洋槐蜜和椴樹蜜結(jié)晶前后的主要物質(zhì)組成和熱力學(xué)性質(zhì)變化研究

郭娜娜, 米鑫, 羅其花, 趙亞周

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蜜蜂研究所, 北京 100093; 2.河北省食品檢驗(yàn)研究院, 石家莊 050091; 3.北京市密云區(qū)園林綠化局, 北京 101500)

蜂蜜是由蜜蜂從蜜源植物的花朵上采集花蜜或蜜露后，將其貯存于蜂巢內(nèi)的巢脾中，經(jīng)充分釀制而成[1]。成熟蜂蜜是一種具有濃郁花香味的天然甜物質(zhì)，自古至今，因其具有較高的營養(yǎng)價(jià)值而被廣泛食用[2]。常溫下，蜂蜜為半透明的粘稠狀液體，低溫久存后，會(huì)出現(xiàn)部分結(jié)晶或全部結(jié)晶[3]。蜂蜜的結(jié)晶可能與其蜜源種類[4]、物質(zhì)組成[5]或熱力學(xué)特征[6]等密切相關(guān)。生產(chǎn)或評(píng)價(jià)不同結(jié)晶狀態(tài)的蜂蜜，不僅能夠?yàn)橄M(fèi)者提供特色鮮明的產(chǎn)品，而且有助于改進(jìn)生產(chǎn)工藝，為生產(chǎn)者創(chuàng)造更大的利潤。結(jié)晶蜂蜜和非結(jié)晶蜂蜜的化學(xué)組分較為相似，差別多集中在某些成分的物理狀態(tài)或含量的改變[6]，而蜂蜜的真實(shí)性評(píng)價(jià)對(duì)消費(fèi)者的知情權(quán)和企業(yè)的信譽(yù)度非常重要。從立法角度出發(fā)，眾多關(guān)于蜂蜜的質(zhì)量標(biāo)簽已經(jīng)建立，根據(jù)質(zhì)量標(biāo)簽要求，需規(guī)定每種產(chǎn)品的特殊狀態(tài)及重要物理特征[7-8]。從經(jīng)濟(jì)學(xué)的角度出發(fā)，生產(chǎn)消費(fèi)者接受度高的蜂蜜，如結(jié)晶蜂蜜或固體蜂蜜等，可進(jìn)一步提高產(chǎn)品的附加值。因此，如何科學(xué)闡明結(jié)晶蜂蜜的具體特征是一個(gè)技術(shù)問題，其基本要點(diǎn)為：利用某種技術(shù)手段準(zhǔn)確評(píng)價(jià)結(jié)晶狀態(tài)的蜂蜜，并保證其質(zhì)量穩(wěn)定。

目前，評(píng)價(jià)結(jié)晶狀態(tài)蜂蜜質(zhì)量常用的方法主要有3種。第1種是檢測(cè)某些特殊化學(xué)物質(zhì)的含量，其前提是假設(shè)這些物質(zhì)在某種蜂蜜中的含量比較固定。理論上講，針對(duì)多種目標(biāo)物質(zhì)的多因素分析方法可以將差異樣品從特定樣品組中分離出來[6,9]。然而，蜂蜜樣品因采集方式、儲(chǔ)存條件及加工技術(shù)等差異會(huì)導(dǎo)致這些目標(biāo)物質(zhì)的含量發(fā)生變化，進(jìn)而造成檢測(cè)結(jié)果異常[10-12]。并且，這種方法需要運(yùn)用化學(xué)計(jì)量法、主成分分析、線性判別分析或人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)分析等評(píng)價(jià)各組數(shù)據(jù)間的相似或差異程度，存在分析過程繁瑣、數(shù)據(jù)量大等缺陷。第2種方法是在特定狀態(tài)蜂蜜中尋找一種特殊標(biāo)記，可以是某種化學(xué)成分(如復(fù)合物、分子、核酸等)或形態(tài)成分(如植物細(xì)胞)以證明蜂蜜來源的真實(shí)性[13-14]。第3種方法是基于蜂蜜的整體信息，主要運(yùn)用物理分析技術(shù)檢測(cè)某種來源蜂蜜整體的物理化學(xué)特性，而非僅僅檢測(cè)一種物理化學(xué)指標(biāo)，比如pH、電導(dǎo)率、水分含量、灰分等[15-17]。差示掃描量熱法(differential scanning calorimetry, DSC)可以分析蜂蜜整體的熱動(dòng)力學(xué)特性，分析過程中，其熱力學(xué)和動(dòng)力學(xué)參數(shù)(如比熱容、反應(yīng)熱、轉(zhuǎn)變熱、相圖、反應(yīng)速率、結(jié)晶速率、高聚物結(jié)晶度、樣品純度等)會(huì)隨著加熱溫度或時(shí)間的變化而發(fā)生改變[18-19]。

目前，針對(duì)蜂蜜結(jié)晶的研究主要集中在如何生產(chǎn)結(jié)晶態(tài)蜂蜜及優(yōu)化其品質(zhì)。比如，自然結(jié)晶的蜂蜜分為液相和晶相。液相蜜含水量高于19%，晶相蜜含水量低于12%，使得液相蜜中容易繁殖酵母從而導(dǎo)致蜂蜜發(fā)酵和變質(zhì)[20]。利用人工干預(yù)的方法使蜂蜜完全結(jié)晶，可以使蜂蜜中的水分均勻分布，有利于運(yùn)輸和貯存，并保持蜂蜜成分穩(wěn)定和天然香味[21]。再者，蜂蜜的成分主要包括單糖、水分、酶類和維生素。單糖占大部分，其中葡萄糖占26%～43%，果糖占32%～46%，蜂蜜中的葡萄糖含量是引起蜂蜜結(jié)晶的主要因素。蜂蜜結(jié)晶是葡萄糖圍繞結(jié)晶核形成顆粒，并在顆粒周圍包上一層果糖、蔗糖或糊精的膜，逐漸聚結(jié)擴(kuò)展，而使整個(gè)容器中的蜂蜜部分或全部形成松散的固態(tài)狀，即蜂蜜結(jié)晶[22]。因此，蜂蜜結(jié)晶是一種正?，F(xiàn)象，對(duì)其組成成分和應(yīng)用價(jià)值沒有影響。區(qū)別于以往研究，本研究重點(diǎn)研究了蜂蜜結(jié)晶前后的物理化學(xué)特性及DSC技術(shù)在蜂蜜檢測(cè)方面的優(yōu)勢(shì)，通過對(duì)不同蜜源、不同結(jié)晶狀態(tài)蜂蜜的物質(zhì)組成進(jìn)行分析，再利用DSC技術(shù)研究其熱力學(xué)特征，以期實(shí)現(xiàn)對(duì)不同蜜源或不同結(jié)晶狀態(tài)蜂蜜特征和質(zhì)量的科學(xué)評(píng)價(jià)。

1 材料與方法

1.1 蜂蜜樣品及蜜源信息

蜂蜜樣品采自我國相應(yīng)蜜源主產(chǎn)區(qū)的意大利蜜蜂(Apismelliferaligustica)蜂場(chǎng)，包括2種蜜源、2種狀態(tài)的蜂蜜樣品(表1)。其中，樣品編號(hào)根據(jù)蜂蜜的蜜源植物簡(jiǎn)寫，具體為結(jié)晶椴樹蜂蜜(DG)、非結(jié)晶椴樹蜂蜜(DY)、結(jié)晶洋槐蜂蜜(YG)、非結(jié)晶洋槐蜂蜜(YY)。所有樣品均為蜜源植物開花流蜜季節(jié)中期采集的封蓋蜜，采樣時(shí)間為2017年5—7月。每個(gè)采樣地點(diǎn)一般聚集有10個(gè)以上的養(yǎng)蜂戶，且各自之間的距離超過5 km，養(yǎng)殖規(guī)模一般為100群左右。每種蜂蜜樣品從3個(gè)蜂場(chǎng)平行采集3次，共計(jì)12個(gè)樣品，各樣品采樣量為50 g。非結(jié)晶態(tài)蜂蜜4 ℃下密封保存，結(jié)晶態(tài)蜂蜜的處理方式為14 ℃儲(chǔ)存6個(gè)月以上，取完全結(jié)晶蜂蜜作為樣品。蜂蜜樣品蜜源信息的確認(rèn)，主要依靠采訪養(yǎng)蜂戶、調(diào)查采樣點(diǎn)蜜源植物種類及專業(yè)人員的感官鑒別等。

表1 蜂蜜樣品信息

1.2 水分含量測(cè)定

利用阿貝折射儀(AR12, Germany Schmidt+Haemsch股份有限公司)測(cè)定樣品的含水量。首先于20 ℃條件下測(cè)定樣品的折光率[23]，再利用Wedmore[24]提出的換算表格進(jìn)行含水量換算。每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3次。

1.3 水分活度測(cè)定

利用水分活度儀(LabMaster-aw, Swiss Novasina股份有限公司)測(cè)定樣品的水分活度(water activity, Aw)。首先在溫度18～25 ℃、濕度50%～80%的條件下，利用飽和NaCl溶液對(duì)水分活度儀進(jìn)行校正。然后，稱取5 g(精確至0.01 g)樣品放入樣品皿，進(jìn)行水分活度測(cè)定。每隔5 min記錄一次水分活度儀的響應(yīng)值，當(dāng)相鄰兩次響應(yīng)值之差小于0.005時(shí)，即為測(cè)定值。每進(jìn)行一次測(cè)定后，需進(jìn)行重新校對(duì)，同一樣品重復(fù)測(cè)定3次。

1.4 葡萄糖和果糖含量測(cè)定[25]

1.4.1標(biāo)準(zhǔn)溶液配制 標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液：分別稱取葡萄糖、果糖標(biāo)準(zhǔn)品1、4、5 g(精確到0.000 1 g)，放入100 mL容量瓶中，加入60 mL水溶解，乙腈(色譜純)定容，搖勻。

標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：吸取不同體積的葡萄糖、果糖標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液到100 mL容量瓶中，用乙腈和水混合液(體積比40：60)稀釋，配成不同濃度的葡萄糖、果糖標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，用于繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。

1.4.2試樣制備 對(duì)于非結(jié)晶樣品，用干凈玻璃棒攪拌均勻。對(duì)于結(jié)晶樣品，在密閉情況下，置于不超過60 ℃的水浴中溫浴、震蕩，當(dāng)樣品全部融化后攪勻，冷卻至室溫。

1.4.3稱量提取 稱取試樣5 g(精確至0.000 1 g)，置于100 mL燒杯中，加入30 mL水，用玻璃棒攪拌至試樣完全溶解。轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，乙腈定容，搖勻(同時(shí)制作2個(gè)平行樣及試劑空白樣)。靜置片刻后，用孔徑0.45 μm濾膜過濾，向液相色譜(配有示差折光檢測(cè)器)進(jìn)樣。

1.4.4液相色譜測(cè)定 利用流動(dòng)相(乙腈∶水=70∶30，使用前用孔徑0.45 μm濾膜過濾，超聲脫氣)穩(wěn)定2 h后，調(diào)節(jié)儀器平衡，基線及示差檢測(cè)器顯示數(shù)字波動(dòng)較小時(shí)，即可上樣測(cè)定。

色譜柱：Kromsil氨基柱，4.6 μm×250 mm；流速1 mL·min-1；示差折光檢測(cè)器溫度30 ℃；進(jìn)樣量10 μL。

1.5 DSC測(cè)定

采用功能補(bǔ)償型DSC(Perkin-Elmer股份有限公司)進(jìn)行樣品分析。試驗(yàn)前需利用銦和鋅溶液標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行DSC溫度和功率的校準(zhǔn)，采用空坩堝進(jìn)行基線掃描，儀器的加熱或降溫程序在持續(xù)的氮?dú)鈿夥罩羞M(jìn)行。樣品量為5～10 mg，密封在鋁制坩堝(容積為100 μL)中，加熱速率為5 ℃·min-1，樣品的升溫范圍為-80～150 ℃，溫度變化幅度為±1 ℃。

1.6 數(shù)據(jù)分析

利用SPSS 18.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。對(duì)不同樣品的水分含量、水分活度、葡萄糖和果糖含量及熱力學(xué)指標(biāo)等數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)對(duì)不同樣品的相應(yīng)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異性比較，利用Bivaruate correlation方法進(jìn)行相關(guān)性分析。采用Origin 8.5繪制數(shù)據(jù)圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 蜂蜜樣品中水分和糖分的組成

蜂蜜樣品中果糖含量、葡萄糖含量、水分含量和水分活度分析結(jié)果見圖1。在果糖和葡萄糖含量方面，蜜源的影響比結(jié)晶狀態(tài)更加顯著。同一蜜源的果糖和葡萄糖含量沒有顯著差異；但是，無論是結(jié)晶態(tài)還是非結(jié)晶態(tài)，洋槐蜂蜜和椴樹蜂蜜之間均存在顯著差異(P<0.05)。洋槐蜂蜜的果糖含量明顯高于椴樹蜂蜜(P<0.05)，而洋槐蜂蜜的葡萄糖含量則明顯低于椴樹蜂蜜(P<0.05)。然而，不同蜜源或不同結(jié)晶狀態(tài)的蜂蜜樣品，在水分含量和水分活度2個(gè)指標(biāo)上均沒有顯著差異。由于蜂蜜在水分活度低于0.6的情況下，不利于酵母菌的生長(zhǎng)[23]，因此相比椴樹蜜，洋槐蜜的水分活度可能更不利于酵母菌滋生。

注：不同小寫字母表示差異在P<0.05水平具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2 蜂蜜樣品DSC曲線分析

由圖2可以看出，在-80～150 ℃的變化范圍內(nèi)，同種結(jié)晶狀態(tài)蜂蜜(不同蜜源)的DSC曲線較為相似，主要差別為玻璃轉(zhuǎn)化溫度(glass transition temperature, Tg)、放熱峰峰溫(endothermic peak temperature, Tpk)和放熱峰大小等，但是差別較小。無論是非結(jié)晶態(tài)，還是非結(jié)晶態(tài)，洋槐蜜的Tg均低于椴樹蜜，而洋槐蜜的Tpk均高于椴樹蜜。同種蜜源蜂蜜(不同結(jié)晶狀態(tài))的DSC曲線則差異顯著，如Tg、Tpk、放熱峰大小和形狀均表現(xiàn)出了明顯差別。

注：Tg為玻璃轉(zhuǎn)化溫度，Tpk為放熱峰峰溫。

2.3 蜂蜜樣品DSC參數(shù)分析

DSC試驗(yàn)中主要選取了差別較為明顯的參數(shù)進(jìn)行分析，包括Tg、Tpk和放熱峰焓變(endothermic peak enthalpy change,ΔH)。由圖3可以看出，同種結(jié)晶狀態(tài)蜂蜜的ΔH沒有差別，而不同結(jié)晶狀態(tài)蜂蜜的ΔH差異顯著(P<0.05)。同種結(jié)晶態(tài)蜂蜜YG和DG的Tg差異顯著(P<0.05)，而YY和DY的Tg沒有差別，不同結(jié)晶態(tài)蜂蜜Tg之間的差異顯著(P<0.05)；同種結(jié)晶態(tài)蜂蜜YY和DY的Tpk差異顯著(P<0.05)，而YG和DG的Tpk沒有差別，不同結(jié)晶態(tài)蜂蜜的Tpk差異顯著(P<0.05)。結(jié)果說明，Tg、Tpk和ΔH對(duì)于區(qū)分不同蜂蜜樣品較為靈敏。以Tg、Tpk和放熱焓變?chǔ)作為坐標(biāo)軸繪制三維坐標(biāo)圖(圖4)，可以看出，同種結(jié)晶狀態(tài)蜂蜜樣品的熱力學(xué)性質(zhì)較為相似，與蜂蜜的蜜源關(guān)系不大。

注：不同小寫字母表示差異在P<0.05水平具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖4 基于DSC參數(shù)的不同蜂蜜樣品的相似性分析

2.4 蜂蜜樣品物質(zhì)組成和熱力學(xué)參數(shù)的相關(guān)性分析

表2可以看出，ΔH與Tpk(r=-0.983,P<0.05)、Tg與Tpk(r=-0.986,P<0.05)呈顯著負(fù)相關(guān)；ΔH與Tg(r=0.966,P<0.05)呈顯著正相關(guān)；其余各熱力學(xué)參數(shù)之間或熱力學(xué)與物質(zhì)之間沒有表現(xiàn)出明顯的相關(guān)性。結(jié)果表明，蜂蜜的物質(zhì)組成與其熱力學(xué)參數(shù)沒有明顯的相關(guān)性，即蜂蜜的蜜源特征可能對(duì)其熱力學(xué)性質(zhì)影響不大。

表2 蜂蜜樣品物質(zhì)組成和熱力學(xué)參數(shù)的相關(guān)性分析

3 討論

本研究以不同蜜源和不同結(jié)晶狀態(tài)蜂蜜作為試驗(yàn)材料，探討了其物質(zhì)組成和熱力學(xué)特征及其之間的相互關(guān)系。有研究認(rèn)為，蜂蜜的水分活度會(huì)隨著結(jié)晶程度的加深而增高[16,26-27]。比如，Gleiter等[16]研究認(rèn)為，結(jié)晶蜂蜜的水分活度普遍高于液體蜂蜜。本研究也出現(xiàn)相似趨勢(shì)，但是變化不明顯，分析原因，可能是本研究中所選取蜂蜜樣品的水分含量本身較低及蜂蜜結(jié)晶程度不足所致。隨著蜂蜜結(jié)晶程度加深，其水分活度隨之增高，很容易超過酵母菌生長(zhǎng)的閾值(水分活度約為0.6)，形成利于酵母菌滋生的環(huán)境[26]。這種現(xiàn)象也在其他食品研究中得到了證實(shí)，比如奶酪、牛奶等均會(huì)由于過高的水分活度導(dǎo)致酵母菌發(fā)酵變質(zhì)[28]。所以，結(jié)晶或半結(jié)晶狀態(tài)的蜂蜜更加適宜酵母菌的生長(zhǎng)而產(chǎn)生發(fā)酵現(xiàn)象[29]。隨著食品檢測(cè)技術(shù)的進(jìn)步，蜂蜜的水分活度測(cè)定變得更加便捷和快速，所以，若將其作為蜂蜜微生物的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，替代原有的微生物培養(yǎng)檢測(cè)法，將大大提高檢測(cè)的時(shí)效性。并且，通過控制蜂蜜(包括液態(tài)蜂蜜和固態(tài)結(jié)晶蜂蜜)的水分活度，可以更有效地延長(zhǎng)商品的貨架期。

高分子理論認(rèn)為，高分子的結(jié)構(gòu)和性能方面存在著一定的聯(lián)系，非晶態(tài)的高聚物從玻璃態(tài)到橡膠態(tài)存在著玻璃化轉(zhuǎn)變，這時(shí)高聚物的性質(zhì)會(huì)發(fā)生急劇變化[30]。蜂蜜主要為葡萄糖和果糖形成的復(fù)雜體系，且葡萄糖易形成水合葡萄糖，具有玻璃態(tài)向橡膠態(tài)轉(zhuǎn)變的趨勢(shì)，因此存在著玻璃轉(zhuǎn)化現(xiàn)象[17,31]。本研究也發(fā)現(xiàn)，無論是非結(jié)晶態(tài)還結(jié)晶態(tài)蜂蜜，均存在明顯的玻璃轉(zhuǎn)化溫度，而且蜜源或結(jié)晶狀態(tài)的變化均會(huì)引起玻璃轉(zhuǎn)化溫度的改變。與玻璃轉(zhuǎn)化溫度相似，放熱峰焓變和放熱峰峰溫也在不同蜜源或結(jié)晶態(tài)的蜂蜜樣品間，存在明顯差異。相似性分析和相關(guān)性分析結(jié)果均表明，蜂蜜的熱力學(xué)參數(shù)與其結(jié)晶狀態(tài)相關(guān)，而與物質(zhì)組成(蜜源)關(guān)系不大。不同結(jié)晶狀態(tài)的蜂蜜之間存在明顯的熱力學(xué)參數(shù)的差異。Venir等[31]研究認(rèn)為，不同意大利Tarassaco蜂蜜樣品的熱力學(xué)參數(shù)因結(jié)晶狀態(tài)的不同而差異明顯。故通過檢測(cè)蜂蜜樣品的熱力學(xué)參數(shù)，可以有效評(píng)價(jià)蜂蜜的結(jié)晶程度，這種方法可能在蜂蜜的加工儲(chǔ)藏過程中起到重要作用。

綜上所述，本研究認(rèn)為蜂蜜的水分活度與結(jié)晶程度和水分含量有關(guān)，通過監(jiān)測(cè)蜂蜜的水分活度有助于控制微生物(尤其是酵母菌)的滋生。蜂蜜熱力學(xué)參數(shù)與其結(jié)晶狀態(tài)有關(guān)，可通過測(cè)定蜂蜜的玻璃轉(zhuǎn)化溫度、放熱峰峰溫和放熱峰焓變等指標(biāo)，預(yù)測(cè)蜂蜜的結(jié)晶程度?？傊?，熱力學(xué)參數(shù)結(jié)合水分活度等指標(biāo)，可以判斷、預(yù)測(cè)蜂蜜的貨架期和貯藏期，幫助擇定有效的蜂蜜加工與貯藏條件等。