二十五種中草藥對(duì)煙草普通花葉病毒病的防治效果

任瓊麗

摘 ? 要 ? 煙草普通花葉病毒病在云南省玉溪煙區(qū)發(fā)生日趨嚴(yán)重，影響煙葉產(chǎn)量和品質(zhì)，威脅玉溪煙草生產(chǎn)，目前尚無一種較為理想的防治藥劑。試驗(yàn)測(cè)定了25種中草藥在普通煙品種K326上對(duì)煙草普通花葉病毒病的防治效果及對(duì)煙葉中丙二醛、類黃酮和總酚含量的影響。結(jié)果表明：煙株接種煙草普通花葉病毒24 h后，分別噴25種中草藥的粗提物200倍液，14 d后，煙葉中丙二醛的含量顯著低于清水對(duì)照，類黃酮和總酚的含量顯著高于對(duì)照;對(duì)煙草花葉病的防效較好的是射干、柴胡、五倍子和虎杖，防治效果分別為57.95%、53.33%、50.26%和48.72%。

關(guān)鍵詞 ? ?中草藥;煙草;普通花葉病毒;防治效果

中圖分類號(hào)：S435.72 ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A ? ?DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2020.1.006

煙草普通花葉病毒病是一種在世界各煙區(qū)廣泛分布、局部地區(qū)嚴(yán)重流行的煙草病害，在我國各產(chǎn)煙區(qū)普遍發(fā)生[1]。近年來，云南省玉溪煙區(qū)普通花葉病毒病發(fā)生日趨嚴(yán)重，且有不斷上升趨勢(shì)，嚴(yán)重影響了煙葉的產(chǎn)量和品質(zhì)，威脅玉溪煙草生產(chǎn)。前人對(duì)煙草花葉病毒病的防治做了一些研究，但由于病毒擴(kuò)散、傳播方式特殊，與寄主的寄生關(guān)系和復(fù)制（增殖）方式復(fù)雜及農(nóng)藥自身的特性等，迄今為止尚無一種較為理想的防治藥劑[2]。中草藥的應(yīng)用在我國有著古老的歷史，在人、畜病毒病的防治中發(fā)揮著重要作用[3]。從植物中篩選抗病毒物質(zhì)是開發(fā)植物抗病毒抑制劑的重要途徑之一[4]。本研究旨在篩選能有效防治煙草花葉病毒病的中草藥，為煙草花葉病毒病防治探索新的途徑[5]。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試中草藥：供試的25種中草藥（見表1），購自玉溪市一心堂藥店，廠家為云南鴻翔藥業(yè)。

供試作物：普通煙（Nicotiana tabacum L.），品種為K326（玉溪中煙種子有限公司生產(chǎn)）。漂浮育苗，于6～7葉時(shí)進(jìn)行盆栽。

供試毒源：供試毒源Tobacco mosaic virus（TMV）保存在普通煙上。采用常規(guī)汁液摩擦法接種。病毒接種液由病葉和PBS緩沖液按1∶20（w/v）的比例加少量金剛砂研磨后，用4層紗布過濾所得[6-7]。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 中草藥粗提物的制備

用中藥粉碎機(jī)將中草藥粉碎成粉末，在室溫下加入樣品量6倍的分析甲醇（V/M），浸泡72 h，期間不斷攪拌，使其充分溶解，用漏斗過濾后，蒸發(fā)濃縮獲得膏狀提取物，置于4 ℃冰箱保存[8]。

1.2.2 接種

煙株盆栽10 d后接種病毒，采用常規(guī)汁液摩擦法接種。接種后用清水沖洗，24 h后噴中草藥粗提物200倍液，對(duì)照噴清水。試驗(yàn)設(shè)26個(gè)處理，每種藥劑為1個(gè)處理，以清水為對(duì)照，每處理重復(fù)3次，每次重復(fù)20株。

1.2.3 病情調(diào)查

接種14 d后調(diào)查各處理煙株的發(fā)病率和病情指數(shù)，計(jì)算防治效果。病害分級(jí)與調(diào)查方法按照國標(biāo)GB/T 23222-2008《煙草病蟲害分級(jí)及調(diào)查方法》進(jìn)行，以株為單位，分為：0級(jí)，全株無病;1級(jí)，心葉脈明或輕微花葉，病株無明顯矮化;3級(jí)，1/3葉片花葉但不變形，或病株矮化為正常株高的3/4以上;5級(jí)，1/3至1/2葉片花葉，或少數(shù)葉片變形，或主脈變黑，或病株矮化為正常株高的2/3至3/4;7級(jí)，1/2至2/3葉片花葉，或變形或主側(cè)脈壞死，或病株矮化為正常株高的1/2至2/3;9級(jí)，全株葉片花葉，嚴(yán)重變形或壞死，或病株矮化為正常株高的1/2以上[9]。發(fā)病率、病情指數(shù)、防治效果計(jì)算公式如下：

發(fā)病率=（發(fā)病株數(shù)/調(diào)查總株數(shù)）×100%

病情指數(shù)=[∑（各級(jí)病株×該病級(jí)值）/（調(diào)查總病株×最高級(jí)值）]×100

防治效果=[（對(duì)照病情指數(shù)-處理病情指數(shù)）/對(duì)照病情指數(shù)]×100%

1.2.4 煙株生理指標(biāo)的測(cè)定

病情調(diào)查后，取樣測(cè)定煙葉的丙二醛、類黃酮和總酚含量。

1.2.4.1丙二醛（MAD）測(cè)定

丙二醛（MAD）含量的測(cè)定采用硫代巴比妥酸法[10-11]，具體過程為：稱取各處理新鮮葉片0.5 g，加入5%三氯乙酸（TCA）5 mL，研磨后所得勻漿在3 000 r·min-1下離心10 min，取上清液2 mL，加入0.67%硫代巴比妥酸（TBA）2 mL，混合后在100 ℃水浴上煮沸30 min，冷卻后再離心一次，最后以0.67%硫代巴比妥酸（TBA）溶液為對(duì)照，分別測(cè)定上清液在450 nm、532 nm、600 nm處的吸光度值，并按公式算出MDA濃度，再算出單位鮮量組織中的MDA含量（nmol·g-1）。

C（μmol·L-1）=6.45（A532-A600）-0.56A450

1.2.4.2類黃酮、總酚含量測(cè)定

類黃酮、總酚含量的測(cè)定參照余清等[12-15]的方法進(jìn)行。具體過程為：用電子天平稱取0.500 g新鮮葉片，剪1～2 mm的小塊，加1%HCl的甲醇溶液5 mL提取24 h（4 ℃），取0.5 mL提取液用蒸餾水稀釋至25 mL，測(cè)定OD280和OD325，類黃酮含量以O(shè)D325/g鮮重表示，總酚含量以O(shè)D280/g鮮重表示。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2007進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，DPS7.0分析軟件進(jìn)行顯著性測(cè)驗(yàn)，Duncans新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 25種中草藥對(duì)煙草普通花葉病的防治效果

噴藥14 d后調(diào)查各處理煙株的發(fā)病情況，計(jì)算病情指數(shù)和防治效果，結(jié)果見表2。由表2可見，防治效果最好的是射干，防效達(dá)57.95%;其次是柴胡、五倍子和虎杖，防效分別為53.33%、50.26%和48.72%;再次是連翹、貝母、玄參、夏枯草，防效分別為44.61%、43.59%、41.54%、41.54%;甘草、黃連、佩蘭、苦杏仁、桔梗、槐花、板蘭根和地榆的防效在30.26%～39.49%;其余處理的防效都低于30%。

2.2 25種中草藥對(duì)煙葉丙二醛含量的影響

測(cè)定各處理煙葉的丙二醛含量，結(jié)果表明（見表3），對(duì)照煙葉的丙二醛含量最高，達(dá)13.83 nmol·g-1;最低的是射干，煙葉丙二醛含量為7.58 nmol·g-1;枙子、黃花、黃岑、知母、牡丹皮、地黃、魚腥草、薄荷、板蘭根、地榆、淡竹葉、槐花、桔梗處理的煙葉丙二醛含量高于10 nmol·g-1;其余處理的煙葉丙二醛含量都低于10 nmol·g-1。

2.3 25種中草藥對(duì)煙葉類黃酮含量的影響

測(cè)定各處理煙株煙葉內(nèi)類黃酮的含量，結(jié)果表明（見表3），對(duì)照處理的煙株中類黃酮含量最低，為0.501 OD325/g;枙子、黃花、黃岑、知母處理的煙株類黃酮含量低于1.000 OD325/g;其余處理的煙株煙葉類黃酮含量均高于1.000 OD325/g，其中射干處理的煙株煙葉類黃酮含量最高，達(dá)1.553 OD325/g。

2.4 25種中草藥對(duì)煙葉總酚含量的影響

測(cè)定各處理煙葉的總酚含量，結(jié)果表明（見表3），射干處理的煙葉總酚含量最高，達(dá)1.779 OD280/g;對(duì)照處理的煙葉總酚含量最低，為0.567 OD280/g;射干、五倍子、虎杖、連翹、貝母、夏枯草、黃連、苦杏仁、佩蘭、柴胡、玄參、桔梗、淡竹葉、地榆、槐花和板蘭根處理的煙葉總酚含量高于1.000 OD280/g。

3 結(jié)論與討論

試驗(yàn)結(jié)果表明，煙株接種普通花葉病毒24 h后，分別噴25種中草藥的粗提物200倍液，7 d后，25種中草藥處理的煙葉中丙二醛含量顯著低于清水對(duì)照，類黃酮和總酚含量顯著高于對(duì)照;其中對(duì)煙草花葉病的防效較好的是射干（防效達(dá)57.95%）、柴胡（防效達(dá)53.33%）、五倍子（防效達(dá)50.26%）、虎杖（防效達(dá)48.72%）。

MDA含量作為細(xì)胞膜損傷程度的生理指標(biāo)和膜質(zhì)過氧化指標(biāo)，反映了細(xì)胞質(zhì)過氧化程度和植物對(duì)逆境條件的反應(yīng)強(qiáng)弱[15-16]，總酚和類黃酮含量與植物抗病性關(guān)系密切[17-21]。本研究中射干、柴胡、五倍子、虎杖等中草藥能降低煙葉中丙二醛含量，提高煙葉類黃酮、總酚含量，從而增強(qiáng)煙草的抗病性，但其對(duì)煙草的抗病活性物質(zhì)和抗病機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。

植物病毒病有“植物癌癥”之稱，目前還沒有一種植物病毒病的理想防治藥劑[22]。中草藥中普遍存在生物堿類、苷類、有機(jī)酸、黃酮類、氨基酸、揮發(fā)油、酚、醛、鞣質(zhì)、多糖和單糖等抗病毒物質(zhì)[23]，這些物質(zhì)易在植物體內(nèi)運(yùn)輸，在環(huán)境中易被降解，不易造成環(huán)境污染和殘留問題。劉學(xué)端等[24]利用商陸、甘草、連翹等幾種中草藥復(fù)配成MH11-4可濕性粉劑能明顯抑制植物體內(nèi)TMV的增殖。劉華山等[25]研究3種中草藥對(duì)煙草普通花葉病有一定的防效。本試驗(yàn)結(jié)果表明，射干、柴胡、五倍子對(duì)普通煙K326煙草花葉病的防效高于50%。我國中草藥資源豐富，在進(jìn)行抗病毒活性中草藥的篩選時(shí)，要充分?jǐn)U大篩選范圍，有利于從中發(fā)現(xiàn)高活性中草藥，由此開發(fā)出高效植物抗病毒抑制劑。

參考文獻(xiàn)：

[1] 佟愛仔，趙興能，孔寶華，等. 2011年云南煙草病毒病發(fā)生動(dòng)態(tài)及復(fù)合侵染分析[J].植物病理學(xué)報(bào)，2013，43（1）：100-103.

[2] 楊德廉，王鳳龍，錢玉梅，等.我國煙草病毒病的防治研究策略[J].中國煙草科學(xué)，2001（1）：46-48.

[3] 褚秀玲，蘇建青，韋旭斌.中草藥抗病毒的研究動(dòng)態(tài)及思路[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，48（5）：1253-1255.

[4] 劉國坤，謝聯(lián)輝，林奇英，等.15種植物的單寧提取物對(duì)煙草花葉病毒（TMV）的抑制作用[J].植物病理學(xué)報(bào)，2003，33（3）：279-283.

[5] 伍小良.抗煙草花葉病毒病的藥劑篩選及復(fù)配增效作用研究[D].重慶：西南大學(xué)，2007.

[6] 陳啟建，劉國坤，吳祖建，等.26種植物提取物抗煙草花葉病毒的活性[J].福建農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2004，33（3）：300-303.

[7] 陳雅寒，汝冰璐，翟穎妍，等.抑制煙草花葉病毒（TMV）植物提取物的篩選[J].植物保護(hù)學(xué)報(bào)，2018，45（3）：463-469.

[8] 徐曉慶，張秀麗，郭勃予，等.15種中草藥抗煙草花葉病毒活性的研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42（6）：1691-1693.

[9] GB/T2322-2008，煙草病蟲害分級(jí)及調(diào)查方法[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2008.

[10] 趙世杰，許長成，鄒琦，等.植物組織中丙二醛測(cè)定方法的改進(jìn)[J].植物生理學(xué)通訊，1994，30（3）：207-210.

[11] 朱振國，周廣苗，譚效磊，等.赤霉素對(duì)煙草幼苗生長發(fā)育及生理生化特性的影響[J].山東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2019，51（4）：139-143.

[12] 余清，劉勇，楊樹軍.幾種煙草抗病毒劑在田間藥效及對(duì)煙株抗病性的影響[J].云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2001，16（1）：9-12.

[13] 白海群，田澤華，楊明，等.幾種植物提取液對(duì)感染TMV煙草葉片核酸及類黃酮含量的影響[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38（34）：19438-19439.

[14] 李鑫，顧晶晶，趙秀香，等.銅元素誘導(dǎo)煙草抗馬鈴薯Y病毒脈壞死株系機(jī)理研究[J].病毒學(xué)報(bào)，2009，25（3）：226-230.

[15] 康華靖，劉鵬，徐根娣，等.大盤山自然保護(hù)區(qū)香果樹對(duì)不同海拔生境的生理生態(tài)響應(yīng)[J].植物生態(tài)學(xué)報(bào)，2008，32（4）：865-872.

[16] 耿艷秋，李大勇，吳瑩，等.低溫脅迫對(duì)玉米萌發(fā)出苗生理生化指標(biāo)的影響[J].東北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，41（6）：11-15.

[17] 范志金，劉秀峰，劉鳳麗，等.植物抗病激活劑誘導(dǎo)植物抗病性的研究進(jìn)展[J].植物保護(hù)學(xué)報(bào)，2005，32（1）：28-30.

[18] 唐永萍，石亞莉，賀軍花，等. 不同灰霉病抗性蘋果果實(shí)中酚類物質(zhì)代謝特征[J].西北植物學(xué)報(bào)，2017，37（3）：510-516.

[19] 李洪連，王守正.植物誘導(dǎo)抗病性的現(xiàn)狀與展望[J].河南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1994，28（3）：219-223.

[20] 徐翠蓮，楊楠，楊國玉，等.殼寡膦酸酯對(duì)煙草花葉病毒抗性及其機(jī)理的初步研究[J].中國煙草學(xué)報(bào)，2012，18（1）：58-63.

[21] 馬志卿，殷培軍，郭志波，等.植物源病毒抑制劑VFB誘導(dǎo)煙草抗煙草花葉病毒機(jī)理的初步研究[J].植物病理學(xué)報(bào)，2007，37（3）：296-300.

[22] 易克，彭冠云，周清明.抗植物病毒天然產(chǎn)物開發(fā)利用的研究進(jìn)展[J].湖南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009（2）：42-45.

[23] 鄭敏，陳鴻珊.中草藥及其有效成分抗病毒研究進(jìn)展[J].中草藥，1998，29（9）：633-635.

[24] 劉學(xué)端，肖啟明.植物源農(nóng)藥防治煙草花葉病機(jī)理初探[J].中國生物防治，1997，13（3）：128-131.

[25] 劉華山，楊素勤，韓錦峰，等.中草藥劑對(duì)煙草普通花葉病毒病的防治效果[J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2002（12）：21-24.

（責(zé)任編輯：易 ?婧）