Bacillus subtilis Czk1揮發(fā)性化合物對橡膠樹紅根病菌的抑制作用

梁艷瓊, 李銳, 吳偉懷, 習金根, 譚施北, 鄭金龍,黃興, 陸英, 賀春萍, 易克賢

(中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院環(huán)境與植物保護研究所， 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部熱帶作物有害生物綜合治理重點實驗室， 海南省熱帶農(nóng)業(yè)有害生物檢測監(jiān)控重點實驗室， 海口 571101)

根病是橡膠樹的一類重要病害，在我國植膠區(qū)普遍發(fā)生，也是限制我國橡膠單產(chǎn)提高的重要生物因子。其中由橡膠靈芝菌[Ganodermapseudoferreum(Wakef.)Over.et Steinm]引起的紅根病為害較大。該病主要為害根部，造成腐爛，輕病植株吸收功能下降，導致產(chǎn)量下降，病情重的植株則整株死亡，喪失產(chǎn)量[1]。目前，根病的防治措施甚少，主要依賴單一化學藥劑，然而大量使用化學藥劑可能會導致諸如病原體抗性、農(nóng)藥殘留和環(huán)境污染等問題[2-4]，因此，迫切需要開發(fā)橡膠根病生物防治劑。微生物拮抗劑已成為傳統(tǒng)農(nóng)藥的理想替代品，抗菌機理包括誘導植物抗病性和產(chǎn)生抗生素、水解酶和揮發(fā)性有機化合物(volatile organic compounds，VOCs)[5]。VOCs是一種低分子量化合物，易揮發(fā)和分散，被認為是防治病原菌的重要生物防治機制[6]。微生物產(chǎn)生的VOCs促進植物生長，誘導植物防御或作為抗菌劑抑制病原菌生長[7]。Zhang等[8]報道綠假單胞菌(Pseudomonaschlororaphissubsp. Aureofaciens)SPS-41產(chǎn)生的3-甲基-1-丁醇和苯乙醇和2-甲基-1-丁醇對甘薯塊根黑腐病有較強的抑制作用。Rajer等[5]研究表明，枯草芽孢桿菌(B.subtilis)FA26揮發(fā)性有機物(苯甲醛、壬醛、苯并噻唑和苯乙酮)對馬鈴薯細菌性環(huán)腐病菌(Clavibactermichiganensis)具有抗菌活性。馮福山等[9]發(fā)現(xiàn)，枯草芽胞桿菌Y13揮發(fā)性物質(zhì)壬醛、苯甲醛、3-甲基-4-苯基吡唑、苯丙噻唑對油茶主要病害病原菌有很好的抑制作用。陳奕鵬等[10]報道，頂孢霉屬(Acremoniumsp.)HND5揮發(fā)性物質(zhì)石竹烯和4-乙烯基-1,2-二甲氧基苯對尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)、膠胞炭疽菌(Colletotrichumgloeosporioides)和多主棒孢菌(Corynesporacassiicola)具良好的抑制作用。微生物產(chǎn)生的揮發(fā)活性物質(zhì)是開發(fā)生防產(chǎn)品的重要基礎，研究微生物揮發(fā)活性物質(zhì)抑菌作用，開發(fā)和利用其高效活性成分，可作為防治橡膠樹根病的替代生物藥劑?？莶菅挎邨U菌Czk1菌株由本實驗室分離自橡膠樹根部，其揮發(fā)性物質(zhì)對橡膠樹紅根病菌(Ganodermapseudoferreum)、褐根病菌(Phellinusnoxius)、紫根病菌(Helicobasidiumcompactum)、白根病菌(Rigidopruslignosus)、臭根病菌(Sphaerostilberepens)和炭疽病菌(C.gloeosporiodes)具有較好的抑制作用。利用頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術鑒定獲得33種VOCs[11]，但Czk1菌株揮發(fā)性物質(zhì)中具有抑菌活性的組分尚未明確。因此，本研究擬從33種VOCs篩選出具有高效抑菌活性的揮發(fā)性氣體組分，探討其對病原菌菌絲及細胞的影響，以期為新型農(nóng)藥靶標設計提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1培養(yǎng)基及供試病原菌 LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物 5 g，NaCl 5 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0～7.2。

PDA培養(yǎng)基：去皮馬鈴薯 200 g, 葡萄糖20 g，瓊脂15～20 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0。

PDB培養(yǎng)基：去皮馬鈴薯 200 g, 葡萄糖20 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0。

供試病原菌：橡膠樹紅根病菌Ganodermapseudoferreum(Wakef.)Over.et Steinm由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院環(huán)境與植物保護研究所分離、鑒定與保存。

1.1.2揮發(fā)性有機化合物 99.50%苯甲醛(benzaldehyde)(液體)、98.00% 2,6-二叔丁基對甲酚(butylated hydroxytoluene)(固體)和99.50%十二烷(dodecane)(液體)購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；97.00% 2-己基-1-癸醇 (2-hexyl-1-decanol)(液體)、98.00%3,5-二叔丁基-4-羥基苯甲醛(3,5-di-tert-butyl-4-hydroxy-benzaldehyde)(固體)、99.00%鄰苯二甲酸二異丁酯(dibutyl phthalate)(液體)、97.00% N-芐基-2-氯乙酰胺(固體)(N-benzyl-2-chloroacetamide)、98.00% 3′,5′-二甲氧基苯乙酮 (3′,5′-dimetho-xyacetophenone)(固體)、97.00% 4-(4-甲氧苯基)-2-丁酮 [4-(4-methoxyphenyl)-2-butanone] (固體)、99.00% 十四烷(tetradecane)(液體)和99.50%十三烷(tridecane)(液體)購自百靈威科技有限公司；99.00%甲烷(methane)(液體)購自Sigma-Aldrich(上海)貿(mào)易有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1揮發(fā)性化合物純品抑菌活性檢測 將供試病原菌于PDA平板上活化，備用。將3,5-二叔丁基-4-羥基苯甲醛固體純品化合物溶于DMSO，N-芐基-2-氯乙酰胺、3,5-二甲氧基苯乙酮、2,6-二叔丁基對甲酚和(4-甲氧苯基)-2-丁酮固體純品化合物溶于DMF，液體純品化合物稀釋濃度至5 000 mg·L-1。LB培養(yǎng)基和PDA培養(yǎng)基分別倒入二分隔培養(yǎng)皿兩側，將上述稀釋好的純品化合物分別加至LB培養(yǎng)基的二分隔培養(yǎng)皿中，病原菌接于含PDA培養(yǎng)基的二分隔培養(yǎng)皿中，以相應的DMSO或DMF為對照，檢測揮發(fā)性物質(zhì)純品是否具有抑制病原菌的能力。

1.2.2揮發(fā)性活性組分的毒力測定 挑選具有抑菌活性的揮發(fā)性物質(zhì)，測定其對病原真菌的抑制作用。將病原真菌接于二分隔培養(yǎng)皿一側，另一側涂布不同濃度梯度的供試揮發(fā)性物質(zhì)，用封口膜密封，于28 ℃恒溫培養(yǎng)。以無菌水為對照，當對照組菌絲長至2/3培養(yǎng)皿時，采用十字交叉法[12]測量菌落直徑，根據(jù)公式計算抑制率，每處理重復5次。以濃度對數(shù)為自變量 (x), 以抑制率幾率值為因變量 (y) 計算出各藥劑的毒力回歸方程、相關系數(shù) (r) 和EC50、EC75[13]。

1.2.3揮發(fā)性混合活性組分的抑菌活性檢測

將上述抑制作用較強的揮發(fā)性物質(zhì)按照 GC-MS 的測定結果(苯甲醛：3,5-二甲氧基苯乙酮：2,6-二叔丁基對甲酚=7∶8∶1)[11]人工合成混合揮發(fā)性物質(zhì)，在二分格培養(yǎng)皿一側接種病原菌，另一側接種不同濃度梯度(2.5、5、10、25、50和100 μg·mL-1)的混合性揮發(fā)物質(zhì)，以無菌水為對照，當對照組菌絲長至2/3培養(yǎng)皿時，同1.2.2方法計算抑制率及回歸方程、相關系數(shù) (r) 和EC50、EC75。

1.2.4橡膠靈芝菌生長形態(tài)觀察 用揮發(fā)性物質(zhì)混合活性組分處理橡膠靈芝菌，于普通顯微鏡鏡(尼康ni-e)和透射電鏡(日立ht7700)下觀察橡膠靈芝菌生長形態(tài)。將培養(yǎng)好的菌落樣品取5 mm×10 mm大小放入含有 2.5%戊二醛溶液中，放于4 ℃冰箱中過夜固定，再取出樣品用PBS緩沖液(磷酸氫二鈉和磷酸二氫鈉)每隔 10～15 min 沖洗一次，共沖洗 3～4 次；加入1%四氧化鋨緩沖固定液進行后固定，室溫或4 ℃固定3～4 h，然后分別用 30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%(體積分數(shù))的酒精進行梯度脫水處理 15 min，用無水環(huán)氧丙烷或丙酮置換酒精，重復2～3次，每次15 min，然后進行樹脂滲透。向純環(huán)氧樹脂中按1.5%～2%比例加入催化劑并混勻后注入包埋模具或膠囊中, 再將樣品按所需的方位擺放在包埋模具或膠囊的樹脂中，然后放入烘箱中聚合。制備好的樣品于透射電鏡觀察細胞形態(tài)。以溶解揮發(fā)性活性組分的溶劑(DMF)為對照。

1.2.5橡膠靈芝菌細胞通透性測定 實驗設4個處理，T1為揮發(fā)性混合活性組分+橡膠靈芝菌，T2為不加揮發(fā)性混合活性組分的病原菌，CK1為無菌水，CK2為溶解揮發(fā)性活性組分的溶劑(DMF)。在含有 100 mL PDB 培養(yǎng)基三角瓶中接種橡膠靈芝菌的新鮮菌絲塊，置于28 ℃、180 r·min-1條件下培養(yǎng)3 d，將濾出的菌絲在無菌水中充分洗滌后，轉入含100 mL無菌水的三角瓶中，加入揮發(fā)性混合活性組分迅速封口，使?jié)舛冗_到100 μg·mL-1，于相同條件下進行培養(yǎng)。于0、1、3、5、7、12、24、48 h測定其菌絲水懸液電導率[14]。

2 結果與分析

2.1 揮發(fā)性化合物純品抑菌活性分析

檢測12種揮發(fā)性化合物純品對橡膠靈芝菌的抑制作用，結果表明，苯甲醛、2-己基-1-癸醇、3,5-二叔丁基-4-羥基苯甲醛、鄰苯二甲酸二異丁酯、N-芐基-2-氯乙酰胺、3,5-二甲氧基苯乙酮、2,6-二叔丁基對甲酚、4-(4-甲氧苯基)-2-丁酮和甲烷對橡膠靈芝菌具有抑制作用，其中苯甲醛抑制效果最佳(圖1)，抑制率達到100%。十四烷、十二烷和十三烷抑制作用不明顯，抑制率分別為15.20%、23.00%、24.30%。

圖1 揮發(fā)性化合物對橡膠靈芝菌抑菌活性Fig.1 Antifungal activity of the VOCs against G. pseudoferreum

2.2 揮發(fā)性活性組分的毒力測定

9種揮發(fā)性物質(zhì)純品對橡膠靈芝菌生長的毒力見表1?？梢钥闯?，苯甲醛、3,5-二甲氧基苯乙酮、2,6-二叔丁基對甲酚對病菌具有顯著抑制作用，其EC50均小于45 μg·mL-1，分別為20.30、30.62、40.96 μg·mL-1，4-(4-甲氧苯基)-2-丁酮和3,5-二叔丁基-4-羥基苯甲醛具有較強抑制作用，其EC50小于350 μg·mL-1，分別為94.66、169.91、316.43、332.21 μg·mL-1。N-芐基-2-氯乙酰胺、甲烷抑制作用相對較弱，其EC50均大于500 μg·mL-1。苯甲醛、3,5-二甲氧基苯乙酮、2,6-二叔丁基對甲酚對橡膠靈芝菌EC75均小于200 μg·mL-1，2-己基-1-癸醇、4-(4-甲氧苯基)-2-丁酮EC75小于700 μg·mL-1，3,5-二叔丁基-4-羥基苯甲醛、N-芐基-2-氯乙酰胺、甲烷、鄰苯二甲酸二異丁酯、4-(4-甲氧苯基)-2-丁酮EC75均大于1 000 μg·mL-1。12種揮發(fā)物純品對病原菌的斜率值均不相同，斜率范圍在 0.40～1.98，其中苯甲醛、3,5-二叔丁基-4-羥基苯甲醛、鄰苯二甲酸二異丁酯、3,5-二甲氧基苯乙酮、2,6-二叔丁基對甲酚、4-(4-甲氧苯基)-2-丁酮、甲烷斜率值均小于1，病原菌對這些化合物純品敏感度低。綜上所述，苯甲醛、3,5-二甲氧基苯乙酮、2,6-二叔丁基對甲酚是Czk1揮發(fā)性物質(zhì)主要活性成分。

表1 不同揮發(fā)性化合物對橡膠靈芝菌菌絲生長的毒力Table 1 Toxicity of VOCs on G. pseudoferreum hyphae growth

2.3 VOCs混合活性組分的抑菌活性檢測

根據(jù)上述結果，將含量較多且抑菌效果較明顯的揮發(fā)性組分苯甲醛、3,5-二甲氧基苯乙酮、2,6-二叔丁基對甲酚按照GC-MS 的測定結果(苯甲醛：3,5-二甲氧基苯乙酮：2,6-二叔丁基對甲酚=7∶8∶1)人工合成混合揮發(fā)性物質(zhì)，測定該混合揮發(fā)性物質(zhì)對橡膠靈芝菌的抑制作用。結果表明，這三種混合揮發(fā)性物質(zhì)對橡膠靈芝菌具有較強的抑制作用，且抑制作用強弱隨著劑量增加而增強。當混合揮發(fā)性物質(zhì)濃度為2.5 μg·mL-1，其對橡膠靈芝菌抑制率為33.94%，當濃度為25 μg·mL-1，對病原菌抑制率增至67.07%，當濃度為100 μg·mL-1時，其抑制率為87.21%。隨著混合組分藥劑濃度增加，其菌落直徑隨之降低，差異具有統(tǒng)計學意義(表2)。Czk1產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)具良好的抑菌活性是由上述三種抑菌組分協(xié)同作用的結果。

表2 VOCs混合性組分對橡膠靈芝菌菌絲生長的毒力Table 2 Toxicity of mix VOCs on G. pseudoferreum hyphae growth

2.4 VOCs混合活性組分對橡膠靈芝菌生長的影響

2.4.1VOCs混合活性組分對橡膠靈芝菌菌絲形態(tài)的影響 挑取揮發(fā)性物質(zhì)處理組的病原菌邊緣菌絲在普通顯微鏡下觀察，混合組分處理的橡膠樹紅根病菌菌絲生長受到抑制，病菌菌絲皺縮成一團，對照組CK菌絲生長良好，未出現(xiàn)異常現(xiàn)象(圖2)。

圖2 混合活性組分對橡膠靈芝菌菌絲的影響Fig.5 Effect of the active volatile organic compounds on mycelia of G. pseudoferreum

2.4.2VOCs混合活性組分處理橡膠靈芝菌超微結構比較分析 未經(jīng)混合活性組分處理過的橡膠靈芝菌，細胞壁薄厚均勻結構完整，菌絲外圍包裹著連續(xù)的外層，內(nèi)部組織結構完好無損，細胞器清晰可見，細胞內(nèi)含物無外滲現(xiàn)象，發(fā)育正常。經(jīng)混合組分處理后，細胞壁變薄，部分膜結構不完整(圖3)。

圖3 橡膠靈芝菌的超微結構Fig.3 Ultrastructure of G. pseudoferreum

2.5 VOCs混合活性組分對橡膠靈芝菌細胞通透性的影響

揮發(fā)性混合活性組分對細胞結構的潛在影響見圖4，對照組電導率的變化趨勢較小，而處理組的電導率隨著時間延長而不斷變大。處理1(揮發(fā)性混合活性組分和橡膠靈芝菌)、處理2(不加揮發(fā)性混合活性組分的病原菌)兩個處理組之間電導率差異不顯著，與甲醇對照、清水對照處理差異顯著。處理1、處理2與甲醇對照、清水對照處理在各個不同時間點的測定值差異顯著，在12 h時，處理1導電率為40.87 ms·cm-1，處理2為36.25 ms·cm-1，顯著高于甲醇(21.36 ms·cm-1)和清水對照組(18.69 ms·cm-1)。甲醇對照組導電率范圍為8.8～20.15 ms·cm-1，清水對照為8.5～18.89 ms·cm-1。由此可知，揮發(fā)性混合活性組分對橡膠靈芝菌細胞通透性有影響。

圖4 混合活性組分對橡膠靈芝菌細胞膜通透性的變化Fig.4 Changes of the Active Volatile Organic Compounds on membrane permeability of G. pseudoferreum

3 討論

微生物代謝產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)的抑菌活性與其組分密切相關。其抑菌作用可能是一種或幾種物質(zhì)的單一行為，也可能多種物質(zhì)協(xié)同作用下的群體效應[10]。郝象瑢等[15]研究發(fā)現(xiàn)，解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens) LJ02菌株產(chǎn)生的VOCs 4-乙基苯酚、2-丙基環(huán)己酮對黑腐皮殼菌(Valsamali)具有較強的抑制作用。宮安東等[16]報道，吡咯伯克霍爾德菌(Burkholderiapyrrocinia)WY6-5揮發(fā)性物質(zhì)二甲基二硫可完全抑制黃曲霉(Aspergillusflavus)菌絲生長和孢子萌發(fā)。陳利軍等[17]研究發(fā)現(xiàn)，蒙塔涅梨孢假殼(ApiosporamontagneiSacc.)ZY-2的揮發(fā)性物質(zhì)苯乙醇對草莓灰霉病菌(Botrytiscinerea)、水稻胡麻斑病菌 (Bipolarisoryzaeshoemaker)、小麥赤霉病菌(Fusariumgraminearum)、白菜黑斑病菌(AlternariabrassicaeSacc.)和萵苣菌核病菌(Sclerotiniasclerotiorum)均有一定的抑制作用。上述研究結果表明,揮發(fā)性物質(zhì)單一組分對植物病原菌均具有抑制作用。本研究表明，苯甲醛、2-己基-1-癸醇、3,5-二叔丁基-4-羥基苯甲醛、鄰苯二甲酸二異丁酯、N-芐基-2-氯乙酰胺、3,5-二甲氧基苯乙酮、2,6-二叔丁基對甲酚、4-(4-甲氧苯基)-2-丁酮和甲烷對橡膠靈芝菌均具有一定的抑制能力，其中苯甲醛、3,5-二甲氧基苯乙酮、2,6-二叔丁基對甲酚效果較佳，且三者混合組分可抑制病原菌。Czk1產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)具良好的抑菌活性，是上述抑菌組分協(xié)同作用的結果。

Tahir等[18]研究表明，解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens) FZB42和萎縮芽胞桿菌(B.artrophaeus)LSSC22揮發(fā)性物質(zhì)(苯甲醛、1,2-苯并異噻唑-3-酮、1,3-丁二烯)對番茄青枯菌(Ralstoniasolanacearum)具有較強的抑制作用。Raza等[19]研究發(fā)現(xiàn),多粘芽孢桿菌(Paenibacilluspolymyxa)WR-2揮發(fā)性物質(zhì)苯并噻唑、苯甲醛、十一醛、十二醛、棕櫚醛、2-十三烷酮、苯酚對尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporumf. sp.niveum)具有較強的抑制能力。 本研究結果也表明，苯甲醛對橡膠靈芝菌抑制作用最強。芽孢桿菌產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)苯甲醛抑菌強、抗菌譜廣，具有巨大的開發(fā)潛力。

利用微生物代謝的揮發(fā)性物質(zhì)防治植物病害是一種新的防治措施。微生物具有生長周期短、繁殖快、適應性強、易改良等特點[20]。VOCs具有環(huán)境友好特性，如低分子量，這意味著它們可以在常溫和壓力下容易蒸發(fā)；在大氣和土壤中可長距離擴散，是可生物降解的，不會在植物表面留下有毒的殘留物等特性[21-22]。橡膠樹根病病菌主要依靠根系接觸傳染，也通過風雨和昆蟲傳播，當橡膠樹地上部出現(xiàn)明顯的病癥時，已侵染發(fā)病嚴重，因而該病害防治較難。Kai等[23]發(fā)現(xiàn)，細菌產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)對真菌病害、土傳病害具有較好的抑制作用。Chaurasia等[24]也報道了枯草芽孢桿菌揮發(fā)性物質(zhì)對病原菌菌絲和分生孢子具有較好的熏蒸作業(yè)。因此利用Czk1產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)作為橡膠樹根病的防治藥劑，可在土壤中長距離擴散，能更全方位地殺滅土壤中的病原菌，易降解，對環(huán)境生態(tài)友好，開發(fā)應用前景巨大。