菌酯SC、70%代森錳鋅WP、50%嘧菌環(huán)胺WG對(duì)桔梗根腐病病菌幾乎沒有抑制效果。

3 結(jié)論與討論

試驗(yàn)結(jié)果表明，引起桔梗根腐病的病原菌是尖孢鐮刀菌。15種藥劑對(duì)桔梗根腐病病菌的室內(nèi)毒力測(cè)定結(jié)果表明，300億/g蠟質(zhì)芽孢桿菌WP、50%多菌靈WP、30%氟菌唑WP對(duì)桔梗根腐病菌菌絲生長(zhǎng)的抑制效果最好，10%氟嗎啉·50%代森錳鋅WP、1×106 cfu /g寡雄腐霉WP、10%苯醚甲環(huán)唑WG對(duì)桔梗根腐病菌菌絲的抑制效果較好，以上幾種藥劑可作為桔梗根腐病田間藥效試驗(yàn)的首選藥劑;而10%多抗霉素BWP、40%氟硅唑EC、1億/g枯草芽孢桿菌WP、25%丙環(huán)唑EC沒有明顯的抑制效果，250 g·L-1吡唑醚菌酯EC、250 g·L-1嘧菌酯SC、70%代森錳鋅WP、50%嘧菌環(huán)胺WG對(duì)桔梗根腐病病菌菌絲幾乎沒有抑制效果。

本試驗(yàn)結(jié)果表明：300億/g蠟質(zhì)芽孢桿菌WP對(duì)桔梗根腐病病菌菌絲生長(zhǎng)的抑制效果最好，其相關(guān)研究尚未見報(bào)道。50%多菌靈WP對(duì)桔梗根腐病病菌菌絲抑制效果較好，與朱京斌等用多菌靈蘸根對(duì)桔梗根腐病的防治效果很好的研究結(jié)果[5]相一致。本研究為殺菌劑的室內(nèi)毒力測(cè)定，還需進(jìn)行田間藥效試驗(yàn)來確定藥劑稀釋濃度?！熬G亨一號(hào)”“綠亨二號(hào)”是目前較先進(jìn)的新型內(nèi)吸殺菌劑，性能穩(wěn)定，安全可靠，是防治土傳病害的理想藥劑，可大面積推廣應(yīng)用[6]。

筆者認(rèn)為，本試驗(yàn)篩選出了300億/g蠟質(zhì)芽孢桿菌WP是防治桔梗根腐病的首選藥劑，可以在大田試驗(yàn)中推廣應(yīng)用。目前，大多數(shù)研究者認(rèn)為多菌靈是防治根腐病的首選藥劑[7-9]。長(zhǎng)期使用某種藥劑會(huì)使病原菌產(chǎn)生抗藥性，因此藥劑的輪換使用是十分必要的。藥劑防治多少都會(huì)對(duì)環(huán)境造成污染，需要我們繼續(xù)研究高效的生物防治技術(shù)，以減少對(duì)環(huán)境的污染。采取一定的農(nóng)業(yè)防治也是有必要的[10]，忌連作，最好是與禾本科作物輪作;要及時(shí)防治地下害蟲[11]，因?yàn)榈叵潞οx對(duì)植物造成的傷口往往使病菌有機(jī)可乘，也是植物發(fā)病的主要原因之一。

藥劑對(duì)病菌的EC50值并不能完全代表該藥劑的田間防治效果，如果單純根據(jù)室內(nèi)毒力測(cè)定結(jié)果來判斷殺菌劑的抑菌效果，往往讓室內(nèi)抑菌效果差的藥劑過早被淘汰，失去進(jìn)入田間藥效試驗(yàn)的機(jī)會(huì)，這與劉峰等的觀點(diǎn)一致[12]，因此需要根據(jù)進(jìn)一步的田間藥效試驗(yàn)結(jié)果來確定理想藥劑。

參考文獻(xiàn)：

[1] 孫慧杰.桔便的生物學(xué)特征及栽培技術(shù)[J].長(zhǎng)春中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2005，21（4）：32.

[2] 金江山，嚴(yán)一字，王麗麗，等.桔梗根部性狀生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)研究[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010（2）： 259-260.

[3] 韓金聲.中國藥用植物病害[M].長(zhǎng)春：吉林科技出版社，1990.

[4] 吳悅明，孫芙蓉，徐玉芳，等.桔梗根腐病發(fā)生原因及防治措施研究[J].山東農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2008，39（3）：424-428.

[5] 朱京斌，陳慶亮，單成鋼，等.桔梗主要病蟲害及其防治[J].北方園藝，2010（21）：194-195.

[6] 左五洲，張春強(qiáng)，王淑芝，等.幾種藥劑防治辣椒根腐?。ㄋ揽茫┨镩g藥效試驗(yàn)[J].中國農(nóng)技推廣，2001（6）：47.

[7] 駱平西，許毅濤，王拱辰，等.三七根腐病病原鑒定及藥劑防治研究[J].西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，1991，4（2）：77-80.

[8] 張承志.黨參根腐病及其防治[J].基層中藥雜志，1993，7（4）：33.

[9] 滿昌偉，劉運(yùn)榮.大棚辣椒根腐病的防治技術(shù)[J].植物醫(yī)生，1999（1）：19.

[10] 李東.稀有蔬菜桔梗病害綜合防治[J].農(nóng)業(yè)科技通訊，2000（7）：28.

[11] 羅文富，喻盛甫，賀承福，等.三七根腐病病原及復(fù)合侵染的研究[J].1997，27（1）：85-91.

[12] 劉峰，慕衛(wèi)，張文吉，等.殺菌劑對(duì)水稻旱育秧立枯病的控制作用及其對(duì)秧苗的生理效應(yīng)[J].農(nóng)藥學(xué)學(xué)報(bào)，2004，6（2）：37-42.

（責(zé)任編輯：易 ?婧）