蠶豆幼苗內(nèi)生固氮菌促生長(zhǎng)特性的研究

王新南, 羅家豪, 郝俊杰, 張曉艷, 劉璐,付麗平, 王家林, 韓燕紅, 劉全蘭*

(1.青島科技大學(xué)海洋科學(xué)與生物工程學(xué)院, 山東 青島 266042; 2.青島市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院, 山東 青島 266100; 3.青島市黃島區(qū)農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣站, 山東 青島 266400)

蠶豆(faba bean,ViciafabaL.)又稱羅漢豆、胡豆、蘭花豆等，是一種糧、菜、肥兼用型豆科作物[1]，其在我國(guó)已有2 000余年栽培歷史，種植面積廣闊。豆科作物內(nèi)生固氮根瘤菌，蠶豆也被期望含有豐富的內(nèi)生固氮菌。熊惠洋[2]采集了我國(guó)三大蠶豆種植生態(tài)區(qū)(東部生態(tài)區(qū)、西南生態(tài)區(qū)、西北生態(tài)區(qū))的44個(gè)樣點(diǎn)里的蠶豆根瘤及土樣，蠶豆根瘤里共分離純化出6種和蠶豆結(jié)瘤的根瘤菌，分別是4個(gè)已知種(Rhizobiumleguminosarum、R.laguerreae、R.pisi/R.fabae、R.anhuiesnse)和2個(gè)未知種(R.sp.1、R.sp.2)。Sa?di等[3]從蠶豆根瘤中分離了104株內(nèi)生固氮菌，它們分屬于根瘤菌屬(Rhizobiumsp.)、劍菌屬(Ensifersp.)、芽孢桿菌屬(Bacillussp.)、假單胞菌屬(Pseudomonassp.)、拉恩氏菌屬(Rahnellasp.)、泛菌屬(Pantoeasp.)、黃單胞菌屬(Xanthomonassp.)和申氏桿菌屬(Shinellasp.)等。固氮螺菌屬(Azospirillumspp.)和固氮菌屬(Azotobacterspp.)也是被分離報(bào)道的植物內(nèi)生固氮菌，并廣泛的應(yīng)用于生物肥料[4-6]。類芽孢桿菌屬(Paenibacillussp.)是從落地生根[6]、野生稻[7-8]和水稻[9]中分離被報(bào)道的內(nèi)生固氮菌;克雷伯氏菌屬(Klebsiellaspp.)是從野生稻、水稻、甘蔗、玉米等植物中獲得的內(nèi)生固氮菌[10-12],說明這些屬在植物體內(nèi)生固氮菌中是易分離得到的優(yōu)勢(shì)菌群。已有研究表明，內(nèi)生固氮菌促生機(jī)制包括菌株的固氮、溶磷溶鉀、產(chǎn)植物生長(zhǎng)素等特性。黃靜等[13]從油菜(匯油50)和玉米(登海11)中分離的 32 內(nèi)生菌均株具穩(wěn)定的溶磷能力，并研究了這些菌株形成吲哚乙酸、鐵載體、1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸脫氨酶等的能力。Chimwamurombe等[14]從Marama豆苗期根和新枝中分離獲得了73株內(nèi)生菌，測(cè)定了它們的促生長(zhǎng)特性，如1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸脫氨酶、1,3-β-D-葡聚糖內(nèi)切酶、蛋白酶、固氮酶、吲哚乙酸、鐵載體、N-?；?高絲氨酸內(nèi)酯、溶磷鉀等的活性。本文從蠶豆幼苗葉和根中分離了內(nèi)生固氮菌，同時(shí)探究了它們的促生長(zhǎng)特性，為今后深入而廣泛地研究蠶豆的內(nèi)生固氮菌并應(yīng)用于蠶豆生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

蠶豆種子(日本大白皮，編號(hào)S18P23；啟豆2號(hào)，編號(hào)S18P24)由青島市農(nóng)業(yè)科學(xué)院張曉艷課題組提供。2018年3月，在青島市農(nóng)業(yè)科學(xué)院塑料大棚用花盆進(jìn)行播種，花盆內(nèi)部直徑35 cm，高75 cm，花盆內(nèi)土(pindstrup泥炭，丹麥)高度為70 cm。種子出苗后20 d拔出蠶豆苗，自來水沖洗根上的土，包裝于自封袋中于-20 ℃冰箱中待用。

1.2 培養(yǎng)基

內(nèi)生固氮菌分離純化所用培養(yǎng)基為Ashby和YMA培養(yǎng)基，內(nèi)生固氮菌生理生化測(cè)定用無(wú)機(jī)磷培養(yǎng)基、卵黃板培養(yǎng)基、硅酸鹽培養(yǎng)基、羥基纖維素鈉培養(yǎng)基、果膠篩選培養(yǎng)基。培養(yǎng)基溶解混勻后分裝于 250 mL錐形 中，121℃滅菌 20 min。

Ashby篩選培養(yǎng)基(1 L)：KH2PO40.2 g、CaCO35 g、MgSO4·7H2O 0.2 g、甘露醇 10.0 g、NaC1 0.2 g、CaSO4·2H2O 0.1 g、瓊脂 18.0 g、pH(7.0±0.2)。

YMA培養(yǎng)基的成分(1 L)：甘露醇10.0 g、酵母粉1.0 g、K2HP040.5 g、MgSO4·7H2O 0.2 g、NaC1 0.1 g、CaSO40.2 g、Rh微量元素液(H3BO35.0 g·L-1、Na2MnO45.0 g·L-1)4 mL，pH 6.8～7.0。

無(wú)機(jī)磷培養(yǎng)基(1 L)：葡萄糖10.0 g、(NH4)2SO40.5 g、NaCl 0.2 g、KCl 0.2 g、MgSO4·7H2O 0.03 g、FeSO4·7H2O 0.003 g、MnSO4·4H2O 0.03 g、酵母提取物0.5 g、磷酸鈣5.0 g、瓊脂18.0 g、蒸餾水1 000 mL；pH 7.0。

卵黃(有機(jī)磷)培養(yǎng)基(1 L)：葡萄糖10.0 g、(NH4)2SO40.5 g、MgSO4·7H2O 0.03 g、NaC1 0.3 g、KC1 0.3 g、FeSO4·7H2O 0.36 g、MnSO4·4 H2O 0.03 g、CaCO35.0 g、瓊脂18.0 g；溶蒸餾水1 000 mL；加熱溶化后分裝于 250 mL錐形 中，于121 ℃滅菌 20 min；冷卻至50 ℃后，立即加入滅菌的卵黃液，每100 mL的基礎(chǔ)培養(yǎng)基加卵黃稀釋液3 mL作為有機(jī)磷源，混勻后分裝于培養(yǎng)皿內(nèi)凝成平板。卵黃稀釋液是用酒精擦凈新鮮雞蛋外殼，輕輕打破雞蛋一端，去除蛋清后將蛋黃加入已滅菌的錐形瓶中，加等量的無(wú)菌水，搖勻后用滅菌注射器過濾而成。

硅酸鹽培養(yǎng)基(1 L)：蔗糖10.0 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、酵母膏0.5 g、Na2HPO41.0 g、(NH4)2SO41.0 g、CaCO31.0 g、鉀長(zhǎng)石粉(過120目篩，蒸餾水浸泡 3 d以洗去水溶性鉀)1.0 g、瓊脂粉 18.0 g。

明膠培養(yǎng)基的成分(1 L)：牛肉浸膏3.0 g、蛋白胨5.0 g、明膠120.0 g、pH 7.0，加熱融化后，取4 mL培養(yǎng)液分裝到10 mL的試管中。

羥基纖維素鈉培養(yǎng)基(1 L)：羥基纖維素鈉10.0 g、(NH4)2SO44.0 g、KH2P042.0 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、蛋白胨l.0 g、瓊脂16.0 g。

果膠篩選培養(yǎng)基(1 L)：果膠0.2 g、KH2P040.1 g、MgSO4·7H2O 0.05 g、NaN030.3 g、FeS040.001 g、瓊脂2.0 g、pH 5.0。果膠為Sigma公司產(chǎn)品，從柑桔皮中提取的高酯果膠，甲氧基含量 9.3%，半乳糖醛酸含量 84.0%。

1.3 蠶豆內(nèi)生菌分離純化

將蠶豆幼苗的葉子和根用無(wú)菌水沖洗干凈，70%酒精浸泡3 min，再用無(wú)菌水沖洗5～7次。取滅菌后的葉和根在培養(yǎng)基上涂抹1次，28 ℃ 培養(yǎng)5 d，以檢查滅菌效果。用無(wú)菌保鮮膜將滅菌后的葉和根包裹并破碎，加1 mL生理鹽水進(jìn)行稀釋，漩渦震蕩1 min。取100 μL稀釋混懸液涂布于Ashby培養(yǎng)基，28 ℃倒置培養(yǎng)48 h，挑取單菌落在固體平板上進(jìn)行多次劃線，得到純化菌株。

1.4 菌株促植物生長(zhǎng)特性測(cè)定

活化的供試菌株按10%接種量接種到Ashby培養(yǎng)基中，置于30 ℃搖床，恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，取1 mL培養(yǎng)液于600 nm處測(cè)吸光值，OD600為0.2時(shí)進(jìn)行測(cè)試。無(wú)菌水制成濃度為107CFU·mL-1的菌懸液，吸取10 μL菌懸液注入到篩選平板的孔徑中間，于28 ℃細(xì)菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，觀察有無(wú)透明圈或混濁圈的生成，測(cè)定透明圈或混濁圈直徑(L)和菌落直徑(D)。固體培養(yǎng)基中注入菌液的孔徑為0.6 cm。

1.4.1菌株溶磷和鉀性狀測(cè)定 分別將菌液接種到無(wú)機(jī)磷培養(yǎng)基、卵黃板培養(yǎng)基、硅酸鹽培養(yǎng)基的孔中，置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)1、3、7 d，觀察培養(yǎng)基上透明環(huán)的形成及大??；7 d后，用直尺測(cè)定菌落和水解圈的直徑，根據(jù)水解圈與菌落圈的直徑比來判斷該菌株溶無(wú)機(jī)磷、有機(jī)磷和鉀能力。

1.4.2菌株液化明膠的測(cè)定 將菌液接種到明膠培養(yǎng)基的孔中，置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)7 d，觀察試管中的明膠狀態(tài)，判斷菌株是否有液化明膠的能力。有些明膠液化現(xiàn)象不明顯，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后再次冷凍，重新觀察結(jié)果。

1.4.3菌株產(chǎn)纖維素酶能力的測(cè)定 將菌株接種到羥基纖維素鈉培養(yǎng)基的孔中，置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)3 d，用質(zhì)量濃度為1 g·L-1的剛果紅溶液染色30 min，蒸餾水沖洗，用1 mol·L-1氯化鈉溶液進(jìn)行脫色，觀察培養(yǎng)基上透明圈形成及大小，根據(jù)水解圈與菌落圈的直徑比來判斷該菌株產(chǎn)纖維素酶能力。

1.4.4菌株產(chǎn)果膠酶能力的測(cè)定 將菌株接種到果膠酶培養(yǎng)基的孔中，置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)3 d，用質(zhì)量濃度為1%的CTAB溶液染色10 min，觀察培養(yǎng)基上有無(wú)透明圈形成及大小，根據(jù)菌落和水解圈的直徑比判斷該菌株產(chǎn)果膠酶能力。

1.4.5菌株固氮酶活性的測(cè)定 按照戴治家[15]方法測(cè)定菌株固氮酶活。取培養(yǎng)到對(duì)數(shù)期的1 mL菌液于13 mL西林瓶中，加橡膠塞，用注射器抽取西林瓶?jī)?nèi)1 mL空氣，再注入1 mL純度為99.99%的乙炔，28 ℃培養(yǎng)24 h。用注射器注入2 mL飽和氯化鈉溶液，抽取200 μL氣體(氣體濃度為10%)，注入配制好的乙炔吸收液中，震蕩5 min，在548 nm處比色法測(cè)定其吸收值。每個(gè)樣品測(cè)定3個(gè)重復(fù)，取平均值進(jìn)行分析。

標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：按照上述測(cè)定步驟，用空白培養(yǎng)基代替菌液，給盛有吸收液的5個(gè)瓶中，分別依次注入標(biāo)準(zhǔn)乙炔50、100、150、200和250 μL，進(jìn)行比色，記錄光密度，以O(shè)D值為縱坐標(biāo)、乙炔含量為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

乙炔吸收液：稱取 5.0 g 硝酸銅置 于 1 000 mL 容量瓶中, 加入200 mL蒸餾水使其溶解, 加入 10%的氨水溶液(氨量為5.3 g), 然后加入溶于380 mL蒸餾水中的23.0 g 鹽酸羥胺溶液, 45 mL 2 %白明膠溶液和 33 mL 95%乙醇,混勻，加蒸餾水至標(biāo)線充分搖勻, 放試劑瓶中備用。

內(nèi)生固氮菌固氮酶活性以產(chǎn)生C2H4的濃度進(jìn)行計(jì)算[15-16]。

固氮酶的活性(μmol C2H4·mL-1·h-1)=(V×C×c×n)/Vb×t

V=VO-Vt

c=[273/(273+t)]×(Pt/1×105)

式中,V為乙炔C2H2被還原形成乙烯C2H4的體積(μL)；C為理想狀態(tài)下氣體的濃度，0.045 mol·L-1;c為測(cè)定時(shí)的室內(nèi)溫度和大氣壓的修正系數(shù)，本研究測(cè)定溫度為25 ℃，大氣壓Pt為1×105Pa，c= 0.916；n為 C2H2氣體的稀釋倍數(shù)，本研究西林瓶的容積是13 mL，注入1 mL菌液和2 mL飽和氯化鈉溶液后的容積為10 mL，1 mL C2H2的稀釋倍數(shù)是500；Vb為菌液的體積，為1 mL；t為菌株的培養(yǎng)時(shí)間，為24 h；VO為注入吸收液的標(biāo)準(zhǔn)乙炔氣的體積(μL)；Vt為未被還原的乙炔體積,從標(biāo)準(zhǔn)曲線查得(μL)。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離純化結(jié)果

蠶豆幼苗葉和根經(jīng)過兩次分離純化以后，得到菌落形態(tài)不同的內(nèi)生固氮菌株共8株，其中葉中分離出6株，分別為SL23-2、SL23-3、SL24-1、SL24-2、SL24-3、SL24-5；根中分離出兩株，分別為SR23-1、SR24-1。單菌落形態(tài)為圓形，不透明，菌落周圍有分泌物。

2.2 蠶豆內(nèi)生固氮菌的理化性質(zhì)分析

篩選到的菌株分別培養(yǎng)在理化性狀測(cè)定培養(yǎng)基上，觀察抑菌圈的行成及直徑大小，并比較分析不同菌株的活性能力，結(jié)果如表1所示。

2.2.1蠶豆內(nèi)生固氮菌溶解無(wú)機(jī)磷和有機(jī)磷的特征 根據(jù)溶解無(wú)機(jī)磷的試驗(yàn)結(jié)果，有7株菌產(chǎn)生透明圈，僅SL24-3菌株不形成溶解無(wú)機(jī)磷的透明圈。在形成溶磷透明圈的菌株中，SL24-1、SL24-2、SL24-5、SR23-1的解磷能力較強(qiáng)，產(chǎn)生的解磷圈直徑均超過2 cm。沒有分離到溶解有機(jī)磷的菌株。結(jié)果表明，分離到的蠶豆內(nèi)生菌溶解無(wú)機(jī)磷的效果顯著，對(duì)于有機(jī)磷沒有溶解能力(表1)。

表1 蠶豆苗期葉和根中內(nèi)生固氮細(xì)菌促植物生長(zhǎng)理化指標(biāo)的測(cè)定

SR23-1菌株在溶磷培養(yǎng)基上形成的透明圈與菌落圈的直徑比最大(4.78)，說明其對(duì)Ca3(PO4)2溶解效果最好，其次為SL24-1菌株(4.05)。其原因可能是SR23-1菌株產(chǎn)生的酸多，pH下降快，使Ca3(PO4)2中更多的磷溶解出來。已有研究表明，有機(jī)酸能夠螯合金屬離子，釋放難溶的磷；不同的有機(jī)酸對(duì)金屬離子的親和性不同[13]。因此，在投入土壤環(huán)境前，應(yīng)進(jìn)一步測(cè)定SR23-1菌株的溶磷機(jī)制，測(cè)定溶磷物質(zhì)與土壤特征的匹配度，這樣將有利于土壤中磷元素的釋放，將促進(jìn)植物對(duì)土壤養(yǎng)分的充分吸收并將提高植物生物量。

2.2.2蠶豆內(nèi)生固氮菌溶解鉀的特征 從苗期蠶豆葉和根中分離的內(nèi)生菌中僅有SL23-2和SR23-1兩株菌有解鉀的能力，解鉀圈與菌落圈的直徑比均在2.50左右(表1)，結(jié)合這兩株菌形成的溶磷圈比值(2.17和4.78)，暗示這兩株菌可以為蠶豆種植提供磷元素和鉀元素。

2.2.3蠶豆內(nèi)生固氮菌液化明膠的特征 菌株液化明膠試驗(yàn)是用于分析某些細(xì)菌可產(chǎn)生一種胞外酶——明膠酶的能力，該酶能使明膠等膠原物質(zhì)分解為多肽再進(jìn)一步分解成氨基酸，從而使明膠失去凝固力，使明膠固體培養(yǎng)基具有流動(dòng)的特征。本研究從蠶豆中分離的內(nèi)生菌僅SL24-2菌株有溶明膠的能力，其他菌株均無(wú)溶明膠能力(表1)。

2.2.4蠶豆內(nèi)生固氮菌降解纖維素的特征 根據(jù)剛果紅染料在羥基纖維素鈉培養(yǎng)基上褪色的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，具有纖維素酶活性的菌株共有4株SL23-2、SL23-3、SL24-3、SR24-1。降解纖維素的溶解圈直徑平均在3.5 cm左右，說明這四株菌具有較強(qiáng)的纖維素酶分泌能力。SL23-3菌株在羥基纖維素鈉培養(yǎng)基上形成的褪色透明圈與菌落圈的直徑比值為最大(6.12)，說明其對(duì)羥基纖維素鈉溶解效果最好，其次為SR24-1菌株(6.00)；這兩株菌對(duì)無(wú)機(jī)磷還有一定的溶解效果，表明這兩株菌在秸稈降解和農(nóng)田溶磷中有一定作用。

2.2.5蠶豆內(nèi)生固氮菌降解果膠的特征 在篩選分離的菌株中，具有果膠酶活性的菌株有兩株SL24-1、SL24-3。果膠降解圈的大小為3.00 cm左右。SL24-1菌株在果膠培養(yǎng)基上形成的透明圈與菌落圈的直徑比為5.88，SL24-3菌株在果膠培養(yǎng)基上形成的透明圈與菌落圈的直徑比為3.95(表1)。SL24-1菌株還有溶解無(wú)機(jī)磷的能力，SL24-3菌株還有溶解纖維素的能力，說明這兩株菌具有多種促生長(zhǎng)能力(表 1)。

2.3 蠶豆內(nèi)生固氮菌的固氮酶活性

2.3.1乙炔含量標(biāo)線的繪制 乙炔分子中的氫原子易被銀、亞銅、亞汞及汞等金屬離子所取代，生成帶色的金屬炔化物，這是乙炔分子的特異反應(yīng), 乙烯(烯烴)無(wú)此反應(yīng)。將1 mL乙炔氣注入已抽取完1 mL空氣的密閉的西林瓶中，含一價(jià)銅鹽的氨溶液的吸收液與乙炔相互作用后將生成乙炔銅, 使溶液顯紫紅色，乙炔銅經(jīng)分光光度計(jì)可得到數(shù)值，標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。

圖1 乙炔含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3.2蠶豆苗期內(nèi)生固氮菌的固氮能力 8株固氮細(xì)菌的固氮酶活性如圖2所示。固氮細(xì)菌的固氮酶活性差異較大，SL24-3菌株的固氮酶活性最高，為12.79 μmol C2H4·mL-1·h-1；SL24-2菌株的固氮酶活性次之，為11.79 μmol C2H4·mL-1·h-1。SL24-3菌株還有溶解纖維素和果膠的能力，說明這種菌在蠶豆的生長(zhǎng)發(fā)育中發(fā)揮著多重效果；SL24-2菌株還有溶無(wú)機(jī)磷的能力，這說明該菌株對(duì)蠶豆生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)供給發(fā)揮著作用。

圖2 8株內(nèi)生固氮菌的固氮酶活性

3 討論

近年來研究表明，宿主植物與其內(nèi)生菌之間具有緊密聯(lián)系，不同的宿主植物具有不同的內(nèi)生菌生態(tài)系統(tǒng)；同種植物在不同的生活環(huán)境下，內(nèi)生菌種類也會(huì)出現(xiàn)明顯變化；植物不同部位間，內(nèi)生菌的種類和豐度也具有顯著差異，這反映出不同內(nèi)生菌對(duì)宿主植物的組織差異性和專一性[17]。陽(yáng)潔等[18]從藥用稻中篩選到4株具有高效溶磷解鉀能力的內(nèi)生固氮菌，其固氮酶活性在8.78～8.88 μmol C2H4·mL-1·h-1之間，代表菌株yy01溶磷圈(L/D)為2.92,溶鉀圈(L/D)為4.13。本研究在蠶豆苗期的根和葉中分離獲得8株固氮菌，它們的固氮酶活為8.38～12.79 μmol C2H4·mL-1·h-1，其中SL24-3菌株的固氮酶活最高(12.79 μmol C2H4·mL-1·h-1)，SL24-2菌株的固氮酶活性次之(11.79 μmol C2H4·mL-1·h-1)，表明這兩株菌有較好的固氮能力。本研究還發(fā)現(xiàn)4株菌株的溶磷能力強(qiáng)，SL24-1的溶磷圈(L/D)為4.05，SL24-2的溶磷圈(L/D)為4.04, SL24-5的溶磷圈(L/D)為3.62，SR23-1的溶磷圈(L/D)為4.78。這些結(jié)果說明蠶豆苗期內(nèi)的內(nèi)生固氮菌具有多樣性的促植物生長(zhǎng)特征。

細(xì)胞的生長(zhǎng)是植物個(gè)體生長(zhǎng)發(fā)育及形態(tài)建成的重要環(huán)節(jié)，需要一系列酶降解細(xì)胞壁的多聚糖以松弛胞壁，需要新的胞壁成份的添加、組裝和交聯(lián)。參與細(xì)胞壁降解的酶主要是纖維素酶和果膠酶，參與細(xì)胞壁合成的酶主要是過氧化物酶，這三類酶還可以提高植物對(duì)真菌病的抵抗力[19-20]。內(nèi)生菌分泌的纖維素酶和果膠酶在植物促生長(zhǎng)中的作用日益得到重視，如Borah等[20]從茶中分離到44株產(chǎn)纖維素酶和17株產(chǎn)果膠酶的內(nèi)生菌。本研究?jī)?nèi)生固氮菌中有纖維素酶活性的為4株，果膠酶活性的菌株有2株，這些內(nèi)生菌可以在蠶豆的生長(zhǎng)過程中分泌出這些降解酶，以有利于蠶豆細(xì)胞壁的生長(zhǎng)發(fā)育，還可以破壞病原真菌的細(xì)胞壁以防治真菌的病害。

綜上所述，本研究的SR23-1菌株擁有突出的溶解無(wú)機(jī)磷和鉀的能力；SL24-3菌株的固氮能力最高，還有分泌纖維素酶和果膠酶的能力，這說明這兩株菌(SR23-1和SL24-3)在促植物生長(zhǎng)能力方面有顯著優(yōu)勢(shì)，是潛在的高效農(nóng)業(yè)生產(chǎn)菌株。