微載體培養(yǎng)ST細(xì)胞制備豬細(xì)小病毒滅活苗及其免疫原性分析

豬細(xì)小病毒（PPV）可引起豬繁殖障礙性疾病，易引起木乃伊胎、流產(chǎn)、死胎、新生仔豬死亡等疾病。近年來(lái)，豬細(xì)小病毒病在歐美國(guó)家的發(fā)病率急劇增加，在我國(guó)，該病的發(fā)病率也出現(xiàn)上升趨勢(shì)，多地開(kāi)始流行該病，且發(fā)病范圍在不斷擴(kuò)大。同時(shí)豬細(xì)小病毒對(duì)環(huán)境抵抗力強(qiáng)，可存活數(shù)月之久，難以完全消除。該病目前尚無(wú)有效的治療方法，主要還是通過(guò)接種疫苗來(lái)預(yù)防該疾病的發(fā)生，目前國(guó)內(nèi)豬細(xì)小病毒疫苗以滅活苗為主。

本實(shí)驗(yàn)使用微載體培養(yǎng)ST細(xì)胞大規(guī)模制備豬細(xì)小病毒，進(jìn)一步制備滅活疫苗并檢測(cè)其免疫原性，為后期滅活疫苗的開(kāi)發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞及毒株ST細(xì)胞和豬細(xì)小病毒由哈藥疫苗有限公司研發(fā)中心提供。

1.2 主要試劑微載體Cytodex-1購(gòu)自美國(guó)GE公司；培養(yǎng)基MEM購(gòu)自美國(guó)Gibco公司 ；新生牛血清購(gòu)自美國(guó)Clark公司；二乙烯亞胺購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。

1.3 試驗(yàn)動(dòng)物2～4日乳鼠，體重350～400g，豚鼠購(gòu)自中醫(yī)藥大學(xué)。

1.4 微載體培養(yǎng)ST細(xì)胞規(guī)模化培養(yǎng)制備豬細(xì)小病毒在7L生物反應(yīng)器中加入3g/L微載體高壓滅菌后，按細(xì)胞接種密度2.0×105/mL接種ST細(xì)胞懸液至生物反應(yīng)器中。設(shè)置培養(yǎng)參數(shù)為pH7.2、溫度為37℃、溶氧50%，攪拌速度為90r/min。每隔24h無(wú)菌取樣觀察細(xì)胞，結(jié)晶紫對(duì)細(xì)胞進(jìn)行消化計(jì)數(shù)。待細(xì)胞爬球率為90%左右時(shí)排除培養(yǎng)液，清洗微載體細(xì)胞2次，按MOI為0.02接種豬細(xì)小病毒種毒同時(shí)將病毒維持液壓入反應(yīng)器中。每隔24h無(wú)菌取樣觀察細(xì)胞，結(jié)晶紫對(duì)細(xì)胞進(jìn)行消化計(jì)數(shù)。培養(yǎng)4d，當(dāng)80%以上的細(xì)胞病變后，凍融細(xì)胞2次，除去微載體。

1.5 病毒含量測(cè)定將病毒液用MEM細(xì)胞培養(yǎng)液作10倍系列稀釋，取10-5、10-6、10-7三個(gè)稀釋度，各加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每個(gè)稀釋度6孔，每孔100μL，同設(shè)6孔加100μL MEM作為無(wú)病毒空白對(duì)照。每孔加入100μL新消化的ST細(xì)胞懸液（4.0×105個(gè)/mL），置37℃含5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5d，每日觀察和記錄各孔中病毒感染情況，取最高細(xì)胞病變時(shí)間點(diǎn)，按Reed-Muench法，計(jì)算病毒的致半數(shù)細(xì)胞感染滴度（TCID50）。

1.6 病毒滅活將病毒液緩慢加入2%的二乙烯亞胺（BEI）溶液，充分混勻，使其最終濃度為0.02%。30℃滅活72h。將50%硫代硫酸鈉溶液加入滅活病毒液中，使其終濃度為2%，中止滅活。將滅活的病毒液接種ST細(xì)胞，觀察細(xì)胞病變情況。

1.7 病毒純化將病毒液用0.45μm的中空纖維柱去除細(xì)胞碎片，用100KD中空纖維柱對(duì)豬細(xì)小病毒做20倍濃縮，然后按不低于原液量1/2體積的PBS液重懸。

1.8 滅活疫苗制備取法國(guó)賽比克公司MontanideTMISA 206 VG佐劑為油相，將純化的病毒液作為水相，油相與水相體積比為1∶1，循環(huán)攪拌至油相與水相充分混合，乳化成雙相油乳劑。

1.8 滅活疫苗制備及免疫原性檢測(cè)

1.8.1 滅活疫苗制備取法國(guó)賽比克公司MontanideTMISA 206 VG佐劑為油相，將純化的病毒液作為水相，油相與水相體積比為1∶1，循環(huán)攪拌至油相與水相充分混合，乳化成雙相油乳劑。

1.8.2 免疫原性檢測(cè)體重350g～400g、豬細(xì)小病毒HI抗體陰性豚鼠10只，隨機(jī)分為2組，免疫組各肌肉注射豬細(xì)小病毒滅活疫苗0.5mL/只，免疫后28d后，連同條件相同的未免疫對(duì)照豚鼠5只采血，分離血清，采用0.5%豚鼠紅細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn)，確定血清中和抗體效價(jià)。

2 結(jié)果

2.1 微載體培養(yǎng)ST細(xì)胞規(guī)模化培養(yǎng)制備豬細(xì)小病毒將ST細(xì)胞接種至生物反應(yīng)器后，定時(shí)取樣觀察細(xì)胞貼壁以及其在微載體上的生長(zhǎng)情況，結(jié)果如圖1。ST細(xì)胞在微載體Cytodex-1表面生長(zhǎng)狀態(tài)良好，24h時(shí)取樣觀察到ST細(xì)胞均完成貼壁并呈長(zhǎng)梭形貼附在微載體上，開(kāi)始進(jìn)行細(xì)胞増殖生長(zhǎng)。細(xì)胞生長(zhǎng)72h時(shí)，細(xì)胞爬球率達(dá)到90%以上，細(xì)胞密度約為1.5×106cells/ml。細(xì)胞生長(zhǎng)72h時(shí)，接種豬細(xì)小病毒，接毒后48h可以看到細(xì)胞皺縮、變圓，先附著于微載體表面，后破碎脫落，在接毒后72h，絕大部分細(xì)胞破碎脫落，停止病毒培養(yǎng)，收獲病毒液。經(jīng)測(cè)定，收獲后病毒液病毒滴度為8.14logTCID50/mL。

圖1 微載體細(xì)胞生長(zhǎng)情況

2.2 病毒滅活滅活的病毒液接種ST細(xì)胞未發(fā)現(xiàn)細(xì)胞病變，表明豬細(xì)小病毒滅活完全。

2.3 滅活疫苗的免疫原性檢測(cè)結(jié)果顯示，滅活疫苗組5只豚鼠免疫后28天中和抗體效價(jià)在1∶128～512之間，抗體效價(jià)較高，而對(duì)照組抗體效價(jià)為1∶2～4都為陰性，見(jiàn)表1。

表1 豚鼠血清中和抗體效價(jià)

3 討論

我國(guó)疫苗市場(chǎng)發(fā)展迅速，疫苗生產(chǎn)技術(shù)也正經(jīng)歷著一場(chǎng)深刻的技術(shù)革新。由于微載體培養(yǎng)系統(tǒng)的成熟應(yīng)用，疫苗生產(chǎn)技術(shù)從滾瓶培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞向生物反應(yīng)器培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞轉(zhuǎn)變。這種疫苗工藝技術(shù)的轉(zhuǎn)變，符合世界生物制藥發(fā)展趨勢(shì)，也表明我國(guó)疫苗化產(chǎn)技術(shù)正逐步與世界生物制藥技術(shù)發(fā)展主流接軌。

本文利用微載體規(guī)模化培養(yǎng)ST細(xì)胞制備了豬細(xì)小病毒，并將其制備成滅活疫苗，免疫豚鼠后獲得了較高效價(jià)的中和抗體效價(jià)。上述試驗(yàn)結(jié)果為該疫苗的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)，疫苗對(duì)仔豬的保護(hù)尚待進(jìn)一步研究。