過氧化物酶體增殖物激活受體（PPAR）色譜模型的構(gòu)建及在小分子肽篩選中的應(yīng)用*

（西安培華學院，陜西 西安 710125）

過氧化物酶體增殖物激活受體（PPAR）最早是由英國科學家在1990年發(fā)現(xiàn)的[1]。PPAR作為核受體的其中一種，主要分為PPARγ1和PPARγ2兩種類型。有研究發(fā)現(xiàn)其在肝臟中大量存在，在一定程度上可以起到保護肝臟的作用[2-3]。PPARγ2在分子表達式中相對于PPARγ1多一部分的氨基酸。一般情況下，PPAR主要由6個主區(qū)域和4個功能區(qū)域組成[4-6]。其中6個主區(qū)域主要有A-F區(qū)域組成。PPARγ受體中間區(qū)域是其DNA的分子結(jié)合區(qū)（C區(qū)）。E/F區(qū)是PPARγ受體的配體結(jié)合區(qū)域；而氨基酸部分是其主要的調(diào)節(jié)區(qū)域；D區(qū)域在其受體中主要起到連接的作用，它能夠與其他的因子結(jié)合從而改變PPARγ受體的性能[7-8]。

PPAR是核受體中的主要一部分，其生物學特性相當復雜。目前針對PPARγ受體的研究主要集中在各種疾?。禾悄虿?、腫瘤等的治療效果[9-11]。本文主要分析PPAR受體色譜模型的構(gòu)建，同時結(jié)合小分子肽的特性，研究PPAR受體色譜模型在小分子肽篩選中的應(yīng)用。

1 過氧化物酶增殖物激活受體

1.1 PPAR的結(jié)構(gòu)及配體

PPARγ受體的配體有兩類：天然和合成的配體[12]。詳細劃分可以將天然配體分為：必要的脂肪酸、oxLDL及其氧化物等。而合成配體可以分為：糖尿病的靶向藥物部分的非甾性抗炎藥，如平常使用最廣泛的布洛芬。

1.2 PPAR的功能

PPARγ針對人體的脂肪組織有著相應(yīng)的特異性能，脂肪組織在分化時其能夠起到一定的作用。有學者就針對PPARγ在人體脂肪細胞中的具體作用進行過相關(guān)的研究[13]。研究結(jié)果表明，PPARγ在脂肪代謝過程中參與了重要的反應(yīng)，其對脂肪組織的轉(zhuǎn)化和合成有著一定的輔助作用。研究還發(fā)現(xiàn)，PPARγ針對人體肝臟內(nèi)的脂肪合成和脂肪的積累都起到重要的作用。

同時，PPARγ在現(xiàn)代糖尿病的靶向治療中也能起到一定的效果。通過特定手段合成的PPARγ激動劑能夠降低人體的血脂和血糖的含量，在一定程度上提高胰島素的敏感性。PPARγ主要的作用機制表現(xiàn)在：（1）針對脂肪組織的分泌狀況進行適時的調(diào)節(jié)；（2）在一定程度上增強胰島素的傳遞功能。

2 PPAR生物色譜法

PPAR生物色譜法的原理是將PPARγ受體通過特定的方式固定在載體上，選用色譜分析技術(shù)針對PPARγ受體進行篩選[14]。通過篩選的載體的特性來判斷PPARγ受體的結(jié)合能力。此方法相較于傳統(tǒng)的方法主要優(yōu)點表現(xiàn)在其篩選速度快、方便。

PPAR生物色譜法中常常需要用到一定的受體。硅膠由于其表面積大、機械強度高成為了生物色譜法中的主要受體。但同時，由于硅膠表面的基團性質(zhì)不穩(wěn)定，會對生物色譜篩選的結(jié)果產(chǎn)生一定的誤差和影響。針對此問題，有學者對其進行了研究，研究發(fā)現(xiàn)：改良的細胞膜色譜法能夠具有一定的生物親和性，針對PPAR受體色譜的問題可以將細胞膜和其表面的硅膠進行融合制成特定的色譜柱。

3 PPAR受體色譜模型的構(gòu)建

在本文實驗中，首先挑選合適的單菌落置于對應(yīng)的液體培養(yǎng)基中，控制溫度為38℃，對上述液體培養(yǎng)液進行振蕩。靜置后取上述的培養(yǎng)液1mL放置于無菌的試管中。將實驗設(shè)備的轉(zhuǎn)數(shù)設(shè)置為6000r/mp，離心操作6min，最后在無菌的試管中加入150μL的CaCl2溶液。

3.1 實驗

在上述靜置的液體中吸取2μL的溶液。在轉(zhuǎn)移的過程中保證液體能吸入到試管中，實驗才能順利完成。其后，將上述靜置的液體放置于冰中6min，加入預先準備好的培養(yǎng)基（LB）。觀察單菌落的成長狀況。

將菌體置于Ni-Native-0的溶液中，通過超聲的作用制得上清液，離心操作收集上清，然后將其保存在-20℃的環(huán)境中。將上述溶液中的乙醇液體倒出，并在其中加入10mL的Ni-Native-0液體以達到平衡的作用。最終制得的分離膠和濃縮膠的配置情況見下表1。

表1 分離膠和濃縮膠的配制方案Table 1 Formulation of separation gel and concentrated gel

將上述配置完成的液體樣本進行混合，然后將其放入事先準備好的熱水中加熱，最后取上部的清澈樣本。按照表1所示的方案制取25mL的分離膠，將分離膠注入到上述清澈樣本中。靜置，待分離膠凝固后，除去上部的液體，并注入上述制得的15mL濃縮膠。直至得到的色帶清晰可見為止。

3.2 實驗結(jié)果

通過上述的實驗操作可以發(fā)現(xiàn)，具體的hPPARγ-LBD重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化情況如圖1所示。通過圖1可以發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)液中出現(xiàn)了單一的菌落，同時菌落的生長狀況良好。此現(xiàn)象也反應(yīng)了PPAR色譜模型的成功構(gòu)建。

圖1 hPPARγ-LBD重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化Fig.1 Transformation of hPPARγ-LBD recombinant plasmid

上述實驗制得的蛋白通過特定的Ni柱后，通過特定條件下的洗脫可以制得相應(yīng)的如圖2所示的SDS-PAGE分析提取純化的hPPARγ-LBD。從圖2中可以看出,最終得到的溶液分層明晰。通過相應(yīng)的色譜分析可知,此溶液最終形成的蛋白含量最高，幾乎沒有其他蛋白的摻雜。本實驗中選取了菌落的特征作為相應(yīng)的色譜構(gòu)建的表達形式。其主要目標是能夠通過蛋白的分析得到PPAR色譜模型。

4 PPAR受體色譜模型在小分子肽篩 選中的應(yīng)用

小分子肽在篩選的過程中主要以下幾種方法：噬菌體展示肽、降解蛋白質(zhì)法、多肽結(jié)構(gòu)法等[15]。上述小分子肽篩選技術(shù)中，我們平常使用最多的是噬菌體展示肽技術(shù)和組合肽技術(shù)。組合肽技術(shù)是1991年首次提出，其主要的作用機理是將天然、非天然的氨基酸成分進行合成。然后根據(jù)具體的要求進行合成，具體的可以合成氨基酸不等的肽鏈。此方法的優(yōu)點是篩選速度快，能夠在短時間內(nèi)對數(shù)以萬種的肽鍵進行一一對應(yīng)的篩選。除此之外噬菌體展示肽也是目前市面上小分子肽篩選中比較普遍的方法。其主要的缺點在于通過噬菌體展示肽篩選得到的肽鏈性能不穩(wěn)定，不能得到理想的肽鏈。

針對PPAR受體色譜模型在小分子肽篩選中的應(yīng)用,國內(nèi)外有過相應(yīng)的研究。其主要集中在通過化學肽技術(shù)與受體色譜融合技術(shù)篩選得到相應(yīng)的小分子肽。研究表明,小分子肽在現(xiàn)實生活中的腫瘤靶向治療領(lǐng)域內(nèi)有著一定的應(yīng)用前景。但目前還缺乏有力的證據(jù)能證明其能夠有效治療癌癥的成功案例。針對小分子肽篩選技術(shù)的研究還需要進一步的深入和發(fā)展。

5 結(jié)論

本文通過對PPAR的結(jié)構(gòu)及配體進行分析，了解了其主要的功能。同時結(jié)合生物色譜法分析了PPAR受體色譜的構(gòu)建過程。實驗結(jié)果表明,本文選擇的菌落特性能夠很好地識別PPARγ受體，并且能夠從特定的混合液體中篩選出PPARγ受體的成分。同時，該PPAR色譜模型能夠在小分子肽篩選中取得一定的研究進展，為接下來學者的研究提供相應(yīng)的參考價值。