小麥RCAR基因家族的鑒定、進化與逆境響應

史夢夢， 溫思鈺， 趙佳佳， 喬玲， 武棒棒， 鄭興衛(wèi),*， 鄭軍,*

(1. 山西大學生物工程學院，太原030006;2.山西農(nóng)業(yè)大學小麥研究所，山西 臨汾 041000)

脫落酸(abscisic acid，ABA)是調節(jié)植物生長發(fā)育的重要激素，參與植物的胚胎發(fā)生、種子發(fā)育、側根發(fā)生、葉片衰老和氣孔關閉等過程，是植物響應干旱脅迫的關鍵信號分子[1]，而ABA受體是ABA信號通路領域研究的核心。2009年，中國、美國、日本和歐洲的研究小組幾乎同時證實了RCAR(regulatory components of ABA receptor)家族是ABA的直接受體[2-3]，是ABA調控的核心元件。RCAR(也稱PLY)家族成員具有RCAR-like結構域，屬于結合疏水配體保守結構域SRPBCC(START/RHO-α-C/PITP/Bet-v1/CoxG/CalC)家族，通過深層疏水配體結合囊與ABA結合。逆境脅迫下ABA與RCAR結合后抑制下游蛋白磷酸酶(PP2C)的活性，從而恢復蛋白磷酸激酶活性，參與抵御逆境脅迫[4]。

擬南芥中RCAR家族共有14個成員，分別為RCAR1～RCAR14，除了AtRCAR7以外，可在植物體內激活ABA下游基因的表達[5-9]，提高植物抵御逆境脅迫的能力，不同成員間表達水平不同，功能上存在冗余。AtRCAR5過表達能顯著提高種子萌發(fā)、幼苗生長和氣孔開閉等過程中對ABA 的敏感性，還能提高抗旱能力[10-11]；AtRCAR1過表達誘導葉片提前衰老，使水分流向發(fā)育中組織，顯著提高擬南芥抗旱能力[12]；同時敲除AtRCAR1和AtRCAR3使側根生長靜止期延長，與僅敲除AtRCAR3相比，初生根和側根都對ABA的敏感性降低[13]?？梢钥闯觯琑CAR基因家族可顯著提高擬南芥的抗旱能力，且不同成員參與調控機制存在差異。

水稻中RCAR基因也參與逆境脅迫調控，多數(shù)研究主要集中在旱脅迫方面。Kim等[14-15]從水稻基因組中篩選出13個RCARs，其中OsRCAR5能提高種子萌發(fā)和幼苗階段對ABA的敏感性，增強成株期抗旱和抗鹽堿能力。OsRCAR3和OsRCAR9也參與水稻的非生物脅迫，過表達能夠提高水稻耐旱性和耐冷性[16]。此外，玉米中有13個RCARs，ZmRCAR3、ZmRCAR9、ZmRCAR10和ZmRCAR13的過表達均可提高ABA敏感性，增加脯氨酸積累，進一步證實RCARs在旱脅迫中具有重要作用[17-19]。小麥是重要的糧食作物，非生物脅迫是小麥減產(chǎn)的主要因素，而小麥是異源六倍體，抵御非生物脅迫的調控機制較為復雜[20]，隨著高質量基因組序列的公布，抗逆相關基因資源的挖掘亟待開展。本研究從小麥基因組中分離RCAR家族基因，分析了家族成員序列、表達以及進化特性，以期為闡明小麥RCAR基因家族在非生物脅迫中的調控機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源

擬南芥、水稻的RCARs基因和蛋白序列信息參考TAIR數(shù)據(jù)庫(https://www.arabidopsis.org/index.jsp)和國家水稻數(shù)據(jù)中心(http://www.ricedata.cn/gene/index.htm)，玉米和大麥的基因組數(shù)據(jù)參考JGI數(shù)據(jù)庫(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)，六倍體小麥基因組序列信息來源于IWGSC數(shù)據(jù)庫(http://www.wheatgenome.org/)。

1.2 小麥RCAR基因的鑒定

利用擬南芥和水稻RCAR基因序列對小麥全基因組進行本地Blast，設置E-value<1e-5，初步篩選出小麥RCAR家族候選基因。Pfam數(shù)據(jù)庫(http://pfam.xfam.org)和SMART數(shù)據(jù)庫(http://smart.embl-heidelberg.de/)驗證蛋白保守結構域。利用ExPASy ProtParam(https://web.expasy.org/protparam/)分析小麥RCAR蛋白的分子量、等電點和疏水性等理化性質，CELLO(http://cello.life.nctu.edu.tw/)進行亞細胞定位預測。

1.3 基因系統(tǒng)進化分析

利用MEGA6.0軟件的MUSCLE默認參數(shù)設置生成多序列比對，使用MEGA6.0軟件最大似然法(maximum likelihood，ML)，bootstrap number設為1 000次重復，構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.4 基因結構和蛋白質序列分析

GSDS2.0(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)分析TaRCARs基因結構，MEME Suite 4.12.0(http://meme-suite.org/index.html)搜索蛋白質序列保守基序，最大保守基序數(shù)目設為10，每一基序長度設為6～300個氨基酸殘基。

1.5 啟動子順式作用元件分析

截取起始密碼子上游3 000 bp的基因組序列作為啟動子區(qū)，利用PlantCARE(http://bioinformatics.pAet.ugent.be/webtools/plantcare/html)數(shù)據(jù)庫分析順式作用元件。

1.6 基因家族的表達模式分析

從expVIP數(shù)據(jù)庫檢索TaRCARs在14個組織器官中的表達數(shù)據(jù)，相關表達數(shù)據(jù)進行l(wèi)og2轉換處理，分析家族成員的表達模式。

1.7 基因進化和正選擇檢測

在構建進化樹的基礎上，通過PAML軟件利用樹枝模型法(branch model)分析系統(tǒng)發(fā)育樹中每個Group的進化速率，似然比測驗(LRTs)用于檢測無效模型和備擇模型；在檢測選擇位點時，利用BEB(bayes empirical bayes)方法計算每個位點在不同選擇模型的后驗概率。

1.8 基因表達檢測

挑選完整無損、大小均勻一致的“中國春”種子(本實驗室保存)，將露白種子種于育苗盤，在光溫培養(yǎng)箱中16 h光照/8 h黑暗，23 ℃條件下生長一周，進行脅迫(30%PEG和42 ℃)處理。處理0、6、12、24和48 h取根、莖和葉組織，液氮速凍，-80 ℃ 保存。RNA提取和cDNA的制備參考Zhao等[12]方法。不同組織樣品RNA提取后，采用SpectraMax QuickDrop 超微量分光光度計(Molecular Devicess, America)測定核酸濃度，取不同組織RNA等濃度混合反轉錄。Realtime-PCR按照TaKaRa SYBR PremixExTaq使用說明，在ABI7300 Realtime PCR儀(Thermo Fisher, America)上運行反應程序，甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因GAPDH(GenBank登錄號: EF592180.1)作為內參，2-ΔΔCT[21]計算目標基因的相對表達量。

2 結果與分析

2.1 TaRCAR基因家族信息

小麥基因組中共檢索到27個RCARs，除第5和6同源群外，其余同源群均有分布。在染色體上分布并不均勻，第1同源群中分布最多，為3個，第3和7同源群中均為2個，第2和4同源群中分布的數(shù)目均為1個，且部分同源群間無缺失，將RCAR基因命名為TaRCAR1-1AS～TaRCAR9-7DL(表1)。TaRCAR分子量為19 177.66～30 169.25 Da之間，等電點差異較大，介于4.97～9.17之間。亞細胞定位預測發(fā)現(xiàn)除了TaRCAR8定位于細胞質上和TaRCAR5-3BL定位于細胞核上外，其余TaRCARs均定位于葉綠體上。此外，TaRCAR1-1AS、TaRCAR4-2DS、TaRCAR5-3DS、TaRCAR7-4AS和TaRCAR9還定位于細胞核上，TaRCAR3-1AL、TaRCAR3-1BL、TaRCAR4-2AS、TaRCAR4-2BL和TaRCAR6-3DL還定位于線粒體上。TaRCAR6-3BL、TaRCAR7-4BL和TaRCAR7-4DL均是疏水蛋白，其余為親水蛋白。

2.2 TaRCAR蛋白的系統(tǒng)進化分析

選取擬南芥、水稻、玉米、大麥和小麥的RCAR蛋白構建系統(tǒng)發(fā)生樹，結合擬南芥和水稻基因分析發(fā)現(xiàn)，RCAR蛋白主要分為6個亞組(圖1)，分別為GroupA～F，HvRCAR與TaRCAR親緣關系最近, 其次為玉米、水稻和擬南芥。其中GroupD成員最多，為22個，含有9個TaRCARs；GroupA、GroupB和GroupF成員分別為14、10和21個，TaRCARs數(shù)目均有6個；GroupC和GroupE成員最少，是擬南芥特有分支，GroupC中AtRCAR8～10較為特殊，均以單體的形式存在，在沒有ABA的情況下能夠抑制PP2Cs[22-23]；GroupE分支中的AtRCAR7不依賴ABA就能抑制PP2C家族的成員PP2CA，但不能抑制成員ABI1、HAB1和AHG1[24]，推測擬南芥的這6個成員在進化的過程中發(fā)生了功能分化。GroupA和GroupB組中僅包含禾本科植物RCAR蛋白序列，暗示其可能分化于雙子葉植物分化之后。GroupD和GroupF組中同時包含擬南芥和禾本科植物RCAR蛋白，且有2組旁系同源AtRCAR，推測這類基因的分化在單、雙子葉植物分化之前以物種特有的方式進行擴張。

2.3 TaRCAR基因結構與蛋白質保守基序分析

27個TaRCARs大多沒有內含子，只有TaRCAR1(TaRCAR1-1AS、TaRCAR1-1BS、TaRCAR1-1DS)和TaRCAR8(TaRCAR8-7AL、TaRCAR8-7BL、TaRCAR8-7DL)中有2個內含子(圖2)。TaRCARs保守基序個數(shù)為4～6，其保守基序類型及排列順序基本一致，基序1、2、3和4的保守性最高，除TaRCAR3-1BL和TaRCAR6-3BL的基序3外，所有TaRCARs均具有基序1、2、3和4?；?、9和10的保守性相對較低，基序8只在TaRCAR7-4BL和TaRCAR7-4DL存在，基序9只在TaRCAR3中發(fā)現(xiàn)，基序10僅存在于TaRCAR1和TaRCAR5。

表1 小麥RCAR家族成員鑒定及蛋白質理化分析Table 1 Identification and protein physic-chemical analysis of the wheat RCAR gene family

注：At—擬南芥；Os—水稻；Zm—玉米；Hv—大麥；Ta—小麥。Note: At—A. thaliana; Os—O. sativa; Zm—Z. mays; Hv—H. vulgare; Ta—T. aestivum.圖1 不同物種RCAR蛋白進化樹分析Fig.1 Phylogenetic tree of RCAR proteins in different species

Motif 1: REVTVVSGLPATTSTERLEILDDERHVLSFRVVGGEHRLRNYRSVTTVHE (50 aa); Motif 2: HAPGAGQCTSAVVQRIAAPV AAVWSVVRRFDQPQAYKHFVRSCALVAGDG (50 aa); Motif 3: DGPPGTVVVESYVVDVPDGNTEEDTRMFVDTVVKCNLQSLARVAEK LAAA (50 aa); Motif 4: AEVPGEVARHH (11 aa); Motif 5: MPYPASRPSLQQHARIASGSG (21 aa); Motif 6: GGGLGGGGD RIWRPWDEAAVG (21 aa); Motif 7: MEAHMERALREGVTE (15 aa); Motif 8: MPCIPVSSPSIQHHNHNHHHRVLAGVG VGMGCGAEAVVAAAGTAGMRCRE (50 aa); Motif 9: GWKAAAHAASC (11 aa); Motif 9: SPPPPDEQ (8 aa).圖2 TaRCAR基因結構和蛋白質保守基序分析Fig.2 Gene structure and conserved motifs of TaRCAR

2.4 TaRCARs表達模式分析

分析TaRCARs在胚芽鞘、根、莖、葉、節(jié)間、旗葉、小穗、雄蕊、雌蕊、穎殼、外稃、芒、籽粒和胚乳組織表達數(shù)據(jù)并繪制熱圖(圖4)。TaRCARs存在兩種表達模式：其中TaRCAR1、TaRCAR2、TaRCAR4和TaRCAR7是組成型表達，TaRCAR3、TaRCAR5、TaRCAR6、TaRCAR8和TaRCAR9為組織特異性表達。TaRCAR1和TaRCAR2在葉、節(jié)間和旗葉中的表達量較高，籽粒發(fā)育中表達量較低；TaRCAR5和TaRCAR6只在根中表達，TaRCAR8僅在籽粒和胚乳中表達。此外，TaRCARs部分同源群間也存在差異，TaRCAR8-7AL和TaRCAR8-7DL在胚乳中表達，而TaRCAR8-7BL在胚乳中未檢測到；TaRCAR9中僅有TaRCAR9-7DL在雌蕊中有表達。TaRCARs表達模式不同，部分同源群間也發(fā)生了分化，暗示TaRCARs功能具有一定的多樣化，在不同生長發(fā)育過程中行使功能。

2.5 TaRCARs的進化速率分析

利用PAML軟件計算了每個亞組的進化速率，研究基因的進化機制是否存在差異。整體上看TaRCARs在進化過程中亞組間進化速率差異較大(表2)。GroupC、GroupD和GroupF進化速率較低，其ω值分別為0.162、0.179和0.000 01，亞組進化速率極小暗示組內成員功能相同或相近。GroupF中OsRCAR5(Os05g12260)是水稻中有功能的ABA受體，在種子萌發(fā)和幼苗生長時對ABA極為敏感，過表達可增強水稻的抗旱性和耐鹽性[14]，由此推測TaRCAR1和TaRCAR8在小麥響應干旱和鹽脅迫的過程中可能發(fā)揮重要作用。GroupA、GroupB和GroupE均出現(xiàn)了快速進化，ω值分別為0.349、0.321和1.280，GroupE是擬南芥特有分支，GroupA和GroupB是禾本科特有分支，進化速率較快。

表2 TaRCARs不同亞組的進化速率分析Table 2 Evolutionary rate analysis of TaRCARs

2.6 TaRCARs正選擇檢驗

為了適應新的環(huán)境，物種會選擇有利的突變保留并穩(wěn)定遺傳給后代。TaRCARs在GroupA進化速率(ωA=0.349)最快，使用branch-site model檢測GroupA是否存在正選擇位點(表3)。GroupA有3個位點的后驗概率P>0.99，說明相關位點經(jīng)歷了正選擇。GroupA中OsRCAR1(Os01g61210)的表達在干旱脅迫后顯著上調，而ABA處理后顯著下調[16]；AtRCAR10作為OsRCAR1同源基因，干旱脅迫后表達量降低，過表達能提高擬南芥在種子萌發(fā)、幼苗的生長時期對ABA的敏感[25]。因此，GroupA中TaRCARs出現(xiàn)正選擇，可能導致基因突變產(chǎn)生新的功能，或者喪失原來的功能。

2.7 TaRCARs干旱和熱脅迫下的表達模式

根據(jù)TaRCARs的編碼序列設計表達引物進行表達特性研究。除TaRCAR8外，成功檢測到其余8個成員的表達特性。在干旱脅迫下，TaRCARs具有不同的表達模式(圖5)，TaRCAR1、TaRCAR3、TaRCAR4、TaRCAR5和TaRCAR6在處理6 h達到最高，隨后逐漸降低，趨于正常。而TaRCAR2的表達量先下降，然后恢復到初始水平。TaRCAR7和TaRCAR9的表達幾乎不受影響。在熱脅迫下，TaRCAR1和TaRCAR2在處理6 h表達量最高，而TaRCAR3、TaRCAR6和TaRCAR9表達量明顯增加，而TaRCAR3、TaRCAR5、TaRCAR6和TaRCAR9在6 h基本無變化，12 h時表達量升高，達到最大，表明不同TaRCARs對熱脅迫響應的時間存在差異。TaRCAR7和TaRCAR4的熱處理后分別在6 h和12 h表現(xiàn)出下調趨勢，說明TaRCARs在響應干旱和熱脅迫的機制存在差異。

注:數(shù)字代表順式作用元件個數(shù)，數(shù)目越多，標注的顏色越深。Note: Numbers in the table represent the number of cis-acting elements, the greater the number, the darker the color of the label.圖3 TaRCARs順式作用元件和功能Fig.3 TaRCARs cis-acting elements and functions

表3 GroupA正選擇位點的檢測Table 3 Positive selection detection of GroupA

圖4 TaRCAR基因表達譜Fig.4 Expression profile of RCAR genes in wheat

注：t-test分析基因在不同脅迫時間下與對照的差異具有統(tǒng)計學意義(**: P<0.01；*: P<0.05)。Note: t-test for significant difference between CK and samples(**: P<0.01,*: P<0.05).圖5 小麥RCARs在干旱脅迫和熱脅迫條件下的表達Fig.5 Expression of RCARs under drought stress and heat stress in wheat

3 討論

TaRCARs在部分同源群間分布不均勻，在小麥第5和6同源群中沒有TaRCARs分布，而第1同源群則有9個TaRCARs，第3和7同源群有6個TaRCARs。禾谷類祖先種有5條古染色體，分別為A5、A7、A11、A8和A4，90 MYA (million years ago)時發(fā)生過一次全基因組復制事件，導致染色體加倍由5條變?yōu)?0條，增加了A1、A10、A12、A9和A6[26-28]；隨后兩條染色體發(fā)生斷裂和融合，從而產(chǎn)生兩條新的染色體，分別是由A10和A7組成的A3以及A4和A6組成的A2，導致過渡態(tài)的祖先染色體為12條；在50～70 MYA時Panicoideae亞科與另外兩個亞科分化，Ehrhartoideae亞科約在46 MYA與Pooideae亞科分化[29]。在小麥形成過程中還發(fā)生了一次染色體融合事件，其中A8和A6染色體發(fā)生斷裂重組，形成7號染色體的祖先。除第3、6同源群的祖先染色體未發(fā)生斷裂和重組外，其余同源群在進化過程中基本上都發(fā)生了重組和融合，這可能是導致TaRCARs在部分同源群間發(fā)生偏分布的原因。此外，RCARs參與小麥的適應性的進化，在多倍體化過程中拷貝數(shù)變異是重要的進化方式，有些TaRCARs可能發(fā)生了功能性的復制和刪除。

擬南芥和水稻中RCARs研究較為深入，可以為TaRCARs研究提供參考。物種間同一進化分支的基因互為同源基因或親緣較近，生物學功能相似。分析發(fā)現(xiàn)，擬南芥、水稻、玉米、大麥和小麥的RCAR蛋白進化分析可劃分為6個亞組，GroupD所在分支中包括4個AtRCARs、3個OsRCARs、3個HvRCARs、3個ZmRCARs和9個TaRCARs，其中AtRCAR14(AT2G26040)過表達能夠提高擬南芥種子的萌發(fā)、幼苗形態(tài)建立階段對ABA敏感度，從而增強抗旱性[30]；OsRCAR4作為AtRCAR14的同源基因過表達后明顯提高水稻的耐旱性[16]，推測TaRCAR2、TaRCAR5和TaRCAR9具有相同功能。GroupA所在分支的OsRCAR1在干旱和冷脅迫下顯著上調[31]，GroupA中的TaRCAR3和TaRCAR6在干旱和熱脅迫下表達顯著升高，暗示它們參與小麥抵御逆境脅迫。在漫長的進化過程中，結構相似的基因在種內或種間有時也發(fā)生功能分化。如CCT基因調控植物開花[32]，然而Yang等[33]發(fā)現(xiàn)在玉米中無轉座子插入ZmCCT為抗病等位基因，同時介導玉米對低氮和高鹽的抗性。GroupF分支中OsRCAR5正調控水稻幼苗對ABA的敏感度，可提高成株期抗鹽堿脅迫能力[14-15]，而OsRCAR3過表達卻能提高水稻的耐冷性[16]?？梢奟CARs在物種間雖具有較高的保守性，在進化過程中也會發(fā)生功能分化以適應環(huán)境變化。

正選擇是物種進化的動力，是物種適應環(huán)境的遺傳基礎。在微生物中，太古菌有一些基因的進化速率加快，而加速進化的基因使太古菌能更好的適應地球降溫，證實基因加速進化提高了物種適應環(huán)境的能力[34]。在植物中，黃瓜、楊樹、大豆和擬南芥的11S球蛋白在進化過程中受到的正選擇效應并不一致，在大豆中顯著高于其他物種，進一步研究證實大豆中11S球蛋白快速進化促進了大豆合成蛋白的能力[35]。TaRCARs在GroupA出現(xiàn)了快速進化的現(xiàn)象，且TaRCAR3和TaRCAR6受到正選擇，可能是小麥適應不同逆境脅迫，保留了較多的有利變異所致。小麥自北緯18～50°，從平原到高海拔地區(qū)均有種植，在擴大種植范圍的馴化過程中就要求小麥能夠抵御更多的逆境脅迫。RCAR基因是ABA信號通路中的重要調控因子，參與植物對逆境的抵御，相關成員必然受到選擇，而差異選擇為小麥適應性提供了遺傳基礎。因此，對TaRCARs進行更深入的研究，有助于解析小麥抗逆調控和馴化的分子機制。