Trx1抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激參與運(yùn)動改善心梗后骨骼肌質(zhì)量減少

蔡夢昕，齊文溥，徐祖杰,2，田振軍

（1.陜西師范大學(xué) 體育學(xué)院運(yùn)動生物學(xué)研究所，陜西 西安 710119；2.清華大學(xué) 體育與健康科學(xué)研究中心，北京 100084）

骨骼肌是人體主要運(yùn)動器官，具有高度可塑性。多種生理病理刺激可引發(fā)骨骼肌萎縮，如肌肉廢用、失神經(jīng)支配、禁食、衰老和系統(tǒng)性疾?。ㄈ缧难芗膊?、癌癥）等（Curcio et al.，2020；Von Haehling et al.，2017）。臨床研究發(fā)現(xiàn)，部分心肌梗死（心梗，myocardial infarction，MI），特別是心力衰竭（心衰，heart failure，HF）患者伴隨骨骼肌質(zhì)量、代謝和功能改變，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量（Fülster et al.，2013；Suzuki et al.，2018；Vescovo et al.，2001）。骨骼肌萎縮被認(rèn)為是慢性心衰患者死亡的獨(dú)立預(yù)測因子（Anker et al.，1997；Von Haehling et al.，2010）。因此，研究心梗病理發(fā)展過程中出現(xiàn)骨骼肌質(zhì)量減少進(jìn)而誘導(dǎo)骨骼肌萎縮現(xiàn)象的發(fā)生機(jī)理及干預(yù)靶點具有重要意義。

研究表明，心衰后骨骼肌發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，活性氧（reactive oxygen species，ROS）和系統(tǒng)性炎癥水平升高，蛋白質(zhì)合成/降解比例失調(diào)，脂肪酸氧化降低，線粒體出現(xiàn)功能障礙（Gosker et al.，2000；Lavine et al.，2017；Martinez et al.，2015；Springer et al.，2017；Zizola et al.，2013）。ROS爆發(fā)可引發(fā)細(xì)胞Ca2+信號紊亂，蛋白質(zhì)折疊障礙，產(chǎn)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ERS）現(xiàn)象。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能紊亂導(dǎo)致未折疊或錯誤折疊蛋白聚積，激活未折疊蛋白效應(yīng)（unfolded protein response，UPR），并通過激活A(yù)TF6、IRE1-XBP1和PERK-eIF2-ATF4三條信號通路抑制蛋白質(zhì)合成，清除未折疊蛋白或促進(jìn)其折疊，發(fā)揮保護(hù)效應(yīng)。但持續(xù)過度的ERS可激活多條應(yīng)激反應(yīng)通路，通過上調(diào)ASK1和CHOP表達(dá)，活化JNK和Caspase-12（c-Casp-12）產(chǎn) 生 病 理 變 化（Ellgaard et al.，2003；Hetz，2012；Zhang，2010）。研究發(fā)現(xiàn)，多種骨骼肌疾病可誘導(dǎo)ERS發(fā)生（Zito，2019）。但心梗病理進(jìn)程中，骨骼肌是否產(chǎn)生ERS，目前鮮見文獻(xiàn)報道。

硫氧還蛋白1（thioredoxin，Trx1）是生物體內(nèi)清除細(xì)胞內(nèi)ROS、抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)的關(guān)鍵氧化還原調(diào)節(jié)蛋白（Hanschmann et al.，2013），主要通過與硫氧還蛋白互作蛋白（thioredoxin interacting protein，TXNIP）形成硫氧還蛋白酶體，在機(jī)體氧化還原狀態(tài)調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用（Lu et al.，2012）。ERS可誘導(dǎo)TXNIP表達(dá)，激活炎癥反應(yīng)通路（Lerner et al.，2012；Oslowski et al.，2012）。骨骼肌細(xì)胞可分泌 Trx1（Manabe et al.，2014），但 Trx1是否參與降低心梗后骨骼肌ROS水平，改善ERS及其誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡有待確證。

臨床研究表明，適宜的運(yùn)動鍛煉可有效改善心?；颊咝墓δ芎凸趋兰∥s（Lelyavina et al.，2019），已成為治療心衰、抵抗運(yùn)動耐受性降低和改善生活質(zhì)量的有效輔助療法（Negrao et al.，2008；Wisl?ff et al.，2007）。耐力運(yùn)動可激活正常生理狀態(tài)下骨骼肌ERS和UPR系統(tǒng)（Kim et al.，2011），但是否可通過抑制ERS改善心梗誘導(dǎo)的骨骼肌質(zhì)量減少，研究尚少。Trx1抑制ERS在有氧運(yùn)動改善心梗誘導(dǎo)骨骼肌質(zhì)量減少中是否發(fā)揮作用，目前鮮見文獻(xiàn)報道。本文聚焦于Trx1對ERS和細(xì)胞凋亡的影響，將為運(yùn)動改善心梗誘導(dǎo)的骨骼肌萎縮提供新機(jī)制，并為相關(guān)治療靶點篩選提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及模型制備

8周齡雄性C57B6L小鼠（SPF級），20～22 g，購于西安交通大學(xué)動物中心（動物使用許可證號為SCXK（陜）2017-003），飼養(yǎng)于陜西師范大學(xué)運(yùn)動生物學(xué)研究所動物房，每籠4～5只。動物自由攝食、飲水，室內(nèi)溫度23℃～25℃，濕度40%～60%。小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后進(jìn)入實驗。動物研究方案符合《實驗動物的護(hù)理和使用指南》規(guī)定。

適養(yǎng)結(jié)束后，結(jié)扎小鼠左冠狀動脈前降支（left anteri‐or descending coronary artery，LAD）制備心梗模型。小鼠固定于手術(shù)操作臺，采用異氟烷吸入式麻醉，除毛，暴露心前區(qū)皮膚，剪皮，選取第3肋和第4肋間隙為操作空間，將心臟于肋間隙處擠出，于左心耳和肺動脈圓錐交界下1～2 mm處進(jìn)針，結(jié)扎LAD，完成后將心臟歸位，排氣，合胸，縫皮。以心電圖和超聲心動圖結(jié)果判定結(jié)扎效果，選取變化一致的小鼠共16只，隨機(jī)分為心梗組（MI）和心梗運(yùn)動組（MI＋ aerobic exercise training，ME），每組 8只。另取8只為假手術(shù)組（Sham），只穿針不結(jié)扎，作為對照。

ME組小鼠于術(shù)后第8天進(jìn)行跑臺持續(xù)有氧運(yùn)動。訓(xùn)練使用8通道跑臺，可滿足同組小鼠同時運(yùn)動，減少組內(nèi)差異。運(yùn)動方案參照Qin等（2019）的心梗小鼠運(yùn)動模型和Schefer等（1996）的衰老小鼠運(yùn)動模型。第1周為適應(yīng)性訓(xùn)練：初始速度為6 m/min×10 min，每天遞增速度和時間，至12 m/min×60 min，共5天；第2～6周為正式訓(xùn)練：跑速為12 m/min，60 min/天，5天/周×6周。運(yùn)動過程中無動物死亡。

訓(xùn)練結(jié)束后次日，采用小動物多普勒超聲檢測儀檢測小鼠心功能變化。小鼠麻醉并仰臥位固定于手術(shù)臺上，脫毛凈胸，超聲探頭置于左前胸獲取M型超聲心動圖，監(jiān)測6個連續(xù)心動周期，測量并計算左心室收縮期末徑（left ventricular internal diameter at end systole，LVIDs）、左心室舒張期末徑（left ventricular internal diameter at end diastole，LVIDd）、左心室短軸縮短率（fractional shortening，F(xiàn)S）和射血分?jǐn)?shù)（ejection fraction，EF）。結(jié)果顯示，與 Sham 組（LVIDs：1.57±0.07，LVIDd：3.10±0.05，F(xiàn)S：49.39±1.11%，EF：83.14±0.75%）相比較，MI組 LVIDs（3.35±0.27，P＜0.01）與 LVIDd（4.26±0.24，P＜0.01）顯著升高，F(xiàn)S（22.96±2.15%，P＜0.01）與EF（49.35±3.90%，P＜0.01）顯著降低；與 MI組相比較，ME 組 LVIDs（2.58±0.12，P＜0.01）與 LVIDd顯 著 降 低（3.76±0.07，P＜0.05），F(xiàn)S（32.22±2.05%，P＜0.01）與EF（65.87±2.78%，P＜0.01）顯著升高。心功能結(jié)果證實所采用運(yùn)動方案安全有效。

1.2 骨骼肌樣本處理與組織學(xué)實驗

心功能檢測結(jié)束后，迅速分離小鼠脛骨前肌，去除兩側(cè)肌腱和結(jié)締組織，稱重，取每只小鼠左側(cè)脛骨前肌置于液氮中固定，進(jìn)行Western Blotting實驗。右側(cè)脛骨前肌切分，分別取同部位組織進(jìn)行生化檢測實驗，或置于預(yù)冷中性甲醛固定保存，進(jìn)行組織學(xué)實驗。甲醛固定肌組織48 h后，流水沖洗，常規(guī)石蠟包埋，5 μm連續(xù)切片。HE染色觀察組織結(jié)構(gòu)變化，每組樣本隨機(jī)選取20～30個視野，每個視野隨機(jī)選取30個肌細(xì)胞進(jìn)行橫截面積統(tǒng)計。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)與干預(yù)

C2C12小鼠成肌細(xì)胞購于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞資源中心。使用完全培養(yǎng)基（高糖DMEM，10%胎牛血清和1%青-鏈霉素雙抗）常規(guī)培養(yǎng)C2C12細(xì)胞（37℃，5% CO2恒溫培養(yǎng)），每24 h更換培養(yǎng)液。待細(xì)胞密度至80%時，進(jìn)行干預(yù)實驗。

細(xì)胞分別進(jìn)行H2O2（400 μM，4 h，37℃，5% CO2）、TXN（30 ng/ul，24 h，37 ℃，5% CO2）和 Trx1抑制劑 PX-12（10 μM，24 h，37 ℃，5% CO2）干預(yù)。之后收集細(xì)胞，提取蛋白，用于Western Blotting檢測。細(xì)胞爬片，進(jìn)行TUNEL染色。

1.4 活性氧和抗氧化能力檢測

脛骨前肌組織進(jìn)行OCT包埋，制備10 μm冰凍切片，DHE染色檢測肌組織ROS水平。檢測方法嚴(yán)格按照試劑說明書執(zhí)行。切片滴加清洗工作液，室溫孵育5 min，移除后孵育DHE熒光探針染色工作液，37℃避光30 min，PBS洗5 min×3，甘油封片，熒光顯微鏡下觀察并拍照。

抗氧化試劑盒檢測肌組織SOD活性和MDA水平。取50 mg肌組織樣品，勻漿，2 500 rpm離心10 min，取上清。使用BCA試劑盒測量蛋白濃度。總SOD活性和MDA水平檢測步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.5 Western Blotting實驗

提取脛骨前肌組織和細(xì)胞總蛋白，具體步驟如下：肌組織50 mg，加入預(yù)冷RIPA裂解液500 ul，電動勻漿機(jī)勻漿，靜置10 min后，12 000 rpm低溫離心15 min，取上清；6孔板培養(yǎng)細(xì)胞，干預(yù)結(jié)束后，吸去培養(yǎng)液，加入預(yù)冷RI‐PA裂解液200 ul，細(xì)胞刮刀刮取貼壁細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至EP管中，超聲細(xì)胞破碎儀破碎細(xì)胞后靜置10 min，12 000 rpm低溫離心15 min，取上清。BCA法檢測肌組織和細(xì)胞總蛋白含量；根據(jù)檢測蛋白分子量大小配制10%～12%SDS聚丙烯酰胺凝膠，垂直電泳分離蛋白；濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素（nitrocellulose blotting membranes，NC）膜；3%牛血清白蛋白（bovine serum albumin,BSA）室溫封閉60 min；孵育一抗（3%BSA或5%脫脂奶粉稀釋）：MuRF1、MAFbx、Trx1、TXNIP、ASK1、p-IRE1α、IRE1α、p-PERK、PERK、ATF6、ATF4、Bcl-2、Bax（1∶1 000 稀釋）、CHOP、Casp-12和 JNK（1∶2 000稀釋）、GRP78（1∶4 000稀釋），4℃過夜；次日復(fù)溫后Tris緩沖液（tris buffered saline＋Tween 20，TBST）洗膜，5 min×3；孵育辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase,HRP）標(biāo)記二抗，室溫1 h；TBST洗膜后，ECL檢測信號強(qiáng)度。GAPDH作為內(nèi)部參照。

1.6 TUNEL染色

TUNEL染色檢測小鼠骨骼肌細(xì)胞和C2C12細(xì)胞凋亡情況，操作步驟嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。切片脫蠟置水，Proteinase K工作液處理組織30 min，37℃；磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline,PBS）洗 2次；標(biāo)本上滴加50 μl TUNEL 反應(yīng)混合液（50 μl TdT＋450 μl熒光素標(biāo)記的dUTP液，陰性對照僅加50 μl熒光素標(biāo)記的dUTP液），37℃避光反應(yīng)1 h；PBS洗3次；甘油封片，熒光顯微鏡下觀察并拍照。每個樣本取3張切片，每張切片隨機(jī)選取20個視野進(jìn)行檢測并拍攝。

C2C12細(xì)胞爬片后，甲醛固定30 min，PBS清洗5 min×3；Triton 孵育5 min，PBS洗5 min×3；孵育TUNEL工作液，37℃避光反應(yīng)1 h；PBS清洗后甘油封片，熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.7 數(shù)據(jù)處理與分析

光學(xué)顯微鏡拍攝圖像，經(jīng)Image-Pro Plus 5.1軟件處理并分析。Western Blotting結(jié)果圖像經(jīng)Image J軟件處理并分析。所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 17.0軟件包進(jìn)行處理，采用One-Way ANOVA進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，實驗結(jié)果均以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（M±SED）表示，組間顯著性差異水平為P＜0.05和P＜0.01。

2 實驗結(jié)果

2.1 有氧運(yùn)動顯著抑制心梗小鼠骨骼肌質(zhì)量減少

HE染色觀察并統(tǒng)計脛骨前肌細(xì)胞橫截面積，計算肌肉相對質(zhì)量（脛骨前肌質(zhì)量/體質(zhì)量）。結(jié)果表明，與Sham組相比較，心梗7周后，MI組小鼠肌細(xì)胞橫截面積和脛骨前肌相對質(zhì)量顯著降低（P＜0.01）；與MI組相比較，6周運(yùn)動后，ME組小鼠肌細(xì)胞橫截面積明顯升高（P＜0.05），脛骨前肌相對質(zhì)量顯著升高（P＜0.01，圖1A～C）。

圖1 有氧運(yùn)動增加脛骨前肌細(xì)胞橫截面積和肌肉相對質(zhì)量抑制MuRF1和MAFbx蛋白表達(dá)Figure 1.Aerobic Exercise Training Increased the Cross Section Area and Relative Muscle Mass of Tibialis Anterior Cells and Inhibited the Protein Expression of MuRF1 and MAFbx

MuRF1和MAFbx是兩種重要的骨骼肌特異性E3泛素連接酶，常被用作骨骼肌萎縮的標(biāo)記。Western Blotting實驗檢測小鼠肌組織MuRF1和MAFbx蛋白表達(dá)。結(jié)果顯示，與Sham組相比較，MI組MuRF1和MAFbx蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.05）；與MI組相比較，ME組二者表達(dá)均顯著降低（P＜0.05，P＜0.01，圖1D、圖1E）。表明，心梗降低小鼠骨骼肌質(zhì)量，并伴隨骨骼肌蛋白泛素化降解，持續(xù)有氧運(yùn)動對骨骼肌質(zhì)量減少和泛素化降解有改善作用。

2.2 有氧運(yùn)動顯著上調(diào)心梗小鼠骨骼肌Trx1表達(dá)，抑制TXNIP蛋白表達(dá)

Western Blotting檢測有氧運(yùn)動對心梗小鼠脛骨前肌Trx1和TXNIP蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果顯示，與Sham組相比較，MI組Trx1蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.01），TXNIP蛋白表達(dá)顯著增加（P＜0.01）；與MI組相比較，ME組Trx1蛋白表達(dá)明顯升高（P＜0.05），TXNIP蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.01，圖2）。提示，有氧運(yùn)動可調(diào)節(jié)心梗后骨骼肌Trx1和TXNIP蛋白表達(dá)，改變Trx1/TXNIP復(fù)合體狀態(tài)，參與調(diào)節(jié)氧化還原水平。

圖2 有氧運(yùn)動上調(diào)心梗小鼠脛骨前肌Trx1表達(dá)，抑制TXNI PP蛋白表達(dá)Figure 2.Aerobic Exercise Training Up-regulated Trx1 Expression and Down-regulated TXNIP Expression in Tibialis Anterior Tissues of MI Mice

2.3 有氧運(yùn)動顯著改善心梗小鼠骨骼肌氧化應(yīng)激和ERS水平

DHE染色檢測骨骼肌ROS水平，生化試劑盒檢測脛骨前肌SOD活性和MDA含量，以反映其抗氧化能力。結(jié)果表明，與Sham組相比較，MI組脛骨前肌ROS和MDA水平均顯著升高（P＜0.01），SOD活性顯著降低（P＜0.01）；與MI組相比較，ME組脛骨前肌ROS和MDA水平均明顯降低（P＜0.05），SOD 活性顯著升高（P＜0.01，圖 3A～D）。提示，心梗后骨骼肌ROS水平上升，抗氧化能力降低，持續(xù)有氧運(yùn)動可降低ROS水平，提升抗氧化能力。

Western Blotting檢測小鼠脛骨前肌ERS相關(guān)蛋白表達(dá)。結(jié)果顯示，與Sham組相比較，MI組肌組織ASK1、GRP78、磷酸化 IRE1α、ATF6、CHOP、cleaved Casp-12（c-Casp-12）和JNK蛋白表達(dá)均升高（P＜0.05，P＜0.01）；與MI組相比，ME組小鼠脛骨前肌GRP78蛋白表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.01），ASK1、磷酸化 IRE1α、ATF6、ATF4、CHOP 和 c-Casp-12表達(dá)顯著下降（P＜0.05，P＜0.01），JNK表達(dá)無顯著變化。而磷酸化PERK表達(dá)在心梗后和運(yùn)動后均無顯著變化（圖3E、圖3F）。提示，心梗后骨骼肌ERS水平升高，持續(xù)有氧運(yùn)動可調(diào)節(jié)ERS相關(guān)蛋白，尤其是調(diào)節(jié)IRE1α和ATF6兩條途徑，但對PERK途徑影響較小。

圖3 有氧運(yùn)動抑制心梗小鼠脛骨前肌ROS水平和ERS相關(guān)蛋白表達(dá)Figure 3.Exercise Training Inhibited the ROS Level and Regulated the Expression of ERS-related Proteins in Tibialis Anterior Tissues after MI

2.4 有氧運(yùn)動顯著抑制心梗小鼠骨骼肌細(xì)胞凋亡

TUNEL免疫熒光染色結(jié)果顯示，與Sham組相比較，MI組TUNEL陽性顆粒顯著增加（P＜0.01）；與MI組TU‐NEL相比較，ME組陽性顆粒顯著減少（P＜0.05，圖4A、圖4B）。Bcl-2可拮抗促凋亡基因Bax，從而抑制細(xì)胞凋亡現(xiàn)象，Bcl-2/Bax的比值大小可反映細(xì)胞凋亡抑制作用的強(qiáng)弱。Western Blotting結(jié)果表明，與Sham組相比較，MI組Bcl-2/Bax的比值顯著降低（P＜0.01）；與MI組相比較，ME組Bcl-2/Bax比值顯著升高（P＜0.01，圖4C、圖4D）。提示，心梗后小鼠骨骼肌細(xì)胞凋亡，持續(xù)有氧運(yùn)動可調(diào)節(jié)Bcl-2/Bax比值，有效改善細(xì)胞凋亡現(xiàn)象。

圖4 有氧運(yùn)動改善心梗小鼠脛骨前肌細(xì)胞凋亡Figure 4. Exercise Training Inhibited Cell Apoptosis in Tibialis Anterior Tissues after MI

2.5 Trx1顯著抑制H2O2處理的C2C12細(xì)胞ERS

對C2C12成肌細(xì)胞進(jìn)行H2O2干預(yù)，同時進(jìn)行Trx1重組蛋白TXN和/或抑制劑PX-12干預(yù)，Western Blotting檢測TXNIP和ERS相關(guān)蛋白表達(dá)。結(jié)果顯示，與對照組相比，H2O2可顯著增加C2C12成肌細(xì)胞TXNIP、ATF6、GRP78、CHOP和c-Casp-12蛋白表達(dá)水平（P＜0.01）。提示，H2O2誘導(dǎo)C2C12細(xì)胞發(fā)生ERS，激活其誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑。與對照組相比，正常細(xì)胞PX-12或TXN干預(yù)，TXNIP和CHOP表達(dá)無顯著變化，ATF6、GRP78和c-Casp-12蛋白表達(dá)均顯著升高（P＜0.01）；二者聯(lián)合干預(yù)，對TXNIP、ATF6、GRP78、CHOP和c-Casp-12蛋白表達(dá)水平均無顯著差異。提示，正常條件下，抑制或增加Trx1表達(dá)，均可導(dǎo)致ERS反應(yīng)，二者聯(lián)合干預(yù)抵消其誘導(dǎo)的ERS。與H2O2處理組相比，PX-12干預(yù)后，H2O2處理細(xì)胞TXNIP、ATF6、GRP78、CHOP和c-Casp-12蛋白表達(dá)均無顯著變化；TXN干預(yù)后，H2O2處理細(xì)胞TXNIP和c-Casp-12蛋白表達(dá)無顯著差異，ATF6、GRP78和CHOP蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）。與 H2O2＋PX-12組相比，再進(jìn)行TXN干預(yù)顯著降低了TXNIP和CHOP蛋白表達(dá)，升高GRP78和 c-Casp-12蛋 白表達(dá)（P＜0.05，P＜0.01）；與H2O2＋TXN組相比，再進(jìn)行PX-12干預(yù)降低TXNIP蛋白表達(dá)，但升高ATF6、GRP78和c-Casp-12蛋白表達(dá)（P＜0.05，P＜0.01，圖5A～F）。提示，TXN干預(yù)可改善H2O2誘導(dǎo)的ERS現(xiàn)象及其激活的細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)，PX-12并未惡化H2O2誘導(dǎo)的ERS現(xiàn)象，但可降低TXN的保護(hù)效應(yīng)。

圖5 Trx1改善H2O2誘導(dǎo)C2C12細(xì)胞ERS相關(guān)蛋白表達(dá)Figure 5.Trx1 Regulated the Expression of ERS-related Proteins in C2C12 Myoblasts after H2O2Intervention

2.6 Trx1顯著抑制H2O2處理誘導(dǎo)的C2C12細(xì)胞凋亡

TUNEL檢測C2C12成肌細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果顯示，與對照組相比，H2O2可顯著增加TUNEL陽性細(xì)胞比例（P＜0.01），提示，H2O2誘導(dǎo)C2C12細(xì)胞凋亡。與對照組相比，正常細(xì)胞PX-12和/或TXN干預(yù)，TUNEL陽性細(xì)胞比例無顯著變化，提示正常條件下，抑制或增加Trx1表達(dá)，未引起細(xì)胞凋亡的進(jìn)一步發(fā)生。與H2O2處理組相比，PX-12干預(yù)后，H2O2處理細(xì)胞TUNEL陽性細(xì)胞比例顯著增加（P＜0.01）；TXN干預(yù)后，H2O2處理細(xì)胞TUNEL陽性細(xì)胞比例顯著減少（P＜0.01）。與H2O2+PX-12組相比，再進(jìn)行TXN干預(yù)顯著降低了TUNEL陽性細(xì)胞比例（P＜0.01）；與H2O2＋TXN組相比，再進(jìn)行PX-12干預(yù)增加了TUNEL陽性細(xì)胞比例（P＜0.01，圖6）。提示，TXN干預(yù)可改善H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，PX-12加劇了H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，降低TXN的有效效應(yīng)。Trx1激活ERS可能為其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的途徑之一。

圖6 Trx1改善H2O2誘導(dǎo)的C2C12細(xì)胞凋亡Figure 6.Trx1 Inhibited H2O2-induced C2C12 Myoblasts Apoptosis

3 分析與討論

慢性疾病伴隨的骨骼肌萎縮影響患者的生存質(zhì)量，尋求有效改善骨骼肌萎縮的方式方法，探索其發(fā)病機(jī)制和干預(yù)靶點具有重要意義。研究證實，心?；颊哌M(jìn)行適宜的運(yùn)動訓(xùn)練，對于提升心功能、改善機(jī)體狀態(tài)和緩解骨骼肌萎縮具有積極作用，然而其作用靶點和分子機(jī)制仍然是現(xiàn)今研究的熱點問題。本文通過心梗小鼠運(yùn)動干預(yù)模型，探討運(yùn)動是否上調(diào)Trx1蛋白表達(dá)、改善氧化應(yīng)激、ERS水平和細(xì)胞凋亡，進(jìn)而緩解骨骼肌質(zhì)量減少，遏制骨骼肌萎縮的發(fā)生；通過細(xì)胞實驗驗證Trx1干預(yù)對H2O2處理的C2C12成肌細(xì)胞ERS相關(guān)蛋白表達(dá)和細(xì)胞凋亡的影響。本文結(jié)果證實Trx1可通過改善ERS水平在運(yùn)動抑制心梗后骨骼肌質(zhì)量減少中發(fā)揮作用。

3.1 有氧運(yùn)動改善心梗小鼠骨骼肌質(zhì)量減少

心梗后心臟泵血功能降低，導(dǎo)致外周血流量減少，可引發(fā)多種組織器官結(jié)構(gòu)和功能異常。有文獻(xiàn)指出，慢性心衰患者發(fā)生骨骼肌萎縮，伴隨線粒體密度降低，氧化代謝能力降低，導(dǎo)致運(yùn)動能力下降（Mancini et al.，1992；Mangner et al.，2015；Wilson et al.，1993）。因此在改善心功能的同時，抑制心梗后骨骼肌萎縮具有重要意義。

心梗7周后，小鼠脛骨前肌相對質(zhì)量和肌細(xì)胞橫截面積均下降，提示心梗后病理進(jìn)程中伴隨骨骼肌質(zhì)量減少。前期研究證實，心梗后可導(dǎo)致大鼠比目魚肌和脛骨前肌質(zhì)量減少，而對腓腸肌影響不大（梁巧琴等，2018）。這可能與不同肌肉類型在心梗后的代謝差異以及脂質(zhì)升高和DNA氧化損傷的程度有關(guān)（Mangner et al.，2015）。泛素-蛋白酶系統(tǒng)（ubiquitin-proteasome system，UPS）是受損蛋白質(zhì)主要的水解途徑，在骨骼肌萎縮過程的蛋白降解中扮演重要角色。UPS的過度激活可進(jìn)一步提示骨骼肌萎縮的發(fā)生。MuRF1和MAFbx是主要的E3泛素連接酶的底物，與骨骼肌萎縮直接相關(guān)（McKinnell et al.，2004）。本文結(jié)果表明，心梗骨骼肌MuRF1和MAFbx蛋白表達(dá)顯著高于Sham組，說明心梗后骨骼肌UPS水平升高，蛋白降解增強(qiáng)，可能是肌細(xì)胞橫截面積縮小，骨骼肌質(zhì)量減少的原因之一。中等強(qiáng)度的有氧運(yùn)動可安全有效地改善心衰后心功能、骨骼肌異常和運(yùn)動能力。本文結(jié)果證實，6周有氧運(yùn)動后，脛骨前肌細(xì)胞橫截面積和肌肉相對質(zhì)量顯著增加，MuRF1和MAFbx表達(dá)顯著降低，說明有氧運(yùn)動可有效降低骨骼肌細(xì)胞蛋白降解水平，緩解肌細(xì)胞面積減小，遏制骨骼肌質(zhì)量減少現(xiàn)象的發(fā)生。

3.2 有氧運(yùn)動改善心梗骨骼肌氧化應(yīng)激、ERS及其誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡

氧化應(yīng)激及其誘導(dǎo)的損傷反應(yīng)是導(dǎo)致骨骼肌萎縮的重要誘因（Coirault et al.，2007；Guarnier et al.，2010）。研究發(fā)現(xiàn)，心衰后促氧化和抗氧化反應(yīng)之間的失衡可導(dǎo)致骨骼肌氧化應(yīng)激的產(chǎn)生。與健康成人相比，心衰患者骨骼肌中抗氧化酶如SOD、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GPx)等活性下降，而ROS水平升高（Linke et al.，2005）。研究表明，ROS在骨骼肌生理病理過程中發(fā)揮重要的信使作用。正常情況下，低水平的ROS可增強(qiáng)細(xì)胞適應(yīng)性，而過度增加的ROS則產(chǎn)生氧化應(yīng)激，導(dǎo)致肌細(xì)胞凋亡/生成比例失調(diào)（Li et al.，2019）。本文結(jié)果證實，心梗后骨骼肌ROS和MDA水平顯著增加，抗氧化酶SOD等活性顯著降低，提示心梗骨骼肌氧化應(yīng)激水平升高，抗氧化能力降低，氧化代謝能力受損。不同的運(yùn)動方式可調(diào)節(jié)活性氧類的氧化還原信號（Cai et al.，2018；Henriquez-Olguin et al.，2020）。有研究表明，運(yùn)動可引起抗氧化酶（包括SOD2、Trx1、prdx3和GPX1）表達(dá)的改變，從而限制常見的腦血管病氧化應(yīng)激的增加。有氧運(yùn)動可有效抑制心衰后骨骼肌氧化應(yīng)激水平（Cunha et al.，2012），通過降低NADPH氧化酶活性，改善心衰引起的骨骼肌質(zhì)量丟失（Cunha et al.，2017）。本文研究結(jié)果證實，6周有氧運(yùn)動后，骨骼肌中抗氧化酶SOD活性高于MI組，且ROS和MDA水平低于MI組。說明，有氧運(yùn)動可有效改善骨骼肌抗氧化能力，降低氧化應(yīng)激水平。骨骼肌作為主要的運(yùn)動器官，在訓(xùn)練過程中可發(fā)生適應(yīng)性變化。規(guī)律運(yùn)動可上調(diào)抗氧化分子產(chǎn)生，以抑制ROS產(chǎn)生的負(fù)性效應(yīng)，如中和氧自由基的過度生成，改善骨骼肌組織內(nèi)環(huán)境，使肌肉發(fā)生適應(yīng)性變化（Steinbacher et al.，2015）。因此推測，有氧運(yùn)動抑制心梗骨骼肌ROS過度增加，改善組織微環(huán)境，發(fā)揮運(yùn)動保護(hù)效應(yīng)。

骨骼肌ER在肌肉收縮功能中發(fā)揮重要作用。研究表明，ROS的急劇升高可直接導(dǎo)致細(xì)胞Ca2+穩(wěn)態(tài)失衡，蛋白質(zhì)合成、折疊和轉(zhuǎn)運(yùn)障礙，ER功能紊亂，進(jìn)一步引發(fā)ERS反應(yīng)（Zhang，2010）。目前研究認(rèn)為，ERS誘導(dǎo)的UPR通路在多種情況下對骨骼肌質(zhì)量和代謝功能的調(diào)節(jié)起著關(guān)鍵作用（Afroze et al.，2019）。ERS反應(yīng)對于維持正常骨骼肌質(zhì)量和功能至關(guān)重要，完全抑制ERS反應(yīng)可誘導(dǎo)癌癥惡病質(zhì)中的骨骼肌萎縮（Bohnert et al.，2016）。而肌萎縮性側(cè)索硬化癥（ALS）小鼠中，癥狀出現(xiàn)前早期骨骼肌ERS反應(yīng)被激活，并隨著疾病的進(jìn)展而增加，ALS轉(zhuǎn)基因小鼠中PERK、IRE1α、GRP78和CHOP表達(dá)顯著增加，且快肌表達(dá)水平高于慢肌，表明肌細(xì)胞應(yīng)激導(dǎo)致蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化減少，發(fā)生肌萎縮（Chen et al.，2015）。Deldicque等（2013）指出，ERS可直接影響骨骼肌質(zhì)量，長期過度的ERS可導(dǎo)致細(xì)胞死亡，阻斷肌肉合成代謝，導(dǎo)致肌肉質(zhì)量下降。本文結(jié)果顯示，心梗后骨骼肌ERS相關(guān)蛋白表達(dá)顯著增加，說明骨骼肌存在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能障礙，其原因可能與氧化應(yīng)激水平升高導(dǎo)致的Ca2+穩(wěn)態(tài)失衡有關(guān)，同時發(fā)現(xiàn)凋亡誘導(dǎo)信號ASK1、CHOP、c-Casp-12和JNK均表達(dá)升高，TUNEL陽性結(jié)果增加，Bcl-2/Bax比值降低，說明心梗骨骼肌中存在ERS誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，可能是骨骼肌質(zhì)量減少的重要機(jī)制。有研究提出，衰老過程中UPR反應(yīng)蛋白表達(dá)逐漸降低，運(yùn)動可通過增加伴侶分子表達(dá)，恢復(fù)UPR反應(yīng)，降低ERS誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷（Deldicque，2013）。本文結(jié)果表明，運(yùn)動下調(diào)磷酸化 IRE1α、ATF6、ATF4、ASK1、CHOP和c-Casp-12蛋白表達(dá)，說明在一定程度上抑制了ERS水平及其誘導(dǎo)的凋亡信號，但同時運(yùn)動上調(diào)了GRP78蛋白表達(dá)，這與文獻(xiàn)報道一致，說明運(yùn)動可能通過激活分子伴侶表達(dá)，促進(jìn)正性ERS反應(yīng)，維持體內(nèi)平衡，但同時抑制ERS凋亡信號，降低細(xì)胞凋亡的發(fā)生。運(yùn)動作用的具體分子機(jī)制及其對各個ERS下游通路的調(diào)節(jié)作用仍需進(jìn)一步研究。

3.3 有氧運(yùn)動上調(diào)Trx1表達(dá)改善骨骼肌ERS的可能機(jī)制

正常生理狀態(tài)下，機(jī)體存在抗氧化防御體系，來維持細(xì)胞內(nèi)氧化還原穩(wěn)態(tài)。Trx1是機(jī)體重要的內(nèi)源性氧化還原調(diào)節(jié)蛋白，可將二硫化物還原成硫醇基團(tuán)來還原被氧化的蛋白，并調(diào)控細(xì)胞ROS水平，調(diào)節(jié)細(xì)胞氧化還原狀態(tài)。目前關(guān)于Trx1對機(jī)體的保護(hù)效應(yīng)多集中在改善炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激損傷等方面，對于心梗骨骼肌Trx1與ERS的研究報道有限。有研究發(fā)現(xiàn)，Trx1過表達(dá)可抑制敗血病小鼠血漿和肺中炎性因子及ERS標(biāo)志蛋白表達(dá)，并認(rèn)為Trx1可通過抑制ERS調(diào)節(jié)炎性應(yīng)答（Chen et al.，2016）。對帕金森綜合征的研究發(fā)現(xiàn)，降低Trx1表達(dá)可導(dǎo)致PC12細(xì)胞ERS反應(yīng)，過表達(dá)Trx1調(diào)節(jié)ERS相關(guān)蛋白變化，抑制誘導(dǎo)的ERS反應(yīng)（Zeng et al.，2014）。此外，ERS反應(yīng)中可形成IRE1-TRAF2-ASK1復(fù)合物，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡（Homma et al.，2009；Nishitoh et al.，1998）。而Trx1可與ASK1 N端的Trx結(jié)合域結(jié)合，從而抑制ASK1的活化（Kekulandara et al.，2018；Powis et al.，2001）。據(jù)此推測，上調(diào)骨骼肌Trx1表達(dá)，是抑制ERS反應(yīng)及其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡水平的重要途徑。

TXNIP能夠與Trx1結(jié)合形成Trx1/TXNIP氧化還原酶體，通過二硫鍵交換抑制Trx1還原活性和表達(dá)（Nishiya‐ma et al.，1999；Yoshihara et al.，2014）。 ROS 可 促 進(jìn)TXNIP從細(xì)胞核轉(zhuǎn)位入細(xì)胞質(zhì)，激活A(yù)SK1、NLRP3等細(xì)胞凋亡和炎癥相關(guān)蛋白表達(dá)（Mohamed et al.，2014）。而ROS誘導(dǎo)的ERS通過PERK和IRE1α進(jìn)一步促進(jìn)TXNIP在轉(zhuǎn)錄水平和轉(zhuǎn)錄后水平的表達(dá)（Lerner et al.，2012；Os‐lowski et al.，2012），抑制ERS元件可下調(diào)腦損傷后TXNIP的表達(dá)，提示TXNIP在ROS和ERS及其誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮重要作用（Zhao et al.，2017）。本文結(jié)果發(fā)現(xiàn)，心梗后骨骼肌Trx1蛋白表達(dá)顯著下降，TXNIP表達(dá)顯著增加，二者表達(dá)比例發(fā)生變化。其原因可能是骨骼肌ROS水平持續(xù)升高，ERS反應(yīng)過度，激活了TXNIP表達(dá)，進(jìn)而抑制Trx1活性和表達(dá)。6周持續(xù)有氧運(yùn)動后，骨骼肌Trx1蛋白表達(dá)顯著高于心梗組，TXNIP表達(dá)顯著降低，說明運(yùn)動可激活Trx1表達(dá)，抑制TXNIP對Trx1的調(diào)節(jié)作用。Trx1表達(dá)升高可調(diào)節(jié)多種抗氧化酶活性，如SOD（Das et al.，1997），進(jìn)一步清除組織ROS，改善氧化還原狀態(tài)。推測，運(yùn)動抑制了心梗后骨骼肌ROS水平，降低ERS反應(yīng)，抑制TXNIP表達(dá)，進(jìn)而減弱TXNIP對Trx1的抑制作用。運(yùn)動上調(diào)Trx1表達(dá)可進(jìn)一步抵抗心梗后骨骼肌ROS，緩解ERS反應(yīng)，進(jìn)而降低TXNIP表達(dá)，形成良性循環(huán)。

為進(jìn)一步研究Trx1是否參與調(diào)節(jié)ERS反應(yīng)，本研究對C2C12細(xì)胞進(jìn)行H2O2干預(yù)，模擬氧化應(yīng)激損傷，驗證外源性進(jìn)行Trx1重組蛋白和抑制Trx1對ERS和細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果顯示，正常條件下，抑制或增加Trx1表達(dá)，均可導(dǎo)致ERS反應(yīng)，但細(xì)胞凋亡水平無顯著變化，證實Trx1在細(xì)胞正常生理功能維持中發(fā)揮重要作用，其表達(dá)或作用功能異常均可使細(xì)胞產(chǎn)生應(yīng)激，導(dǎo)致代償性的ERS反應(yīng)，調(diào)節(jié)細(xì)胞ER穩(wěn)態(tài)，促使細(xì)胞恢復(fù)正常生理功能。H2O2干預(yù)使C2C12成肌細(xì)胞TXNIP及ERS相關(guān)蛋白及其凋亡途徑蛋白表達(dá)顯著上調(diào)，細(xì)胞凋亡程度顯著增加，證實氧化應(yīng)激損傷可激活ERS反應(yīng)和TXNIP的表達(dá)水平，啟動凋亡信號，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。TXN干預(yù)有效降低ATF6、GRP78和CHOP蛋白表達(dá)，但對TXNIP蛋白表達(dá)影響不大，說明上調(diào)Trx1蛋白可有效降低氧化應(yīng)激導(dǎo)致的ERS水平，降低細(xì)胞凋亡，其對TXNIP及其他ERS相關(guān)蛋白的調(diào)節(jié)作用程度不同，Trx1介導(dǎo)的直接途徑仍需進(jìn)一步研究探討。PX-12干預(yù)并沒有進(jìn)一步加重ERS水平，但細(xì)胞凋亡程度顯著增加，PX-12可降低TXN對ERS及細(xì)胞凋亡的有效抑制效應(yīng)，推測ERS途徑可能是Trx1抑制細(xì)胞凋亡的途徑之一。

綜上推測，心梗誘導(dǎo)骨骼肌ROS水平升高，Trx1蛋白表達(dá)減少，抗氧化能力降低，誘導(dǎo)ERS水平升高；ERS可進(jìn)一步激活TXNIP蛋白表達(dá)，降低Trx1蛋白表達(dá)，進(jìn)一步增加ROS水平，形成惡性循環(huán)，從而導(dǎo)致骨骼肌細(xì)胞凋亡和質(zhì)量丟失。升高Trx1水平可緩解氧化應(yīng)激導(dǎo)致的ERS反應(yīng)，抑制細(xì)胞凋亡水平。有氧運(yùn)動可上調(diào)Trx1蛋白表達(dá)，抑制TXNIP表達(dá)，改善ROS和ERS水平，抑制心梗后骨骼肌細(xì)胞凋亡，從而緩解骨骼肌質(zhì)量丟失，遏制骨骼肌萎縮的發(fā)生（圖7）。

圖7 運(yùn)動上調(diào)Trx1抑制心梗小鼠骨骼肌質(zhì)量丟失可能機(jī)制Figure 7.Possible Mechanism of Exercise-induced Trx1 in Inhibiting the Loss of Skeletal Muscle Mass after MI

骨骼肌可為機(jī)體運(yùn)動、姿勢維持和呼吸提供機(jī)械動力，同時，在調(diào)節(jié)機(jī)體新陳代謝方面發(fā)揮重要作用。骨骼肌與多種組織器官存在“交叉對話”，并可發(fā)揮內(nèi)分泌功能。多種病理條件和衰老都可導(dǎo)致骨骼肌質(zhì)量減少，甚至發(fā)生骨骼肌萎縮現(xiàn)象。如何有效抑制骨骼肌萎縮的發(fā)生，緩解病理進(jìn)程的發(fā)展，已成為運(yùn)動醫(yī)學(xué)領(lǐng)域關(guān)注的熱點問題。目前針對運(yùn)動改善骨骼肌萎縮的分子機(jī)制研究，主要集中在運(yùn)動促進(jìn)肌漿網(wǎng)鈣釋放和再攝取，促進(jìn)蛋白合成，降低UPS過度激活，降低炎性水平，提高有氧代謝能力和促進(jìn)生長因子表達(dá)等方面。本研究針對心梗誘導(dǎo)慢性心衰過程中并發(fā)的骨骼肌萎縮現(xiàn)象，從氧化應(yīng)激-ERS-細(xì)胞凋亡這一途徑，探討運(yùn)動改善骨骼肌質(zhì)量減少的可能機(jī)制。研究結(jié)果顯示，上調(diào)心梗骨骼肌Trx1表達(dá)可能是運(yùn)動改善骨骼肌氧化應(yīng)激，降低ERS反應(yīng)，抑制肌細(xì)胞凋亡，緩解骨骼肌質(zhì)量減少的重要靶點。

本文仍存在不足之處：1）通過細(xì)胞實驗初步確定Trx1參與運(yùn)動改善ERS水平，抑制細(xì)胞凋亡，緩解骨骼肌質(zhì)量減少，但未進(jìn)行動物體內(nèi)抑制或過表達(dá)Trx1對骨骼肌ERS和細(xì)胞凋亡的影響等相關(guān)實驗，關(guān)于Trx1在運(yùn)動保護(hù)效應(yīng)中的作用及所占效應(yīng)比例值得進(jìn)一步研究。2）氧化應(yīng)激在骨骼肌萎縮中發(fā)揮重要作用，如調(diào)節(jié)UPS系統(tǒng)的活性，促進(jìn)炎癥反應(yīng)等，本文聚焦于ERS反應(yīng)，缺乏對炎癥反應(yīng)和UPS系統(tǒng)在運(yùn)動保護(hù)效應(yīng)中的探討，氧化應(yīng)激、ERS、炎癥反應(yīng)以及蛋白降解之間的關(guān)系值得深入探索。3）運(yùn)動可激活多種肌肉因子表達(dá)，參與抑制骨骼肌萎縮（Piccirillo，2019），有研究發(fā)現(xiàn)促進(jìn)骨骼肌生長有助于改善梗死后心臟功能（Araki et al.，2012）。肌肉因子的表達(dá)是否可改善ERS及其引發(fā)的肌細(xì)胞凋亡？運(yùn)動改善心梗后心功能，是否與其對骨骼肌萎縮的改善效應(yīng)及生長促進(jìn)效應(yīng)有關(guān)？運(yùn)動如何加強(qiáng)骨骼肌和心臟之間的“交叉對話”，其中參與的肌肉因子篩選及可能機(jī)制值得進(jìn)一步探討。

4 結(jié)論

Trx1在改善ERS水平及其誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮重要作用；有氧運(yùn)動可上調(diào)心梗骨骼肌Trx1表達(dá)，降低氧化應(yīng)激水平，緩解ERS反應(yīng)和細(xì)胞凋亡，降低蛋白泛素化降解過程，抑制心梗后的骨骼肌質(zhì)量減少。