Cordyceps fumosorosea和Beauveria bassiana來源的堿性蛋白酶在畢赤酵母中的異源表達(dá)與性質(zhì)測定

任雅馨, 羅會(huì)穎, 姚斌 , 王國增, 涂濤*

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所, 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部飼料生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京 100081; 2.福州大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院, 福州 350116)

蛋白酶是特異水解蛋白質(zhì)中肽鍵的一類酶的總稱，其來源豐富，廣泛存在于動(dòng)物、植物及微生物中[1]。蛋白酶的結(jié)構(gòu)性質(zhì)多樣，種類繁多，有多種分類方式，根據(jù)其作用的不同pH范圍，可將其分為酸性蛋白酶、中性蛋白酶和堿性蛋白酶[2,3]。堿性蛋白酶主要在堿性環(huán)境中發(fā)揮酶活性，最適pH主要集中在9.0～11.0，最適作用溫度范圍較廣[2-3]。目前已發(fā)現(xiàn)的堿性蛋白酶主要為絲氨酸蛋白酶，催化三聯(lián)體中起核心作用的殘基為絲氨酸[4]。堿性蛋白酶的分子量大小主要分布在15～34 kD，少部分可達(dá)45甚至82 kD，也有分子量為8 kD的堿性蛋白酶[5-6]。其等電點(diǎn)一般較高，大多分布在pH 8.0～9.0[7]。盡管堿性蛋白酶的來源廣泛，但微生物來源的堿性蛋白酶以其周期短、成本低、限制因素少等優(yōu)點(diǎn)成為目前生產(chǎn)工藝最為成熟的一類堿性蛋白酶。目前，能產(chǎn)堿性蛋白酶的微生物有很多，大部分是芽孢桿菌，如枯草桿菌(Bacillussubtilis)、短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)、地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)等；有關(guān)真菌來源的堿性蛋白的報(bào)道也在逐年增多，以酵母和絲狀真菌為主，如棕曲霉(Aspergillusochraceus)、嗜熱圓酵母(Torulathermophila)等；部分放線菌也可以分泌堿性蛋白酶，如灰色鏈霉菌(Streptomycesgriseus)、費(fèi)氏鏈霉菌(Streptomycesfradiae)等[8]。

作為應(yīng)用最為廣泛的工業(yè)酶制劑之一，蛋白酶約占酶制劑總銷售量的60%，其中堿性蛋白酶的占比近40%[2-3]，發(fā)揮著巨大的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。洗滌劑中添加堿性蛋白酶能提高洗滌劑的清潔能力，加快對蛋白類污漬的分解，作為堿性蛋白酶最主要的應(yīng)用市場，洗滌劑等相關(guān)工業(yè)蛋白酶需求量洗滌劑等相關(guān)工業(yè)的堿性蛋白酶需求量約占其全球需求總量的2/3[2-3]。在食品行業(yè)中，堿性蛋白酶被應(yīng)用于大豆蛋白的水解，以產(chǎn)生高營養(yǎng)價(jià)值的水解產(chǎn)物[9]；此外，乳制品及肉制品加工也需要堿性蛋白酶的作用[10-11]。在飼料行業(yè)中，部分堿性蛋白酶具有水解角蛋白的能力，可以降解包括羽毛在內(nèi)的富含角蛋白卻難以降解的蛋白資源，應(yīng)用于飼料的生產(chǎn)中[12]。在制革過程中，可以利用堿性蛋白酶處理皮革原料，不僅可以有效的避免環(huán)境污染和安全問題，而且可以大大提高脫毛速度，增加皮革面積，保留皮革原本的顏色，達(dá)到更好的脫毛效果[13]。在醫(yī)藥領(lǐng)域，堿性蛋白酶也發(fā)揮著一定的作用，其被對于燒傷、傷口化膿、血栓溶解具有一定的療效[14-15]。此外，堿性蛋白酶在污水處理、廢棄銀回收、絲綢脫膠等方面也有所應(yīng)用。巨大的應(yīng)用前景使得針對堿性蛋白酶的研究十分必要。

直接利用野生菌株發(fā)酵生產(chǎn)堿性蛋白酶存在產(chǎn)酶水平低、性質(zhì)不穩(wěn)定、分離純化麻煩等缺點(diǎn)。隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，建立了許多優(yōu)質(zhì)的表達(dá)系統(tǒng)以實(shí)現(xiàn)目標(biāo)蛋白的高效表達(dá)。目前，已成功構(gòu)建的蛋白表達(dá)系統(tǒng)有大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)、酵母表達(dá)系統(tǒng)、枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)、昆蟲表達(dá)系統(tǒng)和哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)等。其中，畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)以其表達(dá)局限性小、產(chǎn)量高、可控性強(qiáng)、產(chǎn)品投入少、產(chǎn)物易分離及純化效果好等特點(diǎn)成為備受青睞的表達(dá)系統(tǒng)，尤其是對于真菌來源的目的蛋白，其具有完善的翻譯后修飾功能。目前，已有堿性蛋白酶實(shí)現(xiàn)了在畢赤酵母中的表達(dá)，如來源于Aspergillusoryzae的Alp[16]及來源于Aspergillussojae的AP[17]等。本研究對來源于真菌Cordycepsfumosorosea和Beauveriabassiana的堿性蛋白酶基因pa1及pa2成功實(shí)現(xiàn)了在畢赤酵母GS115中的高效表達(dá)，對重組蛋白的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了系統(tǒng)的研究，以期挖掘具有潛在工業(yè)應(yīng)用前景的優(yōu)質(zhì)堿性蛋白酶。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1菌株與質(zhì)粒 質(zhì)粒pEASY-T3和菌株EscherichiacoliTrans-T1購自北京全式金公司，分別用作克隆載體和宿主；質(zhì)粒pPIC9和畢赤酵母PichiapastorisGS115 為本實(shí)驗(yàn)室保存，分別用作表達(dá)載體和宿主。

1.1.2培養(yǎng)基 LB培養(yǎng)基：酵母浸提物5 g·L-1、胰蛋白胨10 g·L-1、NaCl 10 g·L-1，固體培養(yǎng)基添加15 g·L-1瓊脂粉。

MD固體培養(yǎng)基：葡萄糖20 g·L-1、瓊脂糖20 g·L-1、YNB 13.4 g·L-1、生物素0.004 g·L-1。

YPD培養(yǎng)基：葡萄糖20 g·L-1，蛋白胨20 g·L-1，酵母提取物10 g·L-1。

BMGY培養(yǎng)基：酵母提取物10 g·L-1、蛋白胨20 g·L-1、1%甘油(體積分?jǐn)?shù))、YNB 13.4 g·L-1、生物素0.004 g·L-1。

BMMY培養(yǎng)基：酵母提取物10 g·L-1、蛋白胨20 g·L-1、0.5%無水甲醇(體積分?jǐn)?shù))、YNB 13.4 g·L-1、生物素0.004 g·L-1。

牛奶雙層固體培養(yǎng)基：上層包含酵母提取物10 g·L-1、蛋白胨20 g·L-1、0.5%無水甲醇(體積分?jǐn)?shù))、YNB 13.4 g·L-1、生物素0.004 g·L-1、瓊脂粉20 g·L-1；下層包含脫脂奶粉80 g·L-1、瓊脂粉20 g·L-1。

1.1.3試劑 底物酪蛋白(casein sodium salt from bovine milk)購自Sigma公司；福林酚試劑購自上海荔達(dá)生物科技有限公司；質(zhì)粒小提中量試劑盒、蛋白分子量Marker(M221)購自天根生化科技有限公司；DNA純化試劑盒購自O(shè)MEGA公司；限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、NotⅠ、BglⅡ購自TaKaRa公司；Assembly Kit試劑盒2×FastPfuPCR SuperMix購自北京全式金公司；2×TaqPCR StarMix、核酸分子量Maker(MD113)購自GenStar康潤生物公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.4儀器 純水儀(美國Millipore)、立式高速冷凍離心機(jī)與臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(日本HIMAC)、移液器(德國Eppendorf)、凝膠成像系統(tǒng)，PCR儀與電轉(zhuǎn)儀(美國Bio-Rad)、膜包(德國Vivascience)、AKTA avant蛋白純化儀與陽離子交換柱HiTrap SP HP 5 mL(美國GE)、酶標(biāo)儀(美國Thermo)，其他均為國產(chǎn)儀器。

1.2 方法

1.2.1菌株產(chǎn)酶能力的鑒定 蛋白酶的酶活(U)定義為：標(biāo)準(zhǔn)條件下(pH 8.5，60 ℃，反應(yīng)20 min)，每分鐘釋放1 μg酪氨酸所需的酶量為一個(gè)酶活單位。

電擊轉(zhuǎn)化后獲得攜帶堿性蛋白酶基因的轉(zhuǎn)化子，轉(zhuǎn)接到牛奶雙層平板上，30 ℃條件下培養(yǎng)72 h，根據(jù)轉(zhuǎn)化子周圍是否出現(xiàn)牛奶水解圈及出圈大小，判斷轉(zhuǎn)化子是否表達(dá)蛋白酶活性，并衡量其活性高低。

1.2.2堿性蛋白酶的酶活測定 本文以福林酚法測定蛋白酶活性，以酪蛋白為底物：500 μL底物(1% ，質(zhì)量體積分?jǐn)?shù))和500 μL適當(dāng)稀釋倍數(shù)的酶液，在60 ℃反應(yīng)20 min后加入1 mL 0.4 mol·L-1三氯乙酸溶液終止反應(yīng)。將終止后的反應(yīng)體系12 000 r·min-1離心3 min后，取上清進(jìn)行顯色。顯色反應(yīng)體系：2.5 mL 0.4 mol·L-1碳酸鈉溶液，500 μL上清和 500 μL 福林酚試劑，40 ℃反應(yīng)20 min，待其冷卻至室溫后讀取其波長680 nm的吸光值，計(jì)算酶活力。所有反應(yīng)均設(shè)有三個(gè)平行和空白對照。

式中，ΔOD680=實(shí)驗(yàn)組OD680-空白對照OD680；N為配液的稀釋倍數(shù)。

1.2.3編碼堿性蛋白酶基因的獲取及其表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定 本研究中異源表達(dá)的兩條堿性蛋白酶基因分別來源于真菌Cordycepsfumosorosea和Beauveriabassiana，根據(jù)Genbank中公布的蛋白序列(ANV82734.1和AHA43398.1)，基于畢赤酵母的偏好性對其二者進(jìn)行密碼子優(yōu)化，并送至深圳華大基因有限公司進(jìn)行合成，分別命名為pa1和pa2。

合成獲得的基因通過同源重組的方法連接在pUC57載體上。首先，通過PCR方法借助特異性引物向目的基因中引入同源區(qū)段(pa1-F:GGCTGAAGCTTACGTAGAATTCGCTCCAGTTGTT-GAACCAGCTCCT,pa1-R:CTAAGGCGAATTAAT-TCGCGGCCGCTTAAGTAGCACCGTTAAAAGCCAA-GTAGTTGACA;pa2-F:GGCTGAAGCTTACGTA-GAATTCGCTCCAGTTGTTGAACCAGCTCCA,pa2-R:CTAAGGCGAATTAATTCGCGGCCGCTTAAGT-AGCACCGTTGAAAGCCAAGTAGTTAAC,下劃線標(biāo)注為與載體pPIC9同源區(qū)段)。PCR反應(yīng)體系：2×FastPfuPCR SuperMix 25 μL，pUC57-X1 μL，引物 各1 μL；ddH2O 22 μL(X表示基因編號)。PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。同時(shí)，利用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、NotⅠ對表達(dá)載體pPIC9進(jìn)行酶切，并回收PCR產(chǎn)物和酶切產(chǎn)物?；厥蘸蟮谋磉_(dá)載體pPIC9和攜帶同源區(qū)段的目的片段通過Assembly Kit試劑盒進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coliTrans-T1感受態(tài)，轉(zhuǎn)化菌液涂布于LB平板(含100 μg·mL-1氨芐青霉素)。 37 ℃培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)后，挑取轉(zhuǎn)化子進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證，反應(yīng)體系：2×TaqPCR StarMix 10 μL，引物各1 μL，ddH2O 8 μL，挑取轉(zhuǎn)化子加入上述反應(yīng)體系中。反應(yīng)條件同上。將陽性轉(zhuǎn)化子送華大基因測序，正確的重組質(zhì)粒命名為pPIC9-pa1、pPIC9-pa2。

1.2.4重組堿性蛋白酶表達(dá)載體在畢赤酵母中的表達(dá)及純化 通過質(zhì)粒小提中量試劑盒提取重組pPIC9-pa1、pPIC9-pa2質(zhì)粒，利用限制性內(nèi)切酶BglⅡ?qū)ζ溥M(jìn)行線性化處理，利用DNA純化試劑盒進(jìn)行純化。取20 μL純化后的線性化產(chǎn)物加入80 μL畢赤酵母感受態(tài)進(jìn)行電擊，設(shè)置Fungi檔位為PIC模式。電擊完畢后，立即加入200 μL預(yù)冷的1 mol·L-1山梨醇，懸浮菌液并轉(zhuǎn)移至滅菌的EP管中，30 ℃靜置復(fù)蘇30～60 min。將菌液涂布在MD平板上，30 ℃培養(yǎng)48 h。隨后將MD平板上生長的畢赤酵母單菌落轉(zhuǎn)接到牛奶雙層平板上，30 ℃培養(yǎng)72 h，若轉(zhuǎn)化子表達(dá)蛋白酶酶活，則可水解牛奶雙層平板中所含的牛奶，形成明顯的水解圈。通過水解圈出現(xiàn)與否及其大小判斷各陽性轉(zhuǎn)化子的酶活，挑選最早出圈且水解圈最大的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行搖瓶發(fā)酵。

將選中的重組酵母菌株接種到30 mL YPD液體培養(yǎng)基中，30 ℃、200 r·min-1活化培養(yǎng)48 h。隨后按1%的接種量將其轉(zhuǎn)接到300 mL的BMGY培養(yǎng)基中，30 ℃、200 r·min-1培養(yǎng)48 h，后將菌體轉(zhuǎn)移到200 mL的BMMY培養(yǎng)基中，30 ℃、200 r·min-1誘導(dǎo)培養(yǎng)48 h，期間每隔24 h補(bǔ)加0.5%甲醇。發(fā)酵過程結(jié)束后，將菌液12 000 r·min-1離心10 min，收集上清，即為粗酶液。用截留分子量5 kD的膜包對粗酶液進(jìn)行濃縮，并通過透析(截留分子量：3 kD)將粗酶液置換到pH 6.5的10 mmol·L-1磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液(buffer A)中實(shí)現(xiàn)脫鹽。脫鹽后的酶液通過陽離子交換柱(HiTrap SP HP 5 mL)進(jìn)行純化，利用buffer B (在buffer A基礎(chǔ)上添加1.0 mol·L-1NaCl，并調(diào)節(jié)為pH 6.5)進(jìn)行梯度(0～1.0 mol·L-1NaCl)洗脫，收集洗脫下來的具有酶活力的組份，利用SDS-PAGE驗(yàn)證其蛋白的純度及分子量大小，并送目的條帶至中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蜜蜂研究所進(jìn)行液相色譜-電噴霧離子化-質(zhì)譜聯(lián)用(liquid chromatography-electrospray ionization-tandem mass spectrometry，LC-ESI-MS)鑒定。蛋白濃度通過Easy Protein Quantitative Kit蛋白定量試劑盒進(jìn)行定量。

1.2.5堿性蛋白酶的酶學(xué)性質(zhì)研究 酶學(xué)性質(zhì)研究所用酶液均達(dá)到電泳純。緩沖體系：乳酸-乳酸鈉緩沖體系(50 mmol·L-1,pH 3.0～5.0)，磷酸鹽緩沖體系(200 mmol·L-1，pH5.0～8.0)，硼砂-氫氧化鈉緩沖體系(100 mmol·L-1，pH 8.0～12.0)。

①最適pH及pH穩(wěn)定性。利用pH 5.0～12.0的緩沖液將純化后的PA1、PA2酶液稀釋適當(dāng)倍數(shù)，在60 ℃下，與處于相應(yīng)pH的底物反應(yīng)20 min，測定其活性，以探究PA1、PA2的最適pH。

將純化后的PA1、PA2酶液在37 ℃、pH 3.0～12.0條件下預(yù)處理1 h后進(jìn)行適當(dāng)稀釋，在60 ℃、pH 8.5條件下測定剩余酶活，以探究PA1、PA2的pH穩(wěn)定性。

②最適溫度及熱穩(wěn)定性。將純化后的PA1、PA2酶液用100 mmol·L-1，pH 8.5的硼砂-氫氧化鈉緩沖體系稀釋適當(dāng)倍數(shù)，測定二者在不同溫度下(20～80 ℃)的酶活，以探究其最適溫度。

將純化后的PA1、PA2用100 mmol·L-1、pH 8.5的硼砂-氫氧化鈉緩沖體系稀釋到50 μg·mL-1，分別在50、55、60和65 ℃下進(jìn)行熱處理，處理時(shí)間分別為2、5、10、20、30和60 min，處理后的樣品置于冰上以終止酶的熱損失，冷卻后稀釋適當(dāng)倍數(shù)，在60 ℃，pH 8.5條件下測定剩余酶活，以探究其熱穩(wěn)定性，以未處理酶液所測的活性為100%。

③對不同金屬離子及化學(xué)試劑的反應(yīng)。在酶促反應(yīng)體系中加入不同金屬離子及化學(xué)試劑(Na+、K+、Cu2+、Ca2+、Mg2+、Zn2+、Mn2+、Co2+、Ni2+、Fe3+、Pb2+、Cr3+、EDTA、β-巰基乙醇、SDS)，終濃度為5 mmol·L-1，60 ℃、pH 8.5(100 mmol·L-1硼砂-氫氧化鈉緩沖體系)條件下反應(yīng)20 min，以探究不同金屬離子及化學(xué)試劑對酶活性的影響。以未添加金屬離子或化學(xué)試劑的反應(yīng)體系所測酶活為100%。

④對不同蛋白酶抑制劑的反應(yīng)。在酶促反應(yīng)體系中分別加入蛋白酶抑制劑E-64(半胱氨酸蛋白酶抑制劑)、phenylmethylsulfonyl fluoride(PMSF，絲氨酸蛋白酶抑制劑)、ethylenediaminetetraacetic acid(EDTA, 金屬蛋白酶抑制劑)及pepstatin A(天冬氨酸蛋白酶抑制劑)，終濃度為1 mmol·L-1，60 ℃、pH 8.5(100 mmol·L-1硼砂-氫氧化鈉緩沖體系)條件下反應(yīng)20 min，以探究不同蛋白酶抑制劑對酶活性的影響。以未添加抑制劑的反應(yīng)體系所測酶活為100%。

⑤動(dòng)力學(xué)參數(shù)。分別配制濃度為0.5、0.8、1.0、1.3、1.5、2.0、2.5、5.0、8.0、10.0 mg·mL-1的酪蛋白為底物，對純化后的PA1、PA2酶液適當(dāng)稀釋與不同濃度的底物在60 ℃、pH 8.5條件下反應(yīng)10 min，測定酶活力。利用GraphPad Prism version 5.01 (La Jolla, CA)軟件計(jì)算Km及Vmax，再根據(jù)酶的理論分子量計(jì)算kcat值。

1.2.6序列分析及結(jié)構(gòu)建模 利用在線軟件Signal P 4.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)預(yù)測其信號肽，Motif Scan(https://myhits.isb-sib.ch/cgi-bin/motif_scan/)預(yù)測其N端前肽；利用NetNGlyc 1.0 Server預(yù)測N糖基化位點(diǎn)；利用Vector NTI Advance 10.0 software分析PA1、PA2的蛋白理論分子量、等電點(diǎn)；SWISS-MODEL (https://www.swissmodel.expasy.org/)進(jìn)行三級結(jié)構(gòu)的建模及其活性位點(diǎn)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 堿性蛋白酶PA1及PA2序列分析

來源于真菌Cordycepsfumosorosea的堿性蛋白酶PA1全長380個(gè)氨基酸，預(yù)測其N端1～15個(gè)氨基酸為信號肽。根據(jù)畢赤酵母偏好性對去除信號肽外的365個(gè)氨基酸進(jìn)行密碼子優(yōu)化，獲得全長為1 098 bp的基因序列(包括終止密碼子)，提交至NCBI數(shù)據(jù)庫，序列號為MK622909。胞外蛋白酶通常由三部分組成，信號肽、N端前肽及催化功能區(qū)，少部分蛋白酶前體還具有C端前肽或C端延伸區(qū)。酶原表達(dá)至胞外后，需加工去除N端前肽(或C端前肽)才可成為有活性的成熟酶[18]，預(yù)測PA1的16～100位氨基酸構(gòu)成其N端前肽。N-糖基化預(yù)測結(jié)果顯示PA1含有1個(gè)潛在的N-糖基化修飾位點(diǎn)Asn270。PA1成熟蛋白理論蛋白分子量為28.6 kD，等電點(diǎn)為8.82。

來源于真菌Beauveriabassiana的堿性蛋白酶PA2全長為379個(gè)氨基酸，經(jīng)過序列分析，其與PA1的一致性為80.0%，前1～15位氨基酸為信號肽，對除去信號肽外的364個(gè)氨基酸進(jìn)行密碼子優(yōu)化，獲得全長為1 095 bp的基因序列(包括終止密碼子)，優(yōu)化后的序列提交至NCBI數(shù)據(jù)庫，序列號為MK622910。PA2蛋白的16～99位氨基酸構(gòu)成其N端前肽，加工去除N端前肽后的成熟蛋白的理論蛋白分子量大小為28.2 kD，等電點(diǎn)為9.10。不含潛在的N-糖基化修飾位點(diǎn)。

2.2 堿性蛋白酶PA1及PA2結(jié)構(gòu)分析

PA1與已有晶體結(jié)構(gòu)的Lecanicilliumpsalliotae來源的堿性蛋白酶Ver122(PDB登錄號：3F7M)一致性為82.44%。以3F7M為模板對PA1進(jìn)行同源建模(圖1)。這是一個(gè)典型的枯草桿菌類蛋白酶的結(jié)構(gòu)，由兩層α-螺旋結(jié)構(gòu)以及夾在中間的一層β-折疊結(jié)構(gòu)構(gòu)成。第五個(gè)β-折疊和第四個(gè)α-螺旋之間以及第六個(gè)β-折疊和第五個(gè)α-螺旋之間的兩段肽段形成底物結(jié)合區(qū)域，底物結(jié)合區(qū)域向內(nèi)存在三個(gè)催化位點(diǎn)，分為別Asp 141、His171和Ser326。PA1成熟蛋白中共有5個(gè)Cys，其中Cys136-Cys225和Cys280-Cys351分別形成兩對二硫鍵，Cys175并未形成。此外，在PA1成熟蛋白中還存在一個(gè)保守的Ca2+結(jié)合位點(diǎn)，殘基Pro277、Val279、Asp302與Ca2+形成穩(wěn)定的作用網(wǎng)絡(luò)。

與PA1一樣， PA2與已有晶體結(jié)構(gòu)的Lecanicilliumpsalliotae來源的堿性蛋白酶Ver122(PDB登錄號：3F7M)的一致性最高，為79.21%。以3F7M為模板對PA1進(jìn)行同源建模(圖1)。根據(jù)同源建模結(jié)果，PA2的蛋白結(jié)構(gòu)與PA1相似，都是典型的枯草桿菌類蛋白酶結(jié)構(gòu)，底物結(jié)合位置、催化三聯(lián)體、二硫鍵及鈣離子結(jié)合位點(diǎn)的分布均十分相似。

2.3 堿性蛋白酶PA1及PA2的表達(dá)與純化

重組表達(dá)載體pPIC9-pa1及pPIC9-pa2在畢赤酵母GS115中成功實(shí)現(xiàn)異源表達(dá)，根據(jù)牛奶水解圈的大小及出圈先后，從36個(gè)轉(zhuǎn)化子中篩選出酶活較高的一株進(jìn)行搖瓶發(fā)酵。搖瓶發(fā)酵獲得的粗酶液經(jīng)過截留分子量為5 kD膜包濃縮后，進(jìn)一步通過利用陽離子交換柱進(jìn)行純化，純化后的蛋白分子量大小及其純度通過SDS-PAGE電泳的驗(yàn)證(圖2)。在25～35 kD處分別有單一的蛋白條帶，這與PA1和PA2的理論分子量大小相符。在N糖基化預(yù)測時(shí)表明蛋白PA1僅存在一個(gè)潛在糖基化位點(diǎn)，PA2沒有潛在糖基化位點(diǎn)，說明該蛋白在酵母表達(dá)時(shí)的N糖基化程度低或者無N糖基化修飾。

圖2 PA1及PA2純化產(chǎn)物SDS-PAGEFig.2 SDS-PAGE analysis of purified PA1 and PA2

2.4 堿性蛋白酶PA1及PA2的酶活測定

對于挑選獲得的PA1及PA2轉(zhuǎn)化子進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，測定結(jié)果顯示，在60 ℃、pH 8.5條件下，PA1的粗酶液酶活為(218.4±2.7)U·mL-1，根據(jù)誘導(dǎo)時(shí)間，其平均生產(chǎn)力可以換算為4.55 U·mL-1·h-1。同樣條件下，PA2的粗酶液酶活為(246.5±3.5) U·mL-1，其平均生產(chǎn)力可以換算為5.14 U·mL-1·h-1。以酪蛋白為底物，純化后的PA1及PA2比活分別為(2 705.3±31.9)和(2 242±39.5)U·mg-1。

注：黃色標(biāo)注的氨基酸為催化三聯(lián)體；綠色球體為Ca2+；藍(lán)色球體為與Ca2+結(jié)合的氨基酸；紫色標(biāo)注部分為底物結(jié)合位置；紅色標(biāo)注部分為二硫鍵。Note: Yellow labeled amino acids are catalytic triads; green spheres are Ca2+ atom; blue spheres are the amino acids bound to Ca2+; purple surfaces are the substrate binding position; the sites marked in red are disulfide bonds.圖1 PA1及PA2三級結(jié)構(gòu)Fig.1 Putative modeled structure of PA1 and PA2

2.5 pH對堿性蛋白酶PA1及PA2的影響

純化后的PA1最適pH為8.5(圖3)，整體嗜堿，在pH 7～10之間酶活均保持在50%以上，其中pH 8.0～9.5條件下，更是保持在90%以上。當(dāng)pH上升至10.5后，酶活明顯降低，pH 12.0條件下，基本檢測不到蛋白酶活性。盡管屬于堿性蛋白酶，PA1在偏酸條件下仍能檢測到一定活性，pH 6.0時(shí)仍保持30%以上的活性。與PA1相同，純化后PA2的最適pH也為8.5(圖3)，整體嗜堿，但相較于PA1，PA2的整體作用范圍稍向酸偏移，在pH 10.0條件下，僅保持30%左右的酶活，較PA1低了30%左右，而在pH 6.0條件下，PA2保持40%以上的活性，較PA1高近10%。

PA1和PA2都具有良好的pH穩(wěn)定性(圖3)，在pH 4.0～11.0條件下處理1 h后，PA1仍能保持80%以上的剩余酶活，而PA2的剩余酶活可以保持85%以上，這充分說明PA1和PA2的pH穩(wěn)定性范圍十分寬泛。

圖3 PA1及PA2最適pH和pH穩(wěn)定性Fig.3 Optimum pH and pH stabilities of PA1 and PA2

2.6 溫度對堿性蛋白酶PA1及PA2的影響

PA1的最適溫度為60 ℃(圖4)，最適溫度以下，酶活性隨溫度變化趨勢較為平緩，反應(yīng)溫度在40 ℃時(shí)，仍保持40%以上的酶活。當(dāng)反應(yīng)溫度高于60 ℃后，酶活性隨溫度變化趨勢相對陡峭，盡管65 ℃條件下，仍能保持近50%的酶活，但當(dāng)溫度達(dá)到70 ℃時(shí)，僅保持10%左右的活性。與PA1相同，PA2的最適溫度也為60 ℃，酶活性隨溫度變化的整體趨勢與PA1相似。在目前已報(bào)道的真菌來源的堿性蛋白酶中， PA1及PA2屬于真菌來源的堿性蛋白酶中的高溫酶。

圖4 PA1及PA2最適溫度和熱穩(wěn)定性Fig.4 Optimum temperature and thermostability of PA1 and PA2

PA1的溫度穩(wěn)定性也較好(圖4)，在50 ℃條件下高度穩(wěn)定，處理1 h幾乎沒有酶活損失；55 ℃處理1 h，仍保持近80%的剩余酶活；在60 ℃的條件下處理10 min后還有70%左右的剩余酶活，30 min時(shí)就僅剩20%左右的酶活；當(dāng)處理溫度達(dá)到65 ℃時(shí)，酶活降低比較明顯，處理10 min后，幾乎檢測不到活性。PA2的溫度穩(wěn)定性也較好，在50 ℃條件處理1 h幾乎沒有酶活損失；與PA1相比，在相對低溫的條件下，PA2的穩(wěn)定性略低，55 ℃條件下處理1 h，PA2的剩余酶活比PA1低10%左右。但在相對高溫的條件下，PA2的穩(wěn)定性優(yōu)于PA1，PA2在65 ℃條件下處理10 min后，仍能檢測到13%左右的活性。

2.7 金屬離子和化學(xué)試劑對堿性蛋白酶PA1及PA2的影響

從表1可以看出，Ni2+和Mn2+對PA1及PA2有明顯的促進(jìn)作用，Zn2+、Co2+和Cu2+對PA1及PA2的抑制作用明顯，其中Cu2+的抑制效果最為嚴(yán)重，終濃度5 mmol·L-1Cu2+存在的情況下PA1和PA2幾乎損失90%左右的酶活。其他金屬離子對PA1及PA2活性也有程度不同的作用。EDTA對PA1及PA2的酶活影響幾乎沒有影響，在表面活性劑SDS存在的情況下，PA1及PA2的酶活性仍能保持60%，還原劑β-巰基乙醇存在時(shí)，PA1及PA2的酶活性仍能保持近90%，這二者作為常用的工業(yè)添加劑，PA1及PA2在其存在的情況下仍能保持不低的活性，這表明PA1及PA2具有一定的工業(yè)應(yīng)用潛力。

表1 金屬離子及化學(xué)試劑對PA1及PA2活力的影響Table 1 Effect of metal ions and chemical reagents on the activity of PA1 and PA2

2.8 不同蛋白酶抑制劑對堿性蛋白酶PA1及PA2的作用

如圖5所示，半胱氨酸蛋白酶抑制劑E-64、金屬蛋白酶抑制劑 EDTA及天冬氨酸蛋白酶抑制劑 Pepstatin A對PA1及PA2幾乎沒有抑制作用，而在絲氨酸蛋白酶抑制劑PMSF存在的情況下，PA1及PA2酶活性基本完全喪失，該結(jié)果進(jìn)一步證明PA1及PA2屬于絲氨酸蛋白酶。

圖5 蛋白酶抑制劑對PA1及PA2活力的影響Fig.5 Effect of protease inhibitors on the activity of PA1 and PA2

2.9 堿性蛋白酶PA1及PA2的動(dòng)力學(xué)常數(shù)

以酪蛋白為底物，在60 ℃、pH 8.5的條件下，測得堿性蛋白酶PA1的Km值為(3.46±0.23) mg·mL-1，Vmax值為(4 283.0±56.4) μmol·min-1·mg-1，進(jìn)一步計(jì)算得，其kcat值為2 027.8 s-1，催化效率kcat/Km為585.6 mL·s-1·mg-1。相同條件下測定PA2的Km值為(4.39±0.58) mg·mL-1，Vmax值為(4 596.0±68.9) μmol ·min-1·mg-1，進(jìn)一步計(jì)算得，其kcat值為2 150 s-1，催化效率kcat/Km為490.3 mL·s-1·mg-1。

3 討論

本文以Parengyodontiumalbum來源的優(yōu)質(zhì)堿性蛋白酶Proteinase K的蛋白序列出發(fā)，通過序列和進(jìn)化分析，獲得真菌Cordycepsfumosorosea和Beauveriabassiana來源的堿性蛋白酶基因pa1及pa2。其中pa1尚無功能驗(yàn)證相關(guān)報(bào)道，對于pa2，2014年，Borgi等[19]曾通過原酶純化手段獲得對其所表達(dá)蛋白，并確定為堿性蛋白酶，但尚未發(fā)現(xiàn)對其二者進(jìn)行異源表達(dá)及性質(zhì)研究的報(bào)道。目前，已報(bào)道的用于堿性蛋白酶異源表達(dá)的宿主菌有大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、畢赤酵母、解脂耶氏酵母，釀酒酵母及魯氏酵母。本文利用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)對pa1及pa2進(jìn)行異源表達(dá)，按照畢赤酵母偏好性進(jìn)行密碼子優(yōu)化，去除了其二者的天然信號肽，與pPIC9表達(dá)載體連接，采用載體上存在α-factor信號肽引導(dǎo)實(shí)現(xiàn)跨膜轉(zhuǎn)移。重組菌株P(guān).pastorisGS115 PA1及P.pastorisGS115 PA2在搖瓶發(fā)酵水平上，PA1平均生產(chǎn)力可以換算為4.55 U·mL-1·h-1,PA2平均生產(chǎn)力可以換算為5.14 U·mL-1·h-1。二者的表達(dá)水平比大多數(shù)報(bào)道的同類型重組菌株要高，如來源于Aspergillusoryzae的Alp在P.pastorisGS115中實(shí)現(xiàn)異源表達(dá)，平均生產(chǎn)力為0.4 U·mL-1·h-1[16]；來源于BacillusstearothermophilusFI的F1在P.pastorisGS115中實(shí)現(xiàn)異源表達(dá)，平均生產(chǎn)力為0.6 U·mL-1·h-1[20]；來源于BacilluscereusYSQ08的aprA在P.pastorisX33中實(shí)現(xiàn)異源表達(dá)[21]，平均生產(chǎn)力為1.7 U·mL-1·h-1。2018年，Ke等[17]實(shí)現(xiàn)了Aspergillussojae來源的堿性蛋白酶Ap在PichiapastorisKM71中的高效表達(dá)，72 h發(fā)酵后測得酶活為400.4 U·mL-1，平均生產(chǎn)力約為5.6 U·mL-1·h-1，相較于本文所報(bào)道的PA1及PA2略高，但分析誘導(dǎo)過程，其所添加的甲醇量為本實(shí)驗(yàn)的兩倍。因此，后續(xù)工作中可通過優(yōu)化P.pastorisGS115 PA1及P.pastorisGS115 PA2的發(fā)酵工藝參數(shù)，進(jìn)一步提高其表達(dá)水平。

真菌來源的堿性蛋白酶的最適溫度一般較低，多數(shù)處于35到50 ℃，如來源于Aspergillusfumigatus的TKU003的最適溫度為40 ℃[22]，來源于Aspergillusustus的NIOCC#20的最適溫度為45 ℃[23]。本研究中PA1及PA2的最適溫度均為60 ℃，與近年來報(bào)道的一些真菌來源的高溫堿性蛋白酶相一致，如來源于Streptomycesambofaciens.的DP2[24]和來源Engyodontiumalbum的堿性蛋白酶[25]，因此認(rèn)為PA1及PA2屬于高溫堿性蛋白酶。除最適溫度較高以外，PA1及PA2也具有較好的熱穩(wěn)定性，在50 ℃條件下處理1 h幾乎沒有酶活損失，60 ℃環(huán)境中，PA1及PA2處理30 min后仍具有一定活性。多數(shù)堿性蛋白酶的熱穩(wěn)定性較差，如來源于Aspergillusclavatus的堿性蛋白酶在50 ℃條件下處理18 min，剩余50%的活性[26]，來源于Beauveriabassiana的堿性蛋白酶在50 ℃條件下處理5 min，僅剩余40%左右的活性[27]。從結(jié)構(gòu)角度分析，PA1及PA2的蛋白結(jié)構(gòu)中還存在一個(gè)Ca2+結(jié)合位點(diǎn)，Ca2+對大多數(shù)堿性蛋白酶的熱穩(wěn)定性有增強(qiáng)作用[28-29]。

已報(bào)道的真菌來源的堿性蛋白酶最適pH從7.5到11均有分布，如來源于Beauveriabassiana的BBP的最適pH為7.5[30]，來源于Engyodontiumalbum的堿性蛋白酶最適pH為11.0[25]。PA1及PA2的最適pH為8.5，與早先報(bào)道的最適pH分布在8.0～9.5的真菌來源的堿性蛋白酶相一致，如Aspergillusparasiticus[31]、Aspergillusfumigatus[32]及Aspergillusclavatus[26]來源的堿性蛋白酶，符合堿性蛋白酶的pH活性范圍。此外，PA1及PA2還具有極好的pH穩(wěn)定性，大部分堿性蛋白酶在中性及堿性環(huán)境中穩(wěn)定，如來源于AspergillusclavatusES1的堿性蛋白酶蛋白酶在4 ℃下處理1 h，僅在pH 8.0～9.0的環(huán)境中保持穩(wěn)定，pH 6及pH 10環(huán)境中酶活損失50%左右[33]；來源于AspergillusnidulansHA-10的堿性蛋白酶在37 ℃條件下處理1 h，其活性穩(wěn)定范圍為pH 6.0～10.0，在pH 4環(huán)境中僅保持30%左右的活性[34]。目前，也有一些真菌來源的堿性蛋白酶在酸性環(huán)境中保持一定的穩(wěn)定性，如Fusariumsp. BLB來源的堿性蛋白酶在37 ℃ 1 h的處理?xiàng)l件下，在pH 3.0～9.0的環(huán)境中保持穩(wěn)定，盡管在酸性環(huán)境中具有良好的穩(wěn)定性，但其在堿性條件下的穩(wěn)定較差，pH 11.0的環(huán)境中酶活幾乎完全損失[35]。PA1及PA2在37 ℃ 1 h的處理?xiàng)l件下，在pH 4.0～11.0的環(huán)境中均保持80%以上的活性，呈現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性。

綜上所述，來源于真菌Cordycepsfumosorosea和Beauveriabassiana的堿性蛋白酶基因pa1和pa2與pPIC9表達(dá)載體連接，經(jīng)轉(zhuǎn)化后成功實(shí)現(xiàn)在畢赤酵母中的高效表達(dá)。對純化后的PA1及PA2的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行測定，確定其二者的最適pH均為8.5，最適溫度均為60 ℃，都具有良好的pH穩(wěn)定性和溫度穩(wěn)定性，對于表面活性劑和還原劑也具有一定的耐受性，表明二者具有一定的工業(yè)應(yīng)用潛力。在后續(xù)工作中，可對二者的應(yīng)用價(jià)值展開進(jìn)一步研究，如可將其應(yīng)用于加酶洗滌劑、羽毛降解、皮革制造、肉質(zhì)嫩化等領(lǐng)域，分析比較其各自在實(shí)際生產(chǎn)中的優(yōu)劣，更好地發(fā)揮其本身價(jià)值，豐富堿性蛋白酶資源，為工業(yè)生產(chǎn)提供更多選擇。