不同濃度氯霉素對大腸桿菌質(zhì)粒擴增的影響

陳緒美　尹志勇　檀軍　田瑩　李卓　郭建軍

摘 要：篩選獲得促進大腸桿菌質(zhì)粒擴增的最優(yōu)氯霉素濃度。采用單因素控制變量法，通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)化、搖菌、質(zhì)粒提取、PCR擴增、瓊脂糖凝膠電泳檢測等方法，并設(shè)置菌液培養(yǎng)時間梯度與氯霉素濃度梯度，分析不同濃度的氯霉素對大腸桿菌質(zhì)粒擴增的影響。結(jié)果顯示：未加氯霉素的大腸桿菌菌液培養(yǎng)18h時，質(zhì)粒濃度最高，為（605.425±63.241）ng/μL;菌液培養(yǎng)18h時加入10～250μg/mL的氯霉素對質(zhì)粒擴增皆具促進作用;且濃度為150μg/mL時，質(zhì)粒的擴增效率最高，為（645.425±45.042）ng/μL。10～250μg/mL的氯霉素對大腸桿菌質(zhì)粒擴增皆具促進作用，促進作用最佳濃度為150μg/mL。

關(guān)鍵詞：氯霉素;大腸桿菌;質(zhì)粒;擴增;濃度

中圖分類號：Q-9文獻標(biāo)識碼：A

文章編號：1008-0457（2020）06-0081-04國際DOI編碼：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2020.06.014

Abstract：In order to obtain the optimal concentration of chloramphenicol for promoting the amplification of plasmid in Escherichia coli， this study set the time and the concentration gradient of chloramphenicol to explore the effects of different concentrations of chloramphenicol on the amplification of plasmid. Using single-factor control variable method， this paper performed plasmid transformation， shaking， plasmid extraction， PCR amplification， and agarose gel electrophoresis detection. When E. coli solution was not provided with chloramphenicol， the plasmid concentration had the highest （605.425±63.241ng/μL） at 18 h of cultivation. Adding 10～250μg/mL chloramphenicol to culture for 18 hours could promote the amplification of plasmids. When the added concentration of chloramphenicol was 150μg/mL， the amplification efficiency got the highest（645.425±45.042）ng/μL. Chloramphenicol at the concentrations of 10-250g/mL can promote the amplification of plasmid in E. coli， and the optimal concentration is 150 μg/mL.

Keywords：chloramphenicol; Escherichia coli; plasmid; amplification; concentration

質(zhì)粒是存在于細菌等生物中的可獨立復(fù)制的DNA分子，可與細菌共生，并可隨宿主的分裂而傳給子代細胞[1]，其在基因工程中具有廣泛的應(yīng)用，如用于構(gòu)建表達載體，可實現(xiàn)目的基因轉(zhuǎn)移、蛋白表達[2]，用于制備DNA疫苗等[3-4]。在現(xiàn)代分子生物學(xué)試驗中，質(zhì)粒的擴增、提取是基本的試驗操作[5-6]，但用常規(guī)方法進行質(zhì)粒擴增，得到的質(zhì)粒產(chǎn)率較低[7-9]，常常延誤試驗進程。近年來，研究人員對提取大腸桿菌質(zhì)粒的各種方法進行了比較和優(yōu)化，但對大腸桿菌質(zhì)粒的提取結(jié)果都還不是很理想[7，10]，張海峰等[11]、王友如[12]提出氯霉素對大腸桿菌質(zhì)粒有擴增作用，能有效地提高大腸桿菌質(zhì)粒的提取效率，但此后未見過在大腸桿菌提取試驗中應(yīng)用氯霉素的報道，其中促進大腸桿菌質(zhì)粒擴增的氯霉素的最適濃度也尚未見報道。本試驗旨在篩選促進質(zhì)粒擴增的最佳氯霉素濃度，為提高大腸桿菌質(zhì)粒擴增效率提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

無水乙醇（純度≥99.7%）購自重慶川東化工有限公司;DH5α感受態(tài)細胞（保存于-80℃冰箱）、蛋白胨（FMB 級）、酵母膏（FMB 級）、瓊脂粉（試劑級）、氯化鈉（分析純）、氯霉素（USP級）、焦碳酸二乙酯處理水（DEPC水）均購自生工生物工程（上海）有限公司;FastPure Plasmid Mini Kit試劑盒購自南京諾唯贊生物科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 LB培養(yǎng)基的配制

稱取蛋白胨10g，牛肉膏粉3g，氯化鈉5g置于燒杯中，加入去離子水，定容至1L;加入15g瓊脂粉，攪拌均勻使之全部溶解，分裝于錐形瓶中;121℃高壓蒸汽滅菌30min，冷卻至常溫，備用。

1.2.2 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化

取感受態(tài)細胞DH5α200μL，冰上放置10min;融化后，加入5ng大腸桿菌質(zhì)粒（實驗室保存pWSLV-Cytochrome c質(zhì)粒，含基因片段Cytochrome c，9818 bp），待混勻后于冰上放置30min;42℃水浴45s（PC200- A40型恒溫水浴鍋，美國賽默飛），冰上放置2min，加入LB培養(yǎng)基800μL，置于37℃恒溫搖床中150rpm/min振蕩培養(yǎng)1h;取菌液200μL，均勻涂布于LB平板（含有25μg/mL氨芐青霉素）;將培養(yǎng)基置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12h，挑取陽性菌落進行培養(yǎng)。

1.2.3 搖菌時間對菌液質(zhì)粒濃度的影響

將1μL大腸桿菌加入200mL LB培養(yǎng)基，放入37℃恒溫搖床中進行培養(yǎng)，分別在12h、14h、16h、18h、20h、22h、24h時，吸取5mL菌液于15mL無菌離心管中，分別對上述時間點的菌液進行質(zhì)粒提取，用NanoDrop 2000/2000C分光光度計（美國賽默飛世爾公司）測量質(zhì)粒濃度，確定質(zhì)粒濃度最高的培養(yǎng)時間。

1.2.4 不同濃度氯霉素對質(zhì)粒濃度的影響

為了延長質(zhì)粒的對數(shù)生長期，在1.2.3篩選到最佳搖菌時間的基礎(chǔ)上，分別向各錐形瓶中加入不同濃度氯霉素，終濃度分別為0、10、50、100、150、200、250、300μg/mL，放入37℃恒溫搖床中培養(yǎng)6h。

1.2.5 質(zhì)粒提取

取5mL菌液于15mL離心管中，10000g離心1min，去菌液;向留有沉淀的離心管中加入250μL Buffer P1，用移液槍吹打使之混合均勻;加入250μL Buffer P2，溫和地上下顛倒混勻8次;加入350μL Buffer P3，上下顛倒混勻8次，13000g離心10min;將Fast Pure DNA Mini Columns吸附柱置于2mL收集管中，將上清液轉(zhuǎn)移到吸附柱中，13000g離心1min，倒掉收集管中的廢液;向吸附柱加入600μL Buffer PW（事先加入無水乙醇稀釋），13000g離心1min，棄廢液;再加入600μL Buffer PW，13000g離心1min，棄廢液;將離心柱放回收集管中，13000g離心1min;將吸附柱置于1.5mL離心管中，加入30μL Elution Buffer，靜置2min，13000g離心1min洗脫;重復(fù)洗脫一次。-20℃保存。

1.3 質(zhì)粒的檢測

1.3.1 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測質(zhì)粒

取3 μL質(zhì)粒和2 μL上樣緩沖液混合，加入1% 瓊脂糖凝膠中，130V電泳20min，用Bio-Rad凝膠成像儀（美國伯樂公司）拍照。

1.3.2 PCR擴增及擴增產(chǎn)物檢測

以1.2.5中提取的質(zhì)粒為模板，根據(jù)質(zhì)粒中含有的Cytochrome c基因序列（327 bp），利用Primer 6.0軟件設(shè)計擴增引物如下，上游：5'-ATGGGTGTCCCTGGAGGA-3，下游：5'-CTTAGCTTCTTTTAG-3，依次向PCR管中加入質(zhì)粒2μg、上下游引物各1 μg、PCRmix 10μL、ddH2O 6μL，PCR總反應(yīng)體系為20μL。PCR擴增反應(yīng)條件如下：預(yù)變性：96℃、3min，35個循環(huán);變性：96℃、20s;退火：59℃、20s;延伸：72℃、1min;35個循環(huán)結(jié)束后，總延伸：72℃，3min;取8μL PCR產(chǎn)物，上樣;1% 瓊脂糖凝膠中130V電壓下電泳 20min，用Bio-Rad凝膠成像儀拍照。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

試驗數(shù)據(jù)使用SPSS 21.0軟件進行分析，試驗數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準誤（Mean±SE）表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 不加氯霉素條件下大腸桿菌質(zhì)粒結(jié)果分析

2.1.1 質(zhì)粒濃度分析

培養(yǎng)不同時間的大腸桿菌菌液的質(zhì)粒濃度如圖1，可見質(zhì)粒的濃度總體呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，在培養(yǎng)18h時，提取的質(zhì)粒的濃度最高，為（605.425±63.241）ng/μL。

2.2 氯霉素對大腸桿菌質(zhì)粒擴增結(jié)果分析

2.2.1 質(zhì)粒濃度分析

氯霉素作用下的大腸桿菌菌液質(zhì)粒濃度如圖2所示，結(jié)果表明，大腸桿菌質(zhì)粒的濃度隨著氯霉素濃度的升高呈先上升后下降的趨勢，10～250μg/mL的氯霉素對大腸桿菌質(zhì)粒擴增具有促進作用，且在氯霉素濃度為150μg/mL時大腸桿菌質(zhì)粒的濃度達到最高，為（645.425±45.042）ng/μL。由圖2可知，與對照組相比，除氯霉素濃度為300μg/mL時大腸桿菌質(zhì)粒的濃度有所降低，其余各組中大腸桿菌質(zhì)粒的濃度都有所增加，其中氯霉素濃度為150μg/mL時對大腸桿菌質(zhì)粒的擴增作用最明顯。

2.2.2 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果分析

圖3為氯霉素作用下大腸桿菌質(zhì)粒凝膠電泳圖，從圖中可見，各濃度氯霉素作用下的大腸桿菌質(zhì)粒都有亮度基本一致的條帶，其分子量在5000～10000 bp之間，與預(yù)期的導(dǎo)入大腸桿菌質(zhì)粒分子量9818 bp基本一致。

2.2.3 PCR檢測結(jié)果分析

圖4是以氯霉素作用下的大腸桿菌質(zhì)粒為模板進行的PCR擴增產(chǎn)物凝膠電泳圖，在氯霉素濃度為0、10、50、100、150、200、300 μg/mL時，在250 bp偏上的位置可見目的條帶，其中氯霉素濃度為150 μg/mL時的擴增條帶最亮，與其預(yù)期的擴增產(chǎn)物Cytochrome c基因開放閱讀框327 bp基本一致。

3 結(jié)論與討論

質(zhì)粒表達并攜帶的遺傳信息對基因工程的開展有著至關(guān)重要的作用。隨著質(zhì)粒在基因工程中的廣泛應(yīng)用，試驗中對質(zhì)粒的要求越來越高，提取質(zhì)粒的濃度、純度等直接影響試驗結(jié)果。傳統(tǒng)的方法和試劑盒直接提取大腸桿菌的質(zhì)粒，得到的質(zhì)粒濃度都不太理想[7-9]。研究表明氯霉素對大腸桿菌質(zhì)粒有擴增作用[11]。在此基礎(chǔ)上，本試驗以改變大腸桿菌的培養(yǎng)條件，在培養(yǎng)過程加入不同濃度的氯霉素，再用試劑盒提取大腸桿菌質(zhì)粒，以探究氯霉素對大腸桿菌質(zhì)粒擴增作用的最佳濃度，以獲得高濃度的大腸桿菌質(zhì)粒。

近年來，研究人員對提取大腸桿菌質(zhì)粒的各種方法進行了比較和優(yōu)化，張海峰等[11]、王友如[12]提出氯霉素對大腸桿菌質(zhì)粒有擴增作用，此后鮮見在對大腸桿菌質(zhì)粒的提取方法中應(yīng)用氯霉素的報道。本試驗在前人研究明確氯霉素對大腸桿菌質(zhì)粒有擴增作用的基礎(chǔ)上，篩選促進大腸桿菌質(zhì)粒擴增作用的最適氯霉素濃度，旨在提高提取的大腸桿菌質(zhì)粒的濃度，為提高大腸桿菌質(zhì)粒擴增效率提供參考。

本研究各試驗組和對照組的大腸桿菌均在同一時間、同一條件下培養(yǎng)，且采用同一試劑盒在同一時間、同一條件下提取大腸桿菌質(zhì)粒，避免了溫、濕度和營養(yǎng)條件等差異影響試驗結(jié)果。采用單因素控制變量法，首先明確了大腸桿菌在培養(yǎng)18 h時，所提取的大腸桿菌質(zhì)粒的濃度最高，在此基礎(chǔ)上，向菌液中加入不同濃度的氯霉素，再培養(yǎng)6 h，對大腸桿菌質(zhì)粒進行提取、比較，明確了在氯霉素濃度為150 μg/mL時，大腸桿菌質(zhì)粒的擴增效率最高。為進一步明確所提取的質(zhì)粒為目的質(zhì)粒，本研究以所提取的質(zhì)粒為模板，根據(jù)質(zhì)粒中含有的Cytochrome c基因序列設(shè)計了一對引物進行PCR擴增，且分別對質(zhì)粒及PCR擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，在預(yù)期的分子量（質(zhì)粒9818 bp、PCR擴增產(chǎn)物327 bp）附近均可見清晰的目的條帶，表明所提取的質(zhì)粒為攜帶Cytochrome c基因的目的質(zhì)粒。

在質(zhì)粒提取試驗中，質(zhì)粒的濃度對后續(xù)的一系列試驗的結(jié)果都有較大的影響，因此在一系列與質(zhì)粒有關(guān)的試驗中，質(zhì)粒的濃度對試驗的進行起著至關(guān)重要作用。本試驗結(jié)果表明，氯霉素對大腸桿菌質(zhì)粒的擴增具有明顯的促進作用，與對照組相比，氯霉素濃度為150 μg/mL時，大腸桿菌質(zhì)粒的擴增效果最明顯。在前期質(zhì)粒提取試驗中加入氯霉素對大腸桿菌進行培養(yǎng)，再提取質(zhì)粒，再用此質(zhì)粒開展后續(xù)試驗，有利于后續(xù)一系列試驗的順利開展及提高試驗效果。

綜上所述，菌液培養(yǎng)至18時，加入10～250 μg/mL的氯霉素對大腸桿菌質(zhì)粒擴增均具有促進作用，且在在氯霉素濃度為150 μg/mL時，大腸桿菌質(zhì)粒的擴增效率最高，該研究結(jié)果可為提高大腸桿菌質(zhì)粒擴增效率提供參考。

參 考 文 獻：

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